1、第十二章 固相膜免疫测定第一节 概述固相膜免疫测定以微孔膜作为固相。固相膜的特点在于其多孔性、非共价键高度吸附抗体或抗原和易于漂洗等，固相膜像滤纸一样，可被液体穿过流出，液体也可以通过毛细管作用在膜上向前移行。标记物可用酶或各种有色微粒子，如彩色胶乳、胶体金或胶体硒等。一、常用的固相膜 固相膜免疫测定中常用的膜为硝酸纤维素（NC）膜以及玻璃纤维素（fiberglass）膜、尼龙（nylon）膜、聚偏氟乙烯（PVDF）膜等。二、固相膜的技术要求1.孔径：用于穿流法的膜一般选择 0.4m 左右，用于横流法的膜可选择 510m。2.流速：以 ml/（cm 2min）表示。孔径大，流速快。3.蛋白质结
2、合力：吸附力很强，以 g/cm 2表示。4.均一性：优质的膜应具有良好的均一性，这样才能保证试剂批内的均一性。第二节 免疫金标记技术利用了金颗粒具有高电子密度的特性，在金标蛋白结合处，在显微镜下可见黑褐色颗粒，当这些标志物在相应的配体处大量聚集时，肉眼可见红色或粉红色斑点，因而用于定性或半定量的快速免疫检测。这一反应也可以通过银颗粒的沉积被放大，称之为免疫金银染色（IGSS）。一、胶体金的制备 （一）制备原理：一般采用还原法，常用的还原剂有枸橼酸钠、鞣酸、维生素 C、白磷、硼氢化钠等。向一定浓度的金溶液内加入一定量的还原剂，使金离子还原成金原子,形成金颗粒悬液，也称金溶胶。（二）技术要点：金溶
3、胶的光散射性与溶胶颗粒的大小密切相关，一旦颗粒大小发生变化，光散射也随之发生变异，产生肉眼可见的显著的颜色变化，这就是金溶胶用于免疫沉淀或免疫凝集试验的基础。（三）注意事项1.玻璃容器的清洁：玻璃表面污染会干扰胶体金颗粒的生成，用前经过强酸洗，后硅化。 2.试剂、水质和环境：氯金酸极易吸潮，对金属有强烈的腐蚀性，不能使用金属药匙，避免接触天平称盘。其 1%水溶液在 4可稳定数月不变，实验用水一般用双蒸馏水，实验室中的尘粒要尽量减少，否则实验的结果将缺乏重复性。二、免疫金制备（一）制备原理：免疫金是指胶体金与抗原或抗体等大分子物质的结合物，在免疫组织化学技术中，习惯上称之为金探针。蛋白质被吸附到
4、胶体金颗粒表面而结合的过程。（二）技术要点1.胶体金溶液的 pH：原则上可选择待标记蛋白质等电点，也可略为偏碱。2.蛋白质最适标记量（三）注意事项多种蛋白质、葡聚糖、PEG2000、明胶等均为良好的高分子稳定剂，PEG 和 BSA 是最常用的稳定剂。稳定剂有两大作用：为保护胶体金的稳定性，使之便于长期保存；为防止或减少免疫金复合物的非特异性吸附反应。第三节 膜载体免疫测定的种类与原理一、斑点免疫渗滤试验（IFA）用于检测各种传染病的抗体和肿瘤标记物等，以及用于检测尿液 HCG 的“金标”早孕诊断试剂。（一）原理：将抗原或抗体点加在固相载体硝酸纤维素薄膜上，将膜贴于吸水材料上，依次在膜上滴加标本
5、、免疫胶体金及洗涤液等试剂进行抗体或抗原反应，过量试剂很快渗入吸水材料中。抗原抗体反应后，形成大分子胶体金复合物，从而使阳性结果在膜上呈现红色斑点。液体通过微孔滤膜时，渗滤液中的抗原或抗体与膜上的抗体或抗原相接触，起到亲和层析的浓缩，达到快速检测的目的，同时洗涤液的渗入在短时间内即可达到彻底洗涤的目的，简化了操作步骤。（二）方法类型1.双抗体夹心法测抗原：用抗体结合在微孔滤膜中央，滴加待检标本，抗原抗体反应后，滴加金标抗体，加洗涤液洗涤后，阳性者即在膜中央呈红色斑点。2.间接法测特异性抗体：用抗原包被在微孔滤膜上，滴加待测标本，滴加洗涤液洗涤后，滴加金标抗抗体，加洗涤液洗涤后，阳性者即在膜中央
