1、1用于蛋白质偶联的亲水性聚合物载体United States Patent 4511,694Kramer, et al April 16, 1985Hydrophilic Polymer Carrier for Proteins权利要求书1 本专利申请的是一种制备一种用于蛋白质连接的珍珠状交联亲水性聚合物载体的方法。这种方法包括反向珍珠聚合（靠自由基聚合机理） ，单体相以小滴形状分散在非水有机介质中，单体相包含下列单体的混合物：（1） 重量含量 30-95%的可聚合的单体，至少一种化合物来自于下列化合物群：丙烯酰胺，甲基丙烯酰胺，甲基-双丙烯酰胺，和亚甲基-双-甲基丙烯酰胺。（2） 0-65%
2、的亲水性自由基可进一步聚合的共聚体（3） 5-60%的至少一种不饱和可自由基聚合的单聚体含有环氧基团，并且（4） 0-25%的至少一种其他可自由基聚合的共聚单体，有轻微的亲水性，这种可聚合单体至少 5%的含有至少两个可聚合双键，进一步聚合单体相包括稀释剂，这种稀释剂是下列东西的混合物。（A） 至少一种溶剂来自于“水，甲酰胺，乙二醇，和二甲基亚砜，而且（B ） 至少一种有机溶液有别于（A） ，且与前面所说的单体混合物和 A 一起形成均匀相。这种有机液体的分子重量低于 200，至少含有 20%的氧（按重量计算，如羟基）。这里所说的稀释剂混合物出现的（A）和（B）的比例是使 A+B 与前面所述的单体
3、混合物形成均匀相，这样使得前面所说的含有单体混合物的单体相，与稀释剂互不相溶，单体相悬浮在里面，被称为非水有机相。2 如权利要求 1 中所说的方法，在这种方法中 B 的溶解性系数在 915 Hildebrand 单位。或分解溶解性系数（a dispersive solubility parameter）在 79.4 Hildebrand 单位之间。3 如权利要求 1 中所说的方法，这种方法中 B 与水在室温下完2全互溶。4 如权利要求 3 中所说的方法，这种方法中，其稀释剂是水和甲醇的混合物。5 如权利要求 1 中所说的方法，这种方法中，在引发聚合物反应前一种聚合物被溶解在单体相中。6 用权利
4、要求 1 所述的方法制备的一种亲水性珍珠聚合物。7 如权利要求 6 所述的能将蛋白质连接其上的亲水性珍珠聚合物。描述本发明与制备一种珍珠状的亲水载体聚合物（能够键合蛋白质的）有关，与这一类聚合物和它们的用途有关。从 German Auslegeschrift No.2237316 我们知道如何制备一种珍珠状的交联共聚化合物，这种化合物在水中可溶胀，是用一种单体混合物，一种交联单体和一种亲水性单体进行反相珍珠聚合而成，其中的单体混合物由能够键连蛋白质的单体组成。为了获得好的溶胀性和广的交联网络，溶解单体混合物被溶解在一种与非极性有机聚合介质不能相溶的溶剂中。溶液在这种介质中以小液滴的形式悬浮存在
5、，也以这种形式进行聚合。甲酰胺，二甲基甲酰胺，或二甲基亚砜被用作这种单体混合物的溶剂。根据 German Offenlegungsschrift NO.27 22 751，如果交联单体在单体混合物中所占的比例是 5%或更多，丙烯酰胺，甲基丙烯酰胺或甲基-双丙烯酰胺，或亚甲基-双- 甲基丙烯酰胺的重量比例超过某一界限值的话，用这种方法得到的聚合物具有空白的珍珠结构，这被认为对于高键联活性是非常重要的。这种已为人们所知的亲水性珍珠聚合物由包含有环氧基团的单聚体单元（这种环氧基团能够偶联蛋白质） ，组成，比如缩水甘油基甲丙烯酰胺盐或烯丙基缩水甘油醚。这些单聚体单元水可溶性蛋白质与它们共价偶联，且维持
