1、医学分子细胞生物学,细胞周期及其调控Cell Cycle & Cell Regulation,第一节 细胞周期各时项的动态变化,一、细胞周期概念 细胞周期（cell cycle）：是指细胞从上一次分裂结束开始生长，到下一次细胞分裂结束所经历的过程，又称细胞增殖周期。 细胞周期时间（TC） 细胞周期经历的时间。,细胞周期,间期,分裂期 （M期）,DNA合成前期（G1期, G1 gap1）,DNA合成期（S期, Synthsis phase）,DNA合成后期（G2期, G2 gap2）,前期,中期,后期,末期,细胞周期 中的细胞,细胞周期分为：G1期、S期、G2期和 M期 四个时期。,(Mitos
2、is,division）,细胞类型（增殖特性）周期性细胞： 始终保持旺盛的增殖活性。 G0期细胞： 一般不分裂，暂不增殖细胞。终端分化细胞 （无增殖能力细胞） 结构和功能高度特化。,周期性细胞,终端分化细胞,研究方法 ：流式细胞术 细胞同步化 生化方法等等,（一） G1期（DNA合成前期） G1早期： 细胞体积增大、生物合成、形成细胞器 触发蛋白、钙调蛋白增加。体积、表面积、核质比G1晚期：H1及多种蛋白的磷酸化，为DNA合成准备。信号分子调控 G0 G1晚S期 start point （DNA合成相关酶，细胞周期运行的蛋白）,（二）S期（DNA合成期） 1.DNA复制 多种酶的参与。 2.蛋
3、白质合成：（组蛋白、非组蛋白）组装核小体。 3. 中心粒的复制，并发生分离，发挥微管的组织作用。,（三）G2期（有丝分裂准备期） 1. 促有丝分裂因子(MPF)合成 2. 微管蛋白（tubulin)合成 3. 0.3%DNA复制 4 . 结构功能蛋白的合成G2期 check point： （1） 是否完成DNA复制 ？（2）是否有DNA错误复制？,有丝分裂的主要特征是：姊妹染色单体分离；核膜、核仁破裂重建。人为的划分为四个时期：前期、中期、后期、末期。,（四）M期 （有丝分裂期）,细胞有丝分裂过程,1.有丝分裂间期,核 膜,核 仁,染色质,中心粒,1.前期 染色质凝缩，分裂极确立与纺锤体开始形
4、成， 核仁解体，核膜消失。,前 期,星体微管：由中心体向外放射，末端结合有分子马达，负责两极的分离,动粒微管：由中心体发出，连接在染色体着丝点动粒上,着丝点上具有马达蛋白。,极体微管：由中心体发出，在纺锤体中部重叠，重叠部位结合有分子 马达，负责将两极推开。,-,-,+,+,+,+,+,纺锤体有三种微管结构：,染色体的运动,Two centrosomes, and their forming radial arrays of astral microtubules separating on the surface of an early prophase newt lung cell nuc
5、leus.,2.中期 染色体排列到在细胞的赤道面上。,赤道板,中 期,3.后期 姐妹染色体单体分离并移向细胞两极。,后 期,后期阶段染色体的分离由微管 去聚合假说解释：动粒微管不断解聚缩短,造成 的拉力将染色体拉向两极。,机理：微管正端插入动粒的外层,微管在此端去组装。 动粒中的ATP水解,提供能量, 驱动微管上的马达分子向极 部移动,拉动染色体向极移动。,4. 末期 从子染色体到达两极，至形成两个新细胞的时期。 两个出现：核膜出现、核仁出现 两个消失：染色体消失、纺锤丝消失,中间小体,从子染色体到达两极，至形成两个新细胞的时期。 主要标志是子核的形成和胞质分裂。,中间小体,动物细胞的胞质分裂
6、通过胞质收缩环的收缩实现，收缩环由大 量平行排列的肌动蛋白组成。 用细胞松弛素处理这一时期的细胞，会出现什么现象？,Dividing Muscle Myoblast (primative muscle cell),(SEM x8,000),第二节 细胞周期调控的动力因素,一、细胞周期调控蛋白 (cell cycle-regulating protein),CDK类蛋白激酶 催化亚单位细胞周期素（Cyclin) 调节亚单位CDK抑制因子（CKI） 抑制CDK激酶活性,M期促发 因子(MPF),MPF的发现：一种在G2期形成，能促进M期启动的调控因子，即促细胞成熟因子或促细胞分裂因子（MPF)。,