6、呈红色斑点。该法由于血清标本中非目的 IgG 的干扰，易导致假阳性结果。（三）实验材料1.滴金反应板，为胶体金免疫渗滤试验中的主要试剂成分之一，由塑料小盒、吸水垫料和点加了抗原或抗体的醋酸纤维素膜片三部分组成；2.胶体金标志物；3.洗涤液；4.抗原参照品或抗体阳性对照品。（四）技术要点 本方法实验操作非常简单，其操作要点为：1.将反应板平放于实验台面上，于小孔内滴加含待测抗原的标本 12 滴，待完全渗入，与膜上的抗体反应而结合在膜上。2.于小孔内滴加胶体金标记抗体试剂 12 滴，待完全渗入，使胶体金标记抗体与结合在膜上的抗原反应。3.于小孔内滴加洗涤液 23 滴，待完全渗入，洗去未结合的胶体金
7、标记抗体。4.结果观察 在膜中央有清晰的淡红色或红色斑点者判为阳性反应，反之则为阴性反应。斑点呈色的深浅相应地提示阳性强度。二、斑点免疫层析试验（一）原理：免疫层析试验的原理与免疫渗滤相同，不同点在于液体的移动不是通过直向的穿流，而是基于层析作用的横流。在一塑料片条上依次粘贴如下组分：吸水纸；玻璃纤维膜，膜上固定着干燥的金标抗体；硝酸纤维素膜，膜上包被着线条状的抗体；吸水纸。（二）方法类型：多用于检测抗原，但亦可用于检测抗体。常见方法类型有：1.双抗体夹心法测抗原2.竞争法测小分子抗原3.间接法测抗体：为了消除待测血清标本中大量的非特异性 IgG 与特异性 IgG 竞争结合金标记抗人IgG，降
8、低了试验敏感性，胶体金间接免疫层析法测抗体常设计成反流免疫层析法。（三）技术要点1.在 520 分钟内观察结果。2.结果判断：阴性为出现 1 条棕红线质控条带；阳性为出现 2 条棕红线条带；无棕红线条带出现为试剂失效。（四）临床应用该技术不能准确定量，只能作为定性或半定量试验。目前主要应用于正常体液中不存在的物质（如传染病抗原和抗体以及毒品类药物等）和正常含量极低而在特殊情况下异常升高的物质（如 HCG 等）的检测。三、斑点酶免疫吸附试验加少量抗原于硝酸纤维素（NC）膜上，干燥后进行封闭；然后滴加样品血清；洗涤后再滴加酶标二抗，最后滴加能形成不溶有色物的底物溶液（如 HRP 标志物，常用二氨基
9、联苯胺）；阳性者即可在膜上出现肉眼可见的染色斑点。优点：灵敏度较普通 ELISA 高，试剂用量少，操作简单，NC 膜可长期保存不影响活性。四、酶联免疫斑点试验（ELISPOT）（一）原理：T 细胞分泌的细胞因子或 B 细胞产生的特异性抗体被 PVDF 膜上特异性单克隆抗体捕获。再与生物素标记的二抗结合，其后再与碱性磷酸酶标记的亲和素结合。BCIP/NBT 底物孵育后，PVDF 膜出现“紫色”的斑点为阳性反应。（二）ELISPOT 与 ELISA 的区别 1.ELISA 通过显色反应，在酶标仪上测定吸光度，与标准曲线比较得出可溶性蛋白总量。 2.ELISPOT 通过显色反应，在细胞分泌这种可溶性
10、蛋白的相应位置上显现清晰可辨的斑点，可直接在显微镜下或通过仪器对斑点进行计数，1 个斑点代表 1 个细胞，从而计算出分泌该蛋白的细胞的频率。3.由于是单细胞水平检测，ELISPOT 比 ELISA 和有限稀释法等更灵敏，能从 20 万30 万个细胞中检出 1 个分泌该蛋白的细胞。4.捕获抗体为高亲和力、高特异性和低内毒素 McAb，在研究者以刺激剂激活细胞时，不会影响活化细胞分泌细胞因子ELISPOT 技术应用领域非常广泛，如移植中排斥反应的预测、疫苗发展、Th1/Th2 分析、自身免疫病研究、肿瘤研究、过敏性疾病研究、感染性疾病研究、抗原决定簇图谱分析、化合物和药物免疫学反应的筛选等五、免疫