6、它们的生物活性，尽管以这种方式得到的聚合物与一些酶可达到高的结合能力，然而与其他酶类的结合能力却仍然不尽如人意。 “结合能力”被人们理解的是珍珠状聚合物达到最大量吸附负载某种特定酶时这种酶的活性大小。已经证实，靠提前环氧基团在珍珠聚合物表面的含量，或是在键连酶时使用这种酶的高浓度溶液，无法提高或无法从根本上提高某种特定酶的界限。3本专利的目的在于提高这种可在环氧基团上共价偶联蛋白的亲水性珍珠聚合物的键合能力。从狭义上讲，本发明的目标在于如何在考虑键合某种蛋白时这种珍珠状载体的键合能力优化。人们现在已发现，用本发明所说的方法可形成一种结合能力提高了的，对某些酶来说甚至是最优化的键合能力的珍珠状载
7、体聚合物。溶 解 性 系 数有机介质 分子量 氧原子含量（重量%）delta Delta sub D甲醇 32 50 14.3 7.4乙醇 46 35.0 12.9 7.7正丙醇 60 26.7 11.9 7.8异丙醇 60 26.7 11.5 -正丁醇 74 21.6 11.3 7.8丙酮 58 27.6 9.8 7.6乙酰丙酮醇 116 27.6 10.2 7.7甲基乙基酮 72 22.2 9.3 7.8四氢呋喃 72 22.2 9.5 8.2二甲基甲酰胺 73 22.0 12.1 8.5乙烯基醋酸 88 36.4 9.1 7.4乙烯醇 90 35.5 8.3 -二乙烯醇 118 27.1
8、 11.9 7.9水，甲酰胺，乙二醇，或二甲基亚砜或它们的混合物可被用作稀释剂的 A 组分。令人惊讶的是，尽管水可与环氧基团很容易反应（这些环氧基团对键合能力是非常重要的） ，但采用这种聚合方法时，即使是用水作 A 组分，该载体对蛋白质的键合能力仍维持很高。至于稀释剂的 B 组分，某些因具有氧原子而具有高极性的有机液体介质被证实的是很适合做（B） 。如果这种有机液体的氧含量在20%以上，并且分子量低于 200，所要求的极性就足够了。这种有机液体如果是脂肪族有机液体，氧原子的羰基或羟基形式存在更好。另一方面，羰基由于具有与环氧基团高度的反应活性在此方法中又不适应。在酯键连接中发现的氧原子也可提供
9、理想的极性，比如脂肪族，脂环醚和脂肪醚。对本发明的方法合适的组分（B）绝大多数的总溶解性系数（delta）在（9-15）之间，特别是 1114.5，Hildebrand 单位，或分散溶解性系数（subD） 。在 79 范4围内，最好是在 7.48.5 Hilderbrand Units（Cf. Polymer-Handbook Second Edition, 1975, pages IV 337, et Sep., incorporated here in by reference）单体混合物与稀释剂组分(A)和（B） 。必须形成均匀相，如果可能的话应选择那些在室温下（20） ，就已经能形成均
10、匀相的介质，这里不可能列出所有可能的组合。再进一步讲，这种均匀相混合物与所悬浮的有机介质必须不互溶，至少在聚合温度时应该不互溶，这样一种隔离的悬浮单体相形成了。假如稀释剂组分在有机介质中有一定的溶解度，这些组分中的单聚体相可能被消耗光，从而导致键合能力的变化。无论如何为了达到特别的键合能力，这里建议有机介质在聚合前用稀释剂组分（A）或（B） （能在有机介质中可溶的）预先饱和，或调节至相应的平衡浓度。通过这种方法有机介质的极性增强。稀释剂组分往有机介质中加入的量必须维持在某一限之下，在这个极限值，单聚体相会溶解在有机相之中。通过选择足够非极性的有机介质，可避免这种方法的上述极限值。这里要推荐的是
11、脂肪族烃和氯代烃，或它们的混合物。如果组分(A)和（B ）完全互溶的话是非常有好处的，因此如果可能的话，使它们在室温下就已经完全互溶。组分（B）的有机液体最好是在室温下就与水完全互溶的一族，如甲醇，乙醇，丙醇，丙酮，二甲基甲酰胺，或四氢呋喃。从技术角度上而言，一个特别有优势的组合是甲醇和水的混合物。组分(A) 和（B ）互相混合的比例可在很宽的范围内进行选择，重量百分比可在 99：11 ：99 之间，其中最好为 90：1010：90 之间。由组分(A)和（B ）组成的稀释剂的数量，在单体相中可在20%90%（重量比） ，最好在 50%90%之间。为了确定这个部分的量和组分(A)与（B ）的比例