7、（一）细胞周期调控研究过程的重要事件：,CDK： (cyclin-dependent protein kinases）,（二）细胞周期调控蛋白的种类,1. CDK类蛋白激酶（cyclin-dependent kinase） ：CDK与细胞周期素结合才具有激酶的活性，故称细胞周期素依赖性蛋白激酶(cyclin-dependent kinase,CDK)作用：CDK可将特定蛋白磷酸化，促进细胞周期运行。在动物中已知7种CDK，CDK1-7。分为四类：G1、G1/S、S期CDK和M期CDK。,2.细胞周期素（cyclins)是一类随细胞周期的变化呈现周期性出现和消失的蛋白质。（A、B、C、D、E 等
8、几类，亚型，20多种）表达时间不同，执行功能多种多样。 特点：在细胞周期中呈周期性变化。 作用：能与CDK结合，激活CDK，间接调节细胞周期运行。,D E A B,已知30余种，在脊椎动物中为cyclinA1-2、B1-3 、C、 D1-3、E1-2、F、G、H等。 分为4类：G1型、G1/S型、S型、M型。G1 、 G1 /S 、G2期 ( Cyclin D、E 、A)M 期 (Cyclin B),不同类型CDK-Cyclin复合物,*包括D1-3，各亚型cyclin D在不同细胞中的表达量不同，但具有相同的功效。,3.细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子 （CDK inhibitor, CKI）
9、,CDKI是对CDK激酶起负性调控作用的蛋白质。 已发现多种CDKIINK4家族: p16、p15、p18、p19 CIP/KIP家族: P21、27、57 在G1期抑制多种CDK。,CKI对细胞周期起负调控作用，分为：Ink4: P16ink4a, P15ink4b, P18ink4c, P19ink4d。特异性抑制cdk4-cyclin D1, cdk6-cyclin D1。Kip：P21cip1、P27kip1、P57kip2，抑制大多数CDK的激酶活性。P21cip1还能与DNA聚合酶的辅助因子PCNA结合，直接抑制DNA的合成。,M期CDK的激活起始于分裂期cyclin的积累。 结合
10、M -cyclin的CDK1被Wee1（抑制因子）将Thr14和 Tyr15磷酸化而不具有活性，使CDK/cyclin不断积累。在M期，Wee1的活性下降，CDC25磷酸酶使CDK去磷 酸化，去除了CDK活化的障碍。CDK的激活需要Thr161的磷酸化，它是在CDK激酶 (CAK)的作用下完成的。,（三）M期CDK的激活,4. CDK1活性下降 出M期 细胞核重建、染色体解螺旋、启动收缩机制。,进出S期调控：M期末 G1 CDKs 活性0G1 ( 晚期) 增殖信号（激素、生长因子） G1 cyclin转录cyclinD+cdk4/cdk6 G1/S 转换 “Start”S 期 DNA合成启动，
11、 cyclin + CDK2 （SCDK）保证精确复制（pre RC）,复制前复合体(prereplicationcomplex，Pre-RC),CDK activating,活性位点,抑制位点,由于某些环境因素的作用细胞周期出现故障或差错，这些信号 可使细胞周期停留在某些点上，称为限制点。 4个主要检验点： G1/S限制点：DNA是否损伤？细胞外环境是否适宜？细胞体积是否足够大？在酵母中称start点，在哺乳动物中称R点(restriction point)。 S期限制点：DNA复制是否完成？ G2/M限制点：DNA是否损伤？细胞体积是否足够大？ 中-后期限制点：纺锤体组装限制点。,二、细胞