11、印迹法（IBT）又称 Western-blot，将 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的高分辨力与抗原抗体反应的高特异性相结合。第一阶段为 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）。抗原等蛋白样品经 SDS 处理后带负电荷，在聚丙烯酰胺凝胶中从阴极向阳极泳动，分子量越小，泳动速度就越快。此阶段分离效果肉眼不可见（只有在染色后才显出电泳区带）。第二阶段为电转移。此阶段分离的蛋白质条带肉眼仍不可见。第三阶段为酶免疫定位。将印有蛋白质条带的硝酸纤维素膜依次与特异性抗体（常为多克隆抗体）和酶标第二抗体作用后，加入底物，使区带染色。常用的 HRP 底物为 3，3-二氨基联苯胺（呈棕色）和 4-氯-1-萘酚
12、（呈蓝紫色）。阳性反应的条带清晰可辨。并可根据 SDS-PAGE 时加入的分子量标准，确定各组分的分子量。免疫印迹中需要注意的问题1.抗体的性质 影响免疫印迹成败的一个主要因素是抗原分子中可被抗体识别的表位的性质。只有那些能识别耐变性表位的抗体可与抗原结合，多数多克隆抗血清中或多或少地含有这种类型的抗体，所以在免疫印迹实验中常选用多克隆抗体。2.IBT 的灵敏度 有若干种方法常用于提高免疫印迹的灵敏度，一种是在电泳之前应用免疫沉淀法将抗原进行纯化和浓缩。该法可浓缩浓度极低的抗原，并可在电泳和免疫印迹之前将其与无关的蛋白质分离，使对极低浓度抗原的研究成为可能。其他提高检测灵敏度的方法都是针对增强
13、信号本身强度设计的，其中包括使用信号更好和更强的荧光试剂或使条带局部酶的活性增强。3.IBT 法在临床应用中存在一定的局限性 本法综合了 SDS-PAGE 的高分辨力和 ELISA 法的高特异性和敏感性，是一个有效的分析手段，不仅广泛应用于分析抗原组分及其免疫活性，并可用于疾病的诊断。在艾滋病病毒感染中此法作为确诊试验。当血清 HIV 抗体阳性时，抗体结合到膜上的病毒蛋白上，最后用放射性核素标记的抗人 IgG 检测。如能检测出 HIV 蛋白抗原即为阳性，如仅 p24 阳性，则结果可疑，就对原标本重判。WB 试验能检测到 gpl20、p66、p51、gp41、p31、p24 和 17kD 的抗原
14、。其敏感性较 ELISA 高,但比 RIPA 差。并可用 HIV-1 和 HIV-2 划分，由于自身抗体的存在，仍有假阳性。六、放射免疫沉淀试验（RIPA）以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法，是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法，同时弥补了免疫印迹法的不足。【习题】免疫印迹法区带显色常用的底物是A.邻苯二胺B.四甲基联苯胺C.ABTSD.对硝基苯磷酸酯E.3，3-二氨基联苯胺正确答案E答案解析免疫印迹法区带显色常用的底物是 3，3-二氨基联苯胺。以下有关免疫印迹法错误的说法是A.通过 SDS-PAGE 电泳分离蛋白质样品B.将蛋白质从凝胶转移到固相膜上C.酶使底物显色检测固相膜上的蛋白质区带D.被称为 Northern blotE.本法分辨力高，特异性和敏感性也高正确答案D答案解析免疫印迹法（IBT）又称 Western-blot，将 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的高分辨力与抗原抗体反应的高特异性相结合。
