1、第七章 放射免疫分析第一节 放射免疫技术一、优点灵敏度高、特异性强、重复性好、样品及试剂用量少、操作简便且易于标准化等优点。用于各种微量蛋白质、激素、小分子药物和肿瘤标志物的定量分析。二、基本类型及原理（一）放射免疫分析（RIA）是以放射性核素标记的抗原与反应系统中未标记抗原竞争结合特异性抗体为基本原理来测定待检样品中抗原量的一种分析法。（二）免疫放射分析（IRMA）是用放射性核素标记的过量抗体与待测抗原直接结合，采用固相免疫吸附载体分离结合与游离标记抗体的非竞争放射免疫分析法。三、常用的放射性核素125I、 131I、 3H、 14C 等，使用最广泛的是 125I。四、放射性标记物制备及鉴定
2、（一）原理：以放射性碘原子通过取代反应置换被标记物分子中酪氨酸或酪胺残基以及组胺残基上的氢原子。因此，凡蛋白质、肽类等化合物在结构中含有上述基团者，均可用 125直接标记，而对那些不含上述基团的甾体激素或药物分子，则必须在分子结构上连接相应基团才能用于放射性碘标记。（二）标记及类型1.直接标记法：肽类、蛋白质和酶的碘化标记，其特点是标记方法操作简便，易得到比放射性较高的标记物。常用方法为：氯胺 T(ch-T)法；乳过氧化物酶标记法。2.间接标记法：也称联接标记法，是最常用的间接碘标记方法。该法主要用于甾体类化合物、环核苷酸、前列腺素等缺乏碘标记基团的小分子化合物的标记。（三）标记物的纯化： 1
3、25标记物反应后，标记物需进行分离纯化以去除游离 125和其他杂质。纯化标记物的方法有利用分子筛机制的凝胶过滤法、利用游离 125与标记物分子极性差异进行吸附解离的离子交换层析法、按分子所带电荷和直径不同在电场作用下分子迁移速率不同进行分离纯化的聚丙烯酰胺凝胶电泳法（PAGE）以及高效液相色谱法。（四）标记物的鉴定1.放射化学纯度：是指单位标记物中结合于被标记物上的放射性占总放射性的百分率，一般要求大于95%。该项参数还是观察在贮存期内标记物脱碘程度的重要指标。2.免疫活性3.比放射性五、方法学评价为增强结果的可比性，需对 RIA 方法学进行评价。除常规的灵敏度、精密度、准确性、特异性和稳定性
4、等指标外，还应注意以下指标：（一）可靠性：又称健全性，是评价被测物与标准品的免疫活性是否相同的指标。借助标准曲线与样品稀释曲线的平行性分析来判断方法的可靠性。平行性好者可靠。（二）剂量-反应曲线：标记免疫实验是通过已知浓度的标准品和相应的反应参数绘制成剂量-反应曲线，待测物定量是通过计算其反应参数在剂量-反应曲线上对应的标准品浓度值而确定。（三）高剂量钩状效应：高剂量钩状效应(HOOK 效应)是指当标本中被测物浓度超过线性范围上限时，所得结果反而降低或呈阴性的现象。第二节 放射免疫分析放射免疫分析（RIA）是以放射性核素作示踪剂的标记免疫分析方法，它具有高度灵敏性、特异性和精确性等特点，特别适
5、用于激素、多肽等含量微少物质的超微量分析。一、基本原理经典 RIA 是采用标记抗原和非标记抗原竞争性结合有限量特异性抗体的反应。二、实验方法及测定（一）抗原抗体反应：将未标记抗原（标准品和待测样品）、标记抗原和特异性抗体加入反应试管中，在一定条件（温度、时间及介质 pH）下进行竞争抑制反应。（二）分离结合与游离标记物：RIA 反应平衡后，标记抗原与试剂抗体形成免疫复合物（B）。由于其含量极少，不能自行沉淀，因此需加入适当的沉淀剂才能将其彻底沉淀，然后经离心使其与游离的标记抗原（F）分离。某些小分子抗原，也可采用吸附法分离 B 与 F。理想的分离方法应分离彻底、迅速；分离试剂和过程不影响反应平衡
6、，而且效果不受反应介质因素的影响；操作应简单、重复性好以及经济。目前 RIA 常用的分离方法有以下几种：1.第二抗体沉淀法：其原理是用 RIA 反应中的试剂抗体(一抗)如豚鼠的 IgG 免疫另一种动物(如羊），制得羊抗豚鼠 IgG 血清(二抗）。RIA 反应结束时，加入二抗，使其形成抗原、一抗-二抗的双抗体复合物；但因一抗含量甚微，此复合物也少,不易离心分离，一般还需加入一定量的与一抗同种动物的血清或 IgG，使其与二抗形成较大量的可见沉淀物，与双抗体复合物共沉淀；离心后，即可有效地分离 B 和 F。也可将二抗与某些颗粒固相物连接，制成固相二抗，分离 B、F 效果也好。2.聚乙二醇（PEG）沉