12、周期限制点（check point）,Four Checkpoints,（1）限制点在细胞周期调控中的作用 细胞周期有敏感点，确保细胞周期事件有序进行，检 测，修复。 Checkpoint：1. DNA损伤检查点2. DNA复制检查点3. 纺锤体组装检查点,三、细胞周期中的信号系统调控 温度、pH、营养、药物、感染、射线；细胞因 子、激素、生长因子（一）生长因子 是与细胞增殖有关的信号物质，已知多数能促进细胞增殖，又称有丝分裂原（mitogen）。 PDGF、EGF、IL、TGF、FGF NGF 等，对 G0细胞进入S期有调节 作用。,生长因子-受体信号传递与转换 转录因子/调控蛋白转录、基因
13、的表达 细胞增殖,作用方式：旁分泌,细胞外信号 EGF、PDGF等,具TPK活性的受体,Ras-GTP,细胞膜,二聚化,跨膜受体型TPK,信号通路：ras、cAMP、磷脂酰肌醇途径。 如通过ras途径，激活MAPK，MAPK进入细胞核 内，激活c-myc，myc作为转录因子促进cyclin D、 SCF、E2F等G1-S有关的基因表达，细胞进入G1期。,生长因子的作用方式,Ras蛋白： 介导的MAPK信号转导途径是具有酪氨酸激酶活性的大 多数生长因子及其受体传递信息的主要通路，是细胞 周期正常运行的信号指令系统之一、主要由Ras蛋白 Ras转换因子(如Raf1) 丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)
14、 等部分组成。与丝氨酸和苏氨酸残基的磷酸化有关。,（二）抑素（chalone)和细胞周期,具有严格的组织特异性和细胞周期阶段特异性。,是一种由细胞自身产生、分泌的，对细胞增殖起抑制作用的糖蛋白，与膜上的受体结合，引起信号转换及在胞内传递，影响细胞周期相关的蛋白的表达。,作用于G1期的抑素可阻止细胞进入S期，称S因子,作用于G2期的抑素可阻止细胞进入M期，称M因子,p53、P21及Gadd45在G1阻滞中的作用P53有多种下 游效应分子：如MDM2，P21WAFl，Gadd45， Bax,IGFBP3，Fas等。MDM2通过与P53蛋白氨基末端结合来阻止P53蛋白转录 激活，形成一个“负反馈环”
15、。 MDM2的正常功能是限制GI期阻滞的时间，使DNA损伤修 复后的细胞重新进入细胞周期。,Gadd45和P21WAFl是参与辐射所致细胞G1期阻滞的重要 分子。 P53P21wAF1通路是通过CDK周期蛋白活性抑制，Rb脱 磷酸化而发挥作用的。 Gadd（growth arrest and DNA damage）是一些生长抑 制和DNA损伤诱导的基因，Gadd45是其中一员，也是野 生型P53诱导G1期阻滞的一条通路。,参与的相关蛋白及其作用：,(1) p21WAF1/CIP1p21基因定位于第六号染色体短臂上(6p21.2），P21蛋白定位于细胞核中，属CKI分子（CDK抑制分子），能广泛
16、抑制各种周期蛋白CDK复合物。野生型P53蛋白作为转录因子可诱导p21WAF1/CIP1基因的表达，抑制CDK2和CDK4对pRB蛋白的磷酸化失活，进而导致G1、G1/S和S期延迟，使DNA损伤有时间得以修复。,（2）ATM基因 AT：毛细血管扩张性共济失调症; ATM基因是AT唯一致病基因； 对AT纯合子突变细胞的研究表明，这类突变细胞缺乏细胞周期检查点调控对辐射损伤的正常反应，缺乏辐射诱导P53蛋白增加、p21wAFl和Gadd45转录和翻译水平增强的动态变化，表明ATM很可能是DNA损伤反应途径中p53的上游分子。,ATM（ataxia telangiectasia-mutated ge
