1、丹参提取物中 6 种活性成分 UPLC 测定方法的建立及其提取方法比较研究刘 璇1， 毕肖林1， 2， 3， 狄留庆1， 2， 3*， 单进军1， 2， 3， 汪素娟1( 1. 南京中医药大学药学院 ， 江苏 南京 210046; 2. 江苏省中药高效给药系统工程技术研究中心 ， 江苏 南京 210029; 3. 南京市中药微丸产业化工程技术研究中心 ， 江苏 南京 210029)摘要 目的 : 建立超高效液相色谱 ( UPLC) 同时测定丹参不同提取物中丹参素钠 、丹酚酸 B、二氢丹参酮 I、丹参酮 I、隐丹参酮 、丹参酮 IIA含量的方法 ， 优选同时提取丹参不同极性成分的适宜方法 。方法
2、 : 采用 Waters AcquityUPLC 系统 ， Acquity UPLC BEH C18( 2. 1 mm 50 mm， 1. 7 m) ， 以乙腈 -0. 3%甲酸水为流动相 ， 流速 0. 3 mL/min 进行梯度洗脱 ， 柱温 40 ， 检测波长 280 nm 的色谱条件同时测定丹参醇水提取 、超临界萃取 ( SFE) 、微乳液提取物中6 种活性成分的含量 。结果 : 丹参提取物中 6 种不同极性活性成分在测定范围内具有良好的线性关系 ( r 0. 9998) ， 平均回收率在 95% 105%。3 种提取方法中 ， 醇水提取法兼顾丹参脂溶性成分和水溶性成分 ， 但较为繁琐
3、 ; 超临界萃取对丹参脂溶性药物提取效率最高 ， 但水溶性成分不宜 ; 微乳液提取法对丹参水溶性成分和脂溶性成分均具有较高的提取率 。结论 : UPLC 测定方法简便 、快速 、准确可靠 ， 可应用于丹参提取物中多种成分含量的同时测定 。微乳液提取方法能够较好地提取丹参中脂溶性和水溶性活性成分 。关键词 丹参 ; 提取方法 ; UPLC; 含量测定中图分类号 : R284. 1 文献标识码 : A 文章编号 : 1001-4454( 2013) 01-0070-03收稿日期 : 2012-09-20基金项目 : 江苏高校优势学科建设工程资助项目 ( ysxk-2010) ; 南京中医药大学中药
4、学一级学科开放课题资助 ( 2011ZYX3-007) ; 江苏省 “青蓝工程 ”科技创新团队支持计划 ( 2008) 30 号 作者简介 : 刘璇 ( 1987-) ， 男 ， 在读硕士研究生 ， 专业方向 : 药物新剂型新技术 。*通讯作者 : 狄留庆 ， E-mail: diliuqing928163. com。丹参为唇形科植物丹参 Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根和根茎1， 其中所含的水溶性酚酸类成分和脂溶性二萜酮类成分极性差别较大 ， 其含量测定方法大多分别采用 HPLC 测定 ， 提取方法也相应针对其极性不同分别采取适宜的提取方法 ， 但方法繁琐 ， 效率较
5、低 。基于 UPLC 具有快速 、分离效率高的特点 ， 微乳提取法具有较好的极性相容性 ， 本文建立了 UPLC 同时测定丹参中丹参素钠 、丹酚酸 B、二氢丹参酮 I、丹参酮 I、隐丹参酮 、丹参酮 IIA含量的色谱条件 ， 同时比较优选了同时提取丹参不同极性成分的提取方法 。1 仪器与材料1. 1 仪器 Acquity TM 超高效液相色谱系统 ( 美国Waters 公司 ) ， 包括在线真空脱气机 、高压二元梯度泵 、控温自动进样器 、柱温箱 、光敏二极管阵列检测器( PDA) ， Acquity UPLC BEH C18( 2. 1 mm 50 mm， 1. 7m) 色谱柱和 Empow