12、大小，在小试批量生产中一系列不同的珍珠聚合物被相应的制备出来，每种情况下对某种特定蛋白质的键合能力测定出来。这样发现了一个规律，即随着(A)和（B）的比例的变化，键合能力上升直至达到一个最大值，那以后（thereafter）出现下降（如下所示） ，用于反相聚合的单体包括30 份（重量）的甲基丙烯酰胺30 份（重量）的 N,N-亚甲基双-甲基丙烯酰胺20 份（重量）的缩水甘油基醚甲基丙烯酰胺520 份（重量）的烯丙基缩水甘油醚73 份（重量）的甲醇与丙烯酰胺的混合物所得产物用来在最优条件下偶联青霉素-酰基转移酶（PCA）稀 释 剂 最大量酶A B activity甲酰胺 甲醇 (U/g)10 9
13、0 7130 70 10150 50 12490 10 125100 0 95对于其它酶来说，这个系统的活性最大值时(A)和（B）的比例可能有所不同。为了确保珍珠聚合物的亲水性，在这种制备中使用的单聚体混合物必须绝大多数为亲水性的单聚体。甲酰胺，甲基丙烯酰胺和它们的亚甲基- 双- 酰胺属于这一类单体，以及这一类的不饱和的自由基可聚合单体，形成时在室温下 10%以上形成这种单体，这种情况下最好不要含有离子基团，或加入酸或碱时可离子化的基团。这一类适合的亲水性共聚单体的例子有：不饱和可聚合的碳酸的羟烷基酯，比如羟乙基丙烯酸盐，羟乙基甲基丙烯酰盐，2-羟丙基- 丙烯酸盐或 2-羟丙基 -甲基丙烯酸盐
14、，和 N-乙烯基吡咯烷酮（pyrrolidone ） 。丙烯酰胺或甲基丙烯酰胺和它们的亚甲基- 双- 酰胺在其中出现的数量至少占 30%，最好在 50%以上，延伸亲水性共聚体在可聚合单体中出现的数量可机动调节，最高值为 65%。单体中有环氧基团的在单体混合物中出现的数量在 560%之间。这些单体可为缩水甘油基丙烯酰胺，缩水甘油基甲基丙烯酰胺，烯丙基缩水甘油醚。如果需要的话，也可同时使用。当珍珠聚合物与蛋白质充分反应后，或与水介质充分接触后，环氧基团逐步完全转化成羟基，这种处理方法使得聚合物的亲水性进一步增加。延伸共聚体的亲水性稍差一些，它会使饱和水溶液中室温下聚合物亲水性下降 10%，如果使用
15、的话，其在单体相中重量百分含量小于 25%。用本发明制备的珍珠状聚合物是高度交联的。用作交联剂的有效共聚单体，分子中有两个或更多的未饱和乙烯基可供聚合，这种交联剂在单体混合物中至少占 5%的组成。一般而言，亚甲基- 双-丙烯酰胺或亚甲基-双- 甲基丙烯酰胺可用作交联剂。在这种情况下，6可聚合单体中，这种交联单体的数量超过 90%（重量比） 。然而如果其他交联单体用来代替它，或对其进行添加补充的话，这种单体的数量限制，其最多只能占 45%。悬浮的单体相包含聚合引发剂，优化延伸剂作为延伸成分，这些都是目前聚合工艺上已知的东西。从本质上而言反相珍珠聚合的方法是已知的。单体相通过搅拌悬浮在有机介质中，
16、那里面最好含有可溶性分散介质，以形成10m 到 1000m 直径的液滴。粒子尺寸的大小通过选择分散剂的种类和数量，搅拌的速率而调节到理想的值。聚合在单体液滴内发生，将液滴转化成固体珍珠聚合物，这些聚合物在聚合结束后可从有机介质中分离出来。德国专利 NO.20 09218，和 German Auslegeschrift NO. 22 37 316，German Offenlegungsschrift NO. 27 22 751 中描述了这种方法的好处体现。在许多情况下，珍珠状聚合物会有团聚形成大团聚体的趋势，从处理的观点而言这可通常不是人们想要的结果。这种不利之处可用将聚合物溶解在单体相中增加其