17、ne） 最早发现于毛细血管扩张性共济失调症患者，人类中大约有1%的人是ATM缺失的杂合子，表现出对电离辐射敏感和易患癌症。 ATM编码蛋白激酶，与损伤DNA结合，信号通路有两条: 激活Chk1（checkpoint kinase）, 使cdc25的Ser216磷酸化失去活性，抑制M-CDK的活性，中断细胞周期。 激活Chk2，使P53被磷酸化而激活，然后P53作为转录因子，导致P21的表达，P21抑制G1-S期CDK的活性，中断细胞周期。,(3) P16INK4aP16INK4a基因位于人类染色体9p21区，编码由148个氨基 酸组成的分子量为16kD蛋白质。 P16INK4a与周期蛋白 D1
18、竞争性结合G1期激酶CDK4CDK6，抑制其对pRB 的磷酸化作用，使游离的E2F-1与未磷酸化的PRB结 合，依赖于E2F-1转录的基因不能转录，P16INK4a间接抑 制包括DNA合成在内的多种生化反应，使细胞周期正 常运行。,（4）pRB pRB的去磷酸化在M及s期由蛋白磷酸酶1催化进行。 在周期蛋白CDK复合物与蛋白磷酸酶1的协同作用下， pRB的磷酸化去磷酸化之间的动态平衡有效控制着G1 限制点的“开启和关闭”，从而保证细胞周期的有序运行 及细胞的正常增殖。,生长因子与相应受体结合,通过信号传递促进cyclin基因表达；cyclin与相应的CDK结合为激酶复合物对pRb进行磷酸化；
19、磷酸化的pRb释放其结合并抑制的蛋白,主要是转录因子E2F以 及具激酶活性的CAB-1蛋白等；游离的E2F进入核内,与多种具 特殊序列的基因启动子区结合(如c-myc、b-myb、cdc2、二氢 叶酸还原酶、TK及E2F-1基因等),促进这些基因的表达；这些 基因的产物促进细胞通过G1/S调控点.CKI通过抑制cyclin-CDK 激酶活性,使pRb不能磷酸化,pRb仍与E2F结合,E2F则不能进入 核内发挥转录作用,使细胞停滞于G1期.,G1/S调控点以pRb为中心构成一个复杂网络的共同模式,细胞周期长短测定,脉冲标记DNA复制和细胞分裂指数观察测定法 流式细胞仪测定法(Flow Cytom
20、etry) 缩时摄像技术，可以得到准确的细胞周期时间及分 裂间期和分裂期的准确时间。,细胞周期同步化1,人工选择同步化（ 药物诱导法） 条件依赖性突变株在细胞周期同步化中的应用：将与细胞周期调控有关的条件依赖性突变株转移 到限定条件下培养，所有细胞便被同步化在细胞周期中某一特定时期。,人工选择同步化2 有丝分裂选择法：用于单层贴壁生长细胞。 优点：细胞未经任何药物处理，细胞同步化效率高。 缺点：是 分离的细胞数量少。 密度梯度离心法： 根据不同时期细胞在体积和重量上存在差别进行分离。优点：方法 简单省时，效率高，成本低。 缺点：对大多数种类的细胞并不适用。,药物诱导法（DNA合成阻断法） G1
21、/S-TdR双阻断法：将细胞群阻断于G1/S交界处。 优点：同步化效率高，适合所有体外培养细胞体系。 缺点：是诱导过程可造成细胞非均衡生长。 分裂中期阻断法 通过抑制微管聚合来抑制细胞分裂器的形成，将细胞阻断在细胞分裂中期。 优点：是操作简便，效率高。 缺点：是这些药物的毒性相对 较大。,第三节DNA受损阻止细胞周期的分子学说,一、DNA损伤的后果:,信号传导异常,长期效应,老化,肿瘤,疾病,DNA 修复机制,短期效应,异常增生和代谢,生理功能紊乱,细胞死亡,细胞增殖减少,基因表达异常,基因组不稳定,哺乳类动物的细胞周期检查点控制机制,二 、细胞衰老的理论（一）基因转录或翻译差错、代谢废物积累
22、； （二） ROS引发脂质、蛋白质和核酸分子氧化性损伤；（三）端 粒 钟 学 说（telomere clock theory) （四）衰老基因与抗衰老基因1.衰老基因 人类：载脂蛋白E4基因、淀粉样蛋白基因p16, p53 p21 RB基因2. 抗衰老基因WRN bcl-2,CDK22，cyclinA、B 和 c-fos表达下降,不能是Rb磷酸化,E2F与Rb结合，从而不能发挥转录作用,细胞不能进入S期,细胞进入S期,生长因子,（二）细胞衰老的生化变化 DNA复制、转录、修复能力 端粒长度 DNA甲基化DNA / chromosome 损伤 2. mRNA与核糖体结合能力 蛋白质合成能力 3.
