1、ICS 65.020.30B 40 DB33浙 江 省 地 方 标 准DB33/T 21832019家 蚕 核 型 多 角 体 病 抗 性 鉴 定 方 法Regulation of identification for silkworm nuclear polyhedrosis resistance2019-01-15 发布 2019-02-15 实施浙 江 省 市 场 监 督 管 理 局 发 布DB33/T 2183-2019I前 言本 标 准 按 照 GB/T 1.1-2009 给 出 的 规 则 起 草 。 本 标 准 由 浙 江 省 农 业 农 村 厅 提 出 。 本 标 准 由 浙
2、江 省 种 植 业 标 准 化 技 术 委 员 会 归 口 。本 标准 起草 单位 ： 浙江 大 学蚕蜂 研究 所、 浙江大 学 农业技 术推 广中 心、 浙 江 省农业 技术 推广 中心 、 浙江省 蚕 种 质量 检验 检疫 站、 浙江 省农 业科 学院 蚕 桑研究 所 、 桐 乡市 蚕业 有 限公司 、 浙江 省种 植业 管 理 局。本 部 分 主 要 起 草 人 ： 鲁 兴 萌 、 周 金 钱 、 邵 勇 奇 、 楼 霞 、 赵 新 华 、 谷 利 群 、 王 永 强 、 徐 杰 、 张 三 妹 、 黄 衍 峰 。DB33/T 2183-20191家蚕核型多角体病抗性鉴定方法1 范围本标
3、准 规定 了家 蚕核 型多 角体病 抗性 鉴定 的 术 语和 定义， 家蚕 核型 病毒 多角 体 试验用 悬浮 液的 制备 、 计 数 及 保 存 ， 半 数 致 死 浓 度 测 定 ， 抗 性 鉴 定 评 价 。本 标 准 适 用 于 家 蚕 一 代 杂 交 种 的 核 型 多 角 体 病 抗 性 评 价 。2 规 范 性 引 用 文 件下列文 件对 于本 文件 的应 用是必 不可 少的 。 凡 是注 日 期的引 用文 件， 仅 注 日期 的 版本适 用于 本文 件。 凡 是 不 注 日 期 的 引 用 文 件 ， 其 最 新 版 本 （ 包 括 所 有 的 修 改 单 ） 适 用 于 本
4、文 件 。GB/T 8170 数 值 修 约 规 则 与 极 限 数 值 的 表 示 和 判 定DB33/T 2019 蚕 种 生 产 技 术 规 程3 术 语 和 定 义下 列 术 语 和 定 义 适 用 于 本 标 准 。3.1家 蚕 核 型 多 角 体 病 病 毒 bombyx mori nuclear polyhedrosis virus为 杆 状 病 毒 科 、 真 杆 状 病 毒 亚 科 、 核 型 多 角 体 病 毒 属 的 一 种 。3.2家 蚕 核 型 多 角 体 病 病 毒 多 角 体 bombyx mori nuclear polyhedrosis virus and i
5、nclusion body家蚕核 型多 角体 病病 毒在 家蚕体 内繁 殖后 ， 形 成包 埋了大 量病 毒的 多角 体 ， 在生物 光学 显微 镜下 呈 六 角 形 ， 并 具 有 较 强 折 光 性 。3.3家 蚕 核 型 多 角 体 病 silkworm nuclear polyhedrosis核型多 角体 病病 毒在 家蚕 体内大 量繁 殖， 蚕体 呈 乳 白 色、 体 躯肿 胀、 狂 躁爬 行、 体壁易 破典 型病 征， 或 致 死 的 病 害 。DB33/T 2183-20193.42半 数 致 死 浓 度 median lethal concentration（ LC50）在 规