17、粘性而避免这种趋势。为了不转移最终产品的亲水性，这种聚合物添加剂也应该是亲水的，而且由与珍珠聚合物相同的同一种单体组成，并且不能是交联单聚体。例如，如果一种水-甲醇混合物被用作稀释剂，聚甲基丙烯酰胺就适合用作聚合物的添加剂。这种类型的聚合物添加剂的有效数量在0.120%（以单体重量进行计算）之间。延伸聚合物添加剂能被用作低级烯丙基丙烯酰胺的共聚物，如 butyl acrylate（丁基丙烯酰胺） ，与丙烯酰胺或甲基丙烯酰胺或缩水甘油醚甲基丙烯酰胺，可以使用的延伸聚合物添加剂之一是低级烯丙基丙烯酰胺（比如丁基丙烯酰胺）与丙烯酰胺或甲基丙烯酰胺或缩水甘油醚甲基丙烯酰胺的共聚物。珍珠聚合结合后，这种
18、聚合物珍珠可以从有机介质过滤出来。如果水或其它化合物有活性氢原子，比如说酒精或乙二醇，这些被用作稀释剂，这些东西必须出去，不然的话这些分子会与发生贮藏时十分害怕出现的与环氧基团的反应。挥发性溶剂，如水和乙醇用干燥法很易除去。难挥发物质，比如乙二醛，甲酰胺，或二甲基亚砜用挥发性有机溶剂丙酮很易冲洗出来。然后，蒸去溶剂的残留物。干燥以后，聚合物珍珠变成坚强而干燥的东西，在没有湿气的存在7下可贮存足够长的时间。连接好蛋白质后，珍珠聚合物与最高可能浓度的蛋白质溶液相混，从某个角度而言，只考虑水溶液。这种用法最重要的用途是酶的固定，比如青霉素-酰基转移酶，胰蛋白酶，或乳糖酶。下列例子，是按照描述方法给出
19、的，列出了根据本发明使用不同的稀释剂组合键合能力的增加。 （Example 1=methanol /water）,与仅使用单一稀释剂得到的产品的键合能力（Example 2=甲酰胺） 。最高键合能力能通过改变稀释剂中组分 A 与 B 的混合比例得到（Cf. Example 9 in the series of Example 7-10 and the table supra in the specification） 。通过比较例子 3-5 和例子 1，聚合物组成的变化能改变最大键合能力位置相对于（A）与（B）的混合比例。从比较中我们可以看出使用 30%或 30%以上的，特别是 50%或 50
20、%以上的高含量交联单聚体（以单聚体混合物的重量计） ，其中MA-methacrylamide 甲基丙烯酰胺MBMA-methylene bis-methacrylamide 亚甲基双甲基丙烯酰胺GM-Glycidyl methacrylate 缩水甘油醚甲基丙烯酸酯AGE-allylglycidyl ether 烯丙基缩水甘油醚*表示在单体相中加入了聚甲基丙烯酰胺离子序数MA MBMA GM AGE 水 甲酰胺 甲醇 青霉素-酰基转移酶或胰蛋白酶活性1 - 80 10 10 20 - 80 1222 - 80 10 10 - 100 - 733 20 30 20 20 40 - 60 04 3
21、0 30 20 20 80 - 20 656.55 30 30 20 20 90 - 10 76 10 50 20 20 70 - 30 307 10 50 20 20 - 70 30 1258 10 50 20 20 - 10 90 719 10 50 20 20 - 90 10 12510 10 50 20 20 - 100 - 9511* 30 30 20 20 80 - 20 10.2比较例子 6 和 7 可以看出，稀释剂组分用另一种液体替换，而聚合体组成维持恒定，在活性上能够带来可观的差异，因此对于(A)与(B) 混合比例的不同，其活性最大值是独立决定的。8举 例 说 明例子 117
22、40 克正己烷，1100 克全氯乙烯，9 克聚合乳化剂（一种共聚物，含 95 份正丁基甲基丙烯酸酯，5 份 2-三甲基氨- 乙烯基-甲基丙烯酰氯） ，和 5 克干冰被引入一个 6 升大的带搅拌容器中，水分离器，回流冷凝器，和氮气进口管和温度计装配在容器中，和氮气进口管和温度计装配在容器中。在搅拌时引入氮气，一种含有下列物质的混合物640 克甲醇160 克水240 克亚甲基双甲基丙烯酰胺30 克烯丙基缩水甘油醚30 克缩水甘油醚甲基丙烯酸盐（酯）6 克 4，4-偶氮双-（4-氰基戊酸）在 50时加入，在有机相中分布，然后加热至 6570。大约 6 小时后，甲醇/水几乎全部循环出反应系统，剩下的东