23、蛋白质分子损伤，功能 酶活性,第四节细胞周期与疾病,一、癌与细胞周期 癌基因(oncogene) : 能促使细胞无限增殖、癌变的DNA序列。分若干基因家族（已发现近百种癌基因） 抑癌基因（suppression-oncogene)：存在于正常细胞中、能抑制细胞恶性增殖的基因。,1细胞周期驱动机制失控Cyclins的过表达（Overexpression of cyclins） 肿瘤的发生与cyclin（D、E）过量表达有关。 Cyclin D1（Bcl-1）过表达原因（原癌基因）乳腺癌、胃癌、食道癌存在Cyclin D1基因扩增过度。,基因突变:Cyclin D1 T286突变 Cyclin D
24、1泛素化受阻 Cyclin D1,染色体倒位（Chromosome inversion） Cyclin D1基因倒位于甲状旁腺启动子控制，Cyclin D1蛋白合成 染色体易位（Chromosome translocation) 甲状旁腺腺癌 Bcl-1 t(11:14) (q13:q32)易位Cyclin D1受Ig重链基因增强子影响 Cyclin D1表达, CDK 表达异常 主要见于CDK4、CDK6过表达。 CDK4+ cyclin D结合 CDK4/cyclin D CDKs表达 pRb pRb磷酸化 细胞增殖过度E2F G1/S过渡加速,【Cyclin D过表达致肿瘤机制】Cycl
25、in D过表达 + 生长因子CDKs瀑布效应 细胞增殖过度 易发生细胞癌变,可能, CDI表达不足和突变肿瘤细胞中常出现CDI（肿瘤抑制基因）表达不足或突变。 p16 InK4基因失活原因 突变或缺失、染色体易位、p16 InK4高度甲基化。,Mechanism p16 InK4基因表达 CDK4与cyclin D结合细胞周期处在“易于”被启动状态 易发生细胞癌变,G1/S交界处失察 P53 进入S期DNA损伤 修复成功G1/S检查 停顿G1期 损伤DNA修复修复失败细胞凋亡 下调bcl-2表达、激活bax 基因 P53,表2 人类肿瘤p53基因突变热点和频率肿瘤型 突变频率（%） 突变热点
26、肿瘤型 突变频率（%） 突变热点 肺癌 56 157，248，273 前列腺癌 30 不确定 结肠癌 50 175，245，248，273 肝细胞癌 45 249 食道癌 45 不确定 胶质癌 25 175、248 卵巢癌 44 273 乳腺癌 22 175、248、273 胰腺癌 44 273 子宫内膜癌 22 248 皮肤癌 44 248、278 甲状腺癌 13 248、273 胃癌 41 不确定 白血病 12 175、248 头颈鳞癌 37 248 宫颈癌 7 273 膀胱癌 34 280 软组织肉瘤 31 不确定,DNA病毒: SV40、HPV、腺病毒等 P53蛋白失活,GOOD BYE,