6、 定 时 间 内 ， 通 过 添 食 攻 毒 感 染 ， 使 2 龄 家 蚕 半 数 死 亡 所 需 的 病 毒 多 角 体 浓 度 。3.5攻毒 challenge test以 人 工 添 毒 的 方 法 ， 将 病 毒 多 角 体 悬 浮 液 均 匀 涂 抹 于 桑 叶 背 面 ， 喂 饲 家 蚕 使 之 感 染 。3.6抗 性 指 数 resistance index用 于 衡 量 参 试 蚕 品 种 抗 性 的 指 数 ， 以 参 照 品 种 LC50 平 均 值 为 100R。4 家 蚕 饲 养按 DB33/T 2019中 简 化 催 青 的 要 求 催 青 ， 常 规 饲 养 至
7、2龄 起 蚕 。5 家 蚕 核 型 病 毒 多 角 体 试 验 用 悬 浮 液 的 制 备 、 计 数 及 保 存5.1 悬 浮 液 的 制 备5.1.1 添食将 纯 化 的 病 毒 多 角 体 ， 用 蒸 馏 水 配 成 1106个 /毫 升 浓 度 的 攻 毒 液 。 取 3 片 大 小 约 10 cm10 cm清 洁 桑 叶 ， 用 脱 脂 小 棉 球 蘸 取 5 ml， 均 匀 涂 抹 在 每 片 桑 叶 背 面 ， 喂 饲 100头 4龄 起 蚕 ， 基 本 食 净 后 (约 12 h)， 改 用 清 洁 桑 叶 喂 饲 。 在 24 25 的 温 度 下 ， 饲 养 7 d 10
8、d备 用 。5.1.2 制备从 饲 养 的 攻 毒 蚕 中 ， 选 择 有 体 色 乳 白 和 体 躯 肿 胀 典 型 病 征 ， 但 尚 未 出 现 狂 躁 爬 行 病 症 和 皮 破 之 前 ， 用 剪 刀 从 病 蚕 的 腹 足 或 尾 角 收 集 其 体 液 ， 经 2层 脱 脂 纱 布 过 滤 ， 然 后 将 滤 液 用 3000 r/min离 心 10 min， 弃上清 ； 沉 淀用 无菌 生理 盐水充 分悬 浮后 ， 再 用30 00 r/min离 心10 min， 弃上 清； 重 复离 心3 次 5次 ， 至 沉 淀 呈 较 为 均 质 的 乳 白 色 ， 再 用 少 量 无
9、菌 生 理 盐 水 充 分 悬 浮 ， 即 成 病 毒 多 角 体 悬 浮 液 。5.2 病 毒 多 角 体 的 计 数用血球 计数 板计 数 病 毒多 角体悬 浮液 中多 角体 的数 量， 并用 无菌 生理 盐水 调 成1 109个 /毫 升的 病毒 多 角 体 悬 浮 液 母 液 ， 直 接 使 用 或 置 4 冰 箱 内 备 用 。5.3 病 毒 多 角 体 悬 浮 液 的 保 存5.3.1 保 存 方 法DB33/T 2183-20193将 病 毒 多 角 体 悬 浮 液 置 4 保 存 。5.3.2 保 存 时 间病 毒 多 角 体 悬 浮 的 有 效 保 存 时 间 为 2年 。6
10、 半 数 致 死 浓 度 测 定6.1 攻 毒 用 多 角 体 悬 浮 液 的 配 制将 病 毒 多 角 体 悬 浮 液 母 液 （ 1109个 /毫 升 ） 用 无 菌 生 理 盐 水 稀 释 成 1109个 /毫 升 、 1108个 /毫 升 、 1107个 /毫 升 、 1106个 /毫 升 和 1105个 /毫 升 的 稀 释 病 毒 多 角 体 悬 浮 液 。 也 可 采 用 类 似 的 其 它 10倍 梯 度 方 法 制 作 稀 释 病 毒 多 角 体 悬 浮 液 。 病 毒 多 角 体 悬 浮 液 母 液 及 梯 度 稀 释 液 的 有 效 保 存 时 间 为 1 个 月 。6.