23、西继续反应 4 小时完成聚合反应，然后冷却至室温。珍珠形成，过滤后，真空下在 40干燥 12 小时。经负载青霉素-酰基转移酶的活性是122U/g。偶联青霉素-酰基转移酶的过程为500g 珍珠在 23与 1.6ml 青霉素- 酰基转移酶溶液（其中含有1.05ml 酶的 0.1M 磷酸钾缓冲液，该缓冲液中含醋酸钾 1M，pH 为7.5） ，一起温育 72 小时，然后，这些珍珠可采用过滤分离，用 1M氯化钠溶液冲洗 3 次，用 pH=7.5 的磷酸盐缓冲溶液冲洗 2 次。所得到的酶制剂珍珠与溶在 0.05M pH=7.5 的磷酸盐溶液中的 20ml 2%的青霉素 G 溶液在 37下温育，所释放出来的
24、苯乙酸用 0.5MNaOH滴定。酶的活性以每克雾湿珍珠进行计算，有 1U/g 活性相当于每分钟每克湿珍珠消耗 1mol NaOH。例子 2 （对照例子）装置与反应程序与例子 1 中的完全相同，除了没有溶剂循环出9这个系统以外。反应成分：1740 克正辛烷，1100g 全氯乙烯（悬浮相）5.6 克乳化剂，5 克干冰单体混合物1200 克甲酰胺，240 克甲基双甲基丙烯酰胺， 30 克烯丙基缩水甘油醚30 克缩水甘油醚甲基丙烯酸盐和 6 克苯甲酰过氧化物在反应的最后，处于生成珍珠上方的相被倾倒掉，珍珠用2000ml 丙酮清洗 3 遍，分离过滤。珍珠然后用丙酮再洗 3 次，真空下干燥 12 个小时。
25、与青霉素-酰基转移酶偶联后，活性为 73U/g。例子 3装置，悬浮相，和反应程序与例子 1 相类似。单体相组成如下：在努力试图偶联青霉素-酰基转移酶上珍珠聚合物后，没测出有任何酶活性。480g 甲醇，320 克水，90 克甲基丙烯酰胺，90 克亚甲基-双-甲基丙烯酰胺60 克烯丙基缩水甘油醚60 克缩水甘油醚甲基丙烯酸酯6 克 4，4-偶氮双-（4-氰基戊酸）例子 4例子 3 使用 160 克甲醇和 640 克脱盐水添进单体相，得到的珍珠部分已发生聚集。偶联青霉素-酰基转移酶后，测得的酶活性为65U/g。10例子 5例子 3 中在单体相中加入 80 克甲醇和 720 克水进行重复。偶联青霉素-
26、 酰基转移酶后，测得的酶活性为 7U/g。例子 6装置，悬浮相，和反应程序与例子 1 相同。单体相的组成如下：240 克甲醇560 克水150 克亚甲基-双-甲基丙烯酰胺30 克甲基丙烯酰胺60 克烯丙基缩水甘油醚60 克缩水甘油醚甲基丙烯酸酯6 克 4，4-偶氮双- （4-氰基戊酸）偶联上青霉素-酰基转移酶后，得到的酶活性为 30U/g。例子 7装置，悬浮相和反应程序与例子 2 的相同。单体相的组成如下：553 克甲酰胺237 克甲醇150 克亚甲基-双- 甲基丙烯酰胺60 克烯丙基缩水甘油醚60 克缩水甘油醚甲基丙烯酸酯6 克苯甲酰过氧化物6 克二甲基苯胺 （CH 3） 2C6H3NH2
27、（当单体相在有机相中分散均匀后加入）偶联上青霉素-酰基转移酶后，得到的酶活性为 125U/g。例子 8在单体相中加入 79 克甲酰胺和 711 克甲醇重复例 7。偶联上青霉素-酰基转移酶后，得到的酶活性为 71U/g。11例子 9在单体相中加入 711 克甲酰胺和 79 克甲醇重复例 7。偶联上青霉素-酰基转移酶后，得到的酶活性为 125U/g。例子 10（对照例子）在单体相中加入 791 克甲酰胺重复例 7。偶联上青霉素-酰基转移酶后，得到的酶活性为 95U/g。例子 11装置，悬浮相和反应条件与例子 1 的类似单体相的组成如下：30 克聚甲基丙烯酰胺160 克甲醇640 克水81 克甲基丙烯酰胺81 克 N,N-亚甲基双甲基丙烯酰胺54 克烯丙基缩水甘油醚54 克缩水甘油醚甲基丙烯酸盐（酯）6 克 4，4-偶氮双-（4-氰基戊酸）与例 4 相比，得到的珍珠为圆的均一珍珠。