6、er 2 工作站软件 ; sartoriousBp211D 精密天平 ( 德国 sartorious 公司 ) ; AD-20500A超声波清洗器 ( 天津奥特赛恩斯仪器有限公司 ) ; 85-2型恒温磁力搅拌器 ( 巩义市予华仪器有限公司 ) 。1. 2 材料 丹参 ( 安徽井泉集团中药饮片有限公司 ， 批号 : 20120101) ， 经南京中医药大学吴德康教授鉴定为唇型科植物丹参 Salvia miltiorrhiza Bge. 的干燥根和根茎 。丹酚酸 B( 批号 : 111562-200302) 、丹参酮 I( 批号 : 0867-200104) 、隐丹参酮 ( 批号 : 852-9
7、903) 、丹参酮 IIA( 批号 : 110766-200619) 对照品均购自中国食品药品检定研究院 ， 供含量测定用 ; 丹参素钠 ( 批 号 : 20110726) 、二 氢 丹 参 酮 I ( 批 号 :20110432) 对照品购自南京泽朗医药科技有限公司 ，质量分数 98%。肉豆蔻酸异丙酯 ( IPM) ， 国药集团化学试剂有限公司 ; 聚氧乙烯氢化蓖麻油 ( CremophorRH40) ， 德国 BASF 公司 ; 二乙二醇单乙基醚 ( Tran-scutoL P) ， 法国 Gattefosse 公司 ; 乙腈 ( 色谱纯 ) ， 美国Tedia 公司 ; 重蒸去离子水 (
8、 实验室制备 ) ; 甲酸 ( 色谱纯 ) 、甲醇 ( 分析纯 ) ， 上海化学试剂有限公司 。2 方法和结果2. 1 溶液的制备2. 1. 1 混合对照品溶液的制备 : 精密称取对照品丹参素钠 、丹酚酸 B、二氢丹参酮 I、丹参酮 I、隐丹参酮 、丹参酮 IIA各适量 ， 以 70% 甲醇溶解超声并定容 ， 制成含丹参素钠 、丹酚酸 B、二氢丹参酮 I、丹参酮 I、隐丹参酮 、丹参酮 IIA的混合对照品溶液 ， 0. 22m 微孔滤膜滤过 ， 取续滤液备用 。2. 1. 2 供试品溶液的制备 : 精密吸取丹参提取液1 mL， 70%甲醇溶解 ， 超声并定容至 10 mL， 0. 22 m微孔
9、滤膜滤过 ， 取续滤液备用 。07 Journal of Chinese Medicinal Materials 第 36 卷第 1 期 2013 年 1 月2. 2 色谱条件和系统适应性试验 色谱柱 : acquityUPLC BEH C18柱 ( 50 mm 2. 1 mm， 1. 7 m) ; 流动相A( 乙腈 ) -B( 0. 3%甲酸水溶液 ) ， 梯度洗脱程序见表1; 单波长检测 : =280 nm; 柱温 : 40 ; 进样量 2 L。此色谱条件下 ， 6 种成分分离良好 。见图 1。图 1 对照品和丹参供试品 UPLC 图A. 对照品 B. 醇水提取液 C + D. 超临界萃取
10、提取液 +水提液 E. 微乳提取液 1. 丹参素 2. 丹酚酸 B 3. 二氢丹参酮 I 4. 丹参酮 I 5. 隐丹参酮 6. 丹参酮 IIA表 1 梯度洗脱程序时间 /min 流动相 A/% 流动相 B/% 流速 /( mL/min)0. 00 8 92 0. 31. 00 8 92 0. 31. 50 20 80 0. 34. 00 20 80 0. 35. 00 60 40 0. 39. 00 70 30 0. 310. 00 8 92 0. 312. 00 8 92 0. 32. 3 线性关系 将 “2. 1. 1”项下制备成的混合对照品溶液 ， 用 70%甲醇稀释为 7 个浓度的系