11、2 攻 毒 对 象 和 设 区6.2.1 攻 毒 对 象测 试 蚕 品 种 、 对 照 蚕 品 种 的 2 龄 起 蚕 。6.2.2 攻 毒 设 区设 5个1 0倍 稀释 浓度 病毒 多 角体悬 浮液 ， 每个 浓度 设3 个重复 区 ， 每 个重 复区 30头蚕 。 同 时设 无菌 生 理 盐 水 添 食 作 对 照 区 。6.3 攻 毒 添 食 与 饲 养取1片清洁适龄桑叶，切成约5cm5cm的方块叶，用小脱脂棉球将200 L的病毒多角体悬浮液均匀 涂 抹 在 方 块 叶 背 面 后 喂 食 。 待 桑 叶 基 本 食 净 （ 约 12 h） 后 ， 改 饲 清 洁 桑 叶 ， 在 25
12、27 的 温 度 下 饲 养。6.4 病 死 蚕 计 数6.4.1 校验对 照 区 有 非 核 型 病 毒 多 角 体 病 因 素 引 起 的 异 常 ， 试 验 重 做 。6.4.2 病 死 蚕 统 计从 2 龄 起蚕 攻毒 开始 到2 眠眠起 止 ， 为 病死 蚕计 数 时间 。 有 核型 病毒 多角 体 病典型 病征 的蚕 ， 计为 病 死 蚕 ； 没 有 典 型 病 征 的 3龄 起 蚕 ， 计 为 健 康 蚕 。 对 不 能 确 定 的 迟 眠 蚕 ， 取 其 血 用 显 微 镜 检 查 ， 检 到 有 家 蚕 核 型 病 毒 多 角 体 的 ， 计 入 病 死 蚕 。 计 算 各
13、浓 度 区 的 死 亡 率 和 平 均 死 亡 率 。6.5 半 数 致 死 浓 度 的 计 算半 数 致 死 浓 度 （ LC50） 的 计 算 ， 采 用 Reed-Muench法 。式中：(1)4DB33/T 2183-2019LC50半数致死浓度； D U50死 亡 率 超 过 50%试 验 组 的 累 计 死 亡 率 ； DD50死 亡 率 低 于 50%试 验 组 的 累 计 死 亡 率 ； logN稀释因子的对数；DU50-log累 计 死 亡 率 超 过 50%试 验 组 的 病 毒 多 角 体 悬 浮 液 浓 度 对 数 。7 抗 性 鉴 定 评 价7.1 抗 性 参 照 蚕
14、 品 种抗 性 参 照 蚕 品 种 设 2个 ， 菁 松 皓 月 (正 反 交 )、 秋 丰 白 玉 (正 反 交 )。 参 照 品 种 与 待 鉴 定 评 价 品 种 同 步 试 验 ， 按 照 本 标 准 第 6章 计 算 LC50。7.2 抗 性 指 数以 2个 参 照 蚕 品 种 的 LC50平 均 值 为 100R， 再 根 据 待 测 蚕 品 种 的 LC50换 算 出 该 品 种 的 抗 性 指 数 。7.2.1 参 照 蚕 品 种 的 半 数 致 死 浓 度 平 均 值CKLC50 CK1LC50 CK 2LC50 CK 3LC50 CK 4LC50 100R . (2)4式中
15、：CKLC50参 照 品 种 的 半 数 致 死 浓 度 平 均 值 ； CK1LC50、 CK2LC50、 CK3LC50、 CK4LC502个 对 照 品 种 （ 正 反 交 ） 的 半 数 致 死 浓 度 ； 100R对照种抗性指数。7.2.2 待 测 蚕 品 种 的 抗 性 指 数式中：TGI待测蚕品种的抗性指数；TGI TGLC50 100R CKLC50. (3)TGLC50待 测 蚕 品 种 的 半 数 致 死 浓 度 ； CKLC50对 照 品 种 的 半 数 致 死 浓 度 平 均 值 。7.3 抗 性 等 级 评 级按 照 表 1对 家 蚕 品 种 的 核 型 多 角 体 病 毒 抗 性 等 级 作 出 鉴 定 评 价 。表 1 家 蚕 对 核 型 多 角 体 病 毒 的 抗 性 等 级核型多角体病抗性等级 抗性指数 应用建议超强(Ultrastrong) 1600R 可在家蚕核型多角体病流行严重的蚕区饲养强(Strong) 201R 1600R 可在家蚕核型多角体病流行较严重的蚕区饲养一般(General) 50R 200R 可在非家蚕核型多角体病流行的蚕区饲养弱(Weak) 50R 慎用5DB33/T 2183-20198 数 据 修 约按 GB/T 8170要 求 ， 保 留 2位 小 数 。