7、淀法：PEG 能非特异地沉淀抗原抗体复合物等大分子蛋白质，而不沉淀小分子抗原，因此 PEG 被广泛用于 RIA 实验作沉淀剂。其优点是沉淀完全、经济方便，但非特异性沉淀较多，且当温度髙于 30时，沉淀物易复溶。3.PR 试剂法 先将二抗与 PEG 按一定比例混合成悬液后进行试验。此法保留了二者的优点，节省了二者的用量，且分离迅速，简便。 先将二抗与 PEG 按一定比例混合成悬液后进行试验。此法保留了二者的优点，节省了二者的用量，且分离迅速，简便。4.活性炭吸附法：活性炭可吸附小分子游离抗原或半抗原，而大分子蛋白（如抗体和免疫复合物)则留在溶液中。抗原抗体反应后，加入活性炭颗粒，使游离的标记抗原
8、(F)吸附到颗粒上，再离心使颗粒沉淀，上清液中含有的标记抗原抗体复合物(B)供测定。该法主要用于测定小分子抗原或药物的 RIA。（三）放射性测量及数据处理分离 B、F 后，既可对标记抗原抗体复合物（B）进行放射性测量，也可根据 RIA 实验方法及目的，测定游离标记抗原（F）。绘制标准曲线（剂量-反应曲线），样品管以其测量或计算的反应参数，通过标准曲线即可查出相应的待检抗原浓度。第三节 免疫放射分析免疫放射分析（IRMA）是以过量 125I 标记抗体与待测抗原进行非竞争性免疫结合反应，用固相免疫吸附剂对 B 或 F 进行分离，其灵敏度和可测范围均优于 RIA，操作程序较 RIA 简单。一、基本原
9、理（一）单位点 IRMA：先利用过量标记抗体与待测抗原进行反应，形成抗原-抗体复合物，反应平衡后，再用固相抗原结合反应液中剩余的未结合标记抗体并将其分离，测定上清液的放射量。（二）双位点 IRMA：先用固相抗体与抗原反应结合，然后再用过量的标记抗体与已结合于固相的抗原的另一抗原决定簇结合，形成固相抗体-抗原-标记抗体复合物，洗弃反应液中剩余的标记抗体，测定固相上的放射性。两种 IRMA 最后测得的放射性均与样品中待测抗原的含量呈正相关。二、IRMA 与 RIA 的比较RIA IRMA标记物 标记抗原 标记抗体反应速率 抗体过量，反应速率稍快反应原理竞争抑制性结合，反应参数与待检抗原量成反比非竞
10、争性结合，反应参数与待检抗原浓度呈正相关特异性 双抗体，反应不易受交叉反应物干扰，特异性较高灵敏度 抗原与限量抗体的结合不充分，灵敏度低 微量抗原可与抗体充分结合，灵敏度高检测范围 检测含量较高抗原标本时，结果较好标准曲线 工作范围宽 12 个数量级抗体特点 抗体亲和力及特异性高，用量少 抗体亲和力低，用量多用途 测定大分子和小分子抗原 测定至少有两个抗原决定簇的抗原第四节 放射免疫分析技术的应用常用于各种激素、微量蛋白质、肿瘤标志物和药物等微量物质的测定。但具有放射污染和危害，常用放射性核素半衰期短，试剂盒有效期不长，无法自动化分析等诸多不足。【习题】下列有关放射免疫分析的叙述中，错误的是A
11、.以放射性核素作为标记物B.是一种定量检测技术C.主要用于抗原检测D.形成的免疫复合物中的放射强度与待测抗原含量成正比E.定量分析时需同时作标准管正确答案D答案解析RIA 为竞争抑制性结合，反应参数与待检抗原量成反比，IRMA 为非竞争性结合，反应参数与待检抗原浓度呈正相关。在放射免疫分析检测中，B/（B+F）表示（注：B 为结合态的标记抗原，F 为游离态的标记抗原）A.结合态的标记抗原与总的标记抗原之比B.结合态的标记抗原与游离的标记抗原之比C.总标记抗原与抗原抗体复合物之比D.结合态的抗原与总抗体之比E.结合态的抗原与总抗原之比正确答案A答案解析在放射免疫分析检测中，B/（B+F）表示：结
12、合态的标记抗原与总的标记抗原之比。在 RIA 反应系统中，参与反应的有标记抗原、已知抗体和待测抗原，对这三种成分的要求是A.只需固定标记抗原量B.待测抗原要先标记C.标记抗原和已知抗体的量都是固定量的D.只需要固定已知抗体的量E.三者的量均需固定正确答案C答案解析在 RIA 反应系统中，参与反应的有标记抗原、已知抗体和待测抗原，对这三种成分的要求是：标记抗原和已知抗体的量都是固定量的。临床上通常不利于放射免疫分析技术检测的是A.微量蛋白质B.激素C.小分子药物D.肿瘤标记物E.免疫球蛋白正确答案E答案解析免疫球蛋白不利于放射免疫分析技术检测的是。用于各种微量蛋白质、激素、小分子药物和肿瘤标志物的定量分析。临床上放射免疫分析最常用的放射性核素是A. 125IB. 131IC. 3HD. 14CE. 51Gr正确答案A答案解析临床上放射免疫分析最常用的放射性核素是 125I。用 RIA 检测某种激素时，结合物中的放射性强度越大，表明A.该激素在血清中的含量越高B.该激素在血清中的含量越低C.游离的标记激素的浓度越高D.与激素结合的特异性抗体浓度越高E.结合的标记激素越少正确答案B答案解析用 RIA 检测某种激素时，结合物中的放射性强度越大，表明该激素在血清中的含量越低。