11、列混合对照品溶液 ， 在上述色谱条件下 ， 分别进样 2 L， 测量峰面积值 。以对照品峰面积平均值 Y 与对照品浓度 X( g/mL) 进行线性回归 ， 结果见表 2。表 2 各成分的线性回归方程成分 回归方程 r线性范围/( g/mL)丹参素钠Y1=4487. 5X1+1762 0. 9999 1. 40 89. 6丹酚酸 BY2=4637. 6X23576. 7 0. 9999 1. 66 106. 0二氢丹参酮 IY3=22012X3+832. 65 0. 9999 0. 72 46. 0丹参酮 IY4=23439X41075. 9 0. 9998 0. 93 59. 0隐丹参酮Y5=
12、15951X5+ 3819. 8 0. 9996 1. 35 86. 0丹参酮 AY6=20924X64360 0. 9998 0. 97 62. 22. 4 精密度试验 按 “2. 1. 1”项下方法制备对照品混合溶液 ， 连续进样 6 次 ， 每次 2 L， 测定各成分的面积 ， 分别计算丹参素钠 、丹酚酸 B、二氢丹参酮I、丹参酮 I、隐丹参酮 、丹参酮 IIA面积 ， RSD( n =6)分别为 0. 22%、0. 25%、1. 64%、1. 20%、0. 52%、0. 06%。2. 5 稳定性试验 取按 “2. 1. 2”项下方法制备的供试品溶液 ， 避光条件下分别于 0、1、2、4
13、、8、12 h 精密吸取 2 L 进样测定各成分峰面积 ， 计算 RSD， 结果丹参素钠 、丹酚酸 B、二氢丹参酮 I、丹参酮 I、隐丹参酮 、丹参酮 IIA的 RSD 分别为 0. 72%、1. 28%、1. 62%、1. 87%、0. 64%、0. 42%。2. 6 重复性试验 按 “2. 1. 2”项下方法制备供试品溶液 ， 3 种提取方法每种平行制备 3 份 ， 每份精密吸取 2 L， 测定各成分峰面积 ， 计算 RSD 值 ， 结果醇水法 、超临界萃取 + 水提 、微乳提取法丹参提取物中丹参素钠的 RSD 值分别是 1. 38%、1. 25%、2. 27%，丹酚酸 B 的 RSD 值
14、分别是 1. 36%、1. 25%、0. 45%，二氢丹参酮 I 的 RSD 值分别是 2. 89%、0. 82%、1. 88%， 丹参酮 I 的 RSD 值分别是 2. 55%、1. 24%、2. 26%， 隐丹参酮的 RSD 值分别是 1. 15%、2. 20%、1. 41%， 丹 参 酮 IIA的 RSD 值 分 别 是 2. 90%、17Journal of Chinese Medicinal Materials 第 36 卷第 1 期 2013 年 1 月1. 04%、2. 10%， 结果表明 3 种提取方法均具有较好重复性 。2. 6 加样回收率试验 精密吸取已知含量的供试品溶液
15、1 mL， 加入定量的对照品溶液定容至 10 mL，超声混匀 ， 精密吸取 2 L 进样 ， 按上述色谱条件测定 ， 分别计算回收率 。其平均回收率见表 3。表 3 6 种成分的加样回收率结果 ( n =6)成分加入量/g检出量/g回收率/%RSD/%丹参素钠 89. 6 87. 2 97. 32 1. 85丹酚酸 B 106. 0 103. 3 98. 77 1. 21二氢丹参酮 I 59. 0 59. 6 99. 32 2. 89丹参酮 I 46. 0 47. 2 98. 26 2. 79隐丹参酮 62. 2 61. 9 104. 34 2. 67丹参酮 A86. 0 86. 5 101.
16、 74 1. 132. 7 丹参不同提取方法样品的制备与测定2. 7. 1 丹参不同提取液的制备 : 醇水提取 : 10 倍量的 95%乙醇超声提取 1 h， 10 倍量的 50% 乙醇超声提取 1 h， 10 倍量的水液超声提取 1 h， 合并 3 次提取液 。超临界萃取2+ 水提 : 2 倍药材质量的 95% 乙醇作为夹带液 ， 在萃取压力 20 MPa， 萃取温度 45 的条件下超临界萃取 2 h， 药渣加 10 倍量的水液超声提取 1 h， 提取两次 ， 合并两次提取液 。微乳液提取 : 配制含肉豆蔻酸异丙酯 、聚乙二醇氢化蓖麻油 、二乙二醇单乙基醚含量为 10% 的微乳液 。10 倍
17、量的微乳液超声提取 1 h， 提取 3 次 ， 合并提取液 。2. 7. 2 丹参不同提取液中 6 种活性成分的测定 :按本文所述的色谱条件对上述不同提取方法制备的丹参提取液中丹参素钠 、丹酚酸 B、二氢丹参酮 I、丹参酮 I、隐丹参酮 、丹参酮 IIA含量进行测定 ， 结果见表 4。表 4 丹参样品中 6 种成分的含量测定 ( n =3)标示性成分醇水提取物含量/( mg/g)RSD/%超临界萃取+ 水提物含量/( mg/g)RSD/%微乳液提取物含量/( mg/g)RSD/%丹参素钠 0. 63 1. 38 0. 62 1. 25 1. 31 2. 27丹酚酸 B 50. 74 1. 36
18、 43. 60 1. 25 51. 84 0. 45二氢丹参酮 I 0. 25 2. 89 0. 24 0. 82 0. 13 1. 88丹参酮 I 0. 32 2. 55 0. 20 1. 24 0. 23 2. 26隐丹参酮 0. 61 1. 15 0. 71 2. 20 0. 59 1. 41丹参酮 IIA1. 47 2. 90 1. 69 1. 04 1. 16 2. 103 小结与讨论3. 1 本文建立 UPLC 同时测定丹参中 6 种不同极性活性成分含量的方法 ， 与 HPLC 比较 ， 分析时间短 、分离度好 、重复性好 、准确简便 。在应用同一色谱方法检测多个活性成分时 ， 检
19、测波长的设定 、溶剂和流动相的选择较为关键 ， 本实验中在检测波长的设定时先采用二极管阵列检测器 ， 在 190 360 nm波长下对对照品溶液进行全波长扫描 ， 并对相应吸收波长下的对照品色谱图进行分析 ， 结果在 260 290 nm 波长下丹参的 6 种活性成分均有较好吸收 ，考虑丹参酚酸类物质比丹参酮类物质响应值低 ， 取酚酸类的最大吸收波长附近的波长 280 nm 为检测波长 。在制备对照品和供试品时 ， 由于被检测物质极性差异较大 ， 溶剂选择了不同浓度的乙腈 -水和甲醇 -水进行试验 ， 最后选择 70% 甲醇作为稀释溶剂 ，在相关实验的基础上3选择了乙腈 -水 -甲酸的流动相
20、， 经等度和梯度试验比较 ， 最终确定本实验中的梯度洗脱程序 ， 所检测的 6 个成分色谱峰具有较好的分离度 ， 又缩短了分析时间 。3. 2 通过 UPLC 测定供试品中 6 种活性成分的含量 ， 以客观准确评价出 3 种常用丹参提取工艺的优劣之处 : 经典的醇水提取法 ， 酚酸类和丹参酮各类物质的提取效率较为均一 ， 但是有机溶剂含量最多 ， 在安全性和原料成本方面有不足之处 。超临界萃取 +水提法 ， 超临界萃取对于脂溶性的丹参酮类物质提取效率较高 ， 约为经典醇水法的 120%; 有机溶剂含量也少 ， 劣势在于水溶性的酚酸类物质提取效率为其他两种方法的 50% 80%。微乳液提取法作为
21、一种较为新颖的提取方法 ， 所提取的酚酸类物质尤其是丹参素为其他两种提取方法的 240%; 同时脂溶性的丹参酮类物质在加入较低含量 ( 10%) 自微乳时微乳提取法也可以达到经典醇水提取法的70% 80%。微乳液提取法是一种具有良好应用前景的中药提取技术和方法 。参 考 文 献 1 国家药典委员会 . 中华人民共和国药典 S . 一部 . 北京 : 中国医药科技出版社 ， 2010: 70-71. 2 李迎春 ， 曾健青 ， 刘莉玫 ， 等 . 丹参中 3 种丹参酮的超临界二氧化碳萃取及液相色谱分析 J . 色谱 ， 2002， 20( 1) : 40-42. 3 王静 ， 魏娜 ， 赵洪芝 ， 等 . HPLC， UPLC 测定芪参益气滴丸中 5 个丹参活性成分含量的比较研究 J . 药物分析杂志 ， 2011， 31( 9) : 1678-1682.27 Journal of Chinese Medicinal Materials 第 36 卷第 1 期 2013 年 1 月
