1、第二章 生物芯片的分类,根据不同的分类标准， 生物芯片可以分为不同的种类。,生物芯片的分类（1）,根据芯片上固定探针的不同,生物芯片,DNA芯片,蛋白质芯片,细胞芯片,组织芯片,寡核苷酸芯片,cDNA芯片,基因组芯片,DNA芯片技术的比较 (Comparison of DNA Chip Technologies),Oligo-Chip cDNA-Chip Genomic Chip8 n or 20 n 50,000 n,sequencing,expression,expression,genomic analysis,寡核苷酸芯片（Oligo-Chip）,寡核苷酸,原位合成,合成后固定,寡核苷
2、酸阵列 (特异性强),突变 检测,基因表达谱 的检测,新基因 发现,绘制 基因图,cDNA芯片（cDNA-Chip）,cDNA芯片是将cDNA片段密集排列并固化在玻璃等载体上。cDNA芯片直接利用cDNA克隆库制备芯片，制作技术较为成熟、成本较低、靶基因检测特异性好，可用于基因表达差异的检测。目前许多实验室和制药公司都用此类芯片。,procedures of cDNA microarray analysis,cDNA Microarray,cDNA library normalized,cDNA microarray,9600 clones / 2X 3 cm2,cDNA chips,基因组芯
3、片（genomic chip)Why Genomic Biochips?,对样品进行扫描以确定基因拷贝数的变化（Screen specimens to determine gene copy number changes）建立基因拷贝数的变化与疾病生物学的关系（Establish correlations between gene copy number changes and disease biology）,与表达芯片相结合，完整的理解疾病的进程 （Combined with expression chips, gives full understanding of disease pro
4、cess）,确定多个基因在疾病的发生和过程的相互作用（Determine the interaction of multiple genes on the initiation and progression of disease）,加速发展染色体疾病控制的药物，从而指导治疗的干预 （Accelerate development of products for genomic disease management to guide therapeutic intervention）,5月8日北京本元正阳基因技术股份有限公司 研制出SARS病毒全基因组芯片检测系统,SARS病毒全基因组芯片覆盖了
5、病毒基因组的全部序列试用于SARS病毒的早期检测，并全面监测该病毒基因组的变化。包括分析世界各地分离株之间的差异、病毒在传播过程中可能发生的变异以及追索病毒来源,Assay Formats of Genomic and Expression chip,1. Extract genomic DNA from tissue,4. Hybridize to Chip,5. Wash and Image,2. Label,Genomic,Expression,1. Extract mRNAfrom tissue,2. Produce cDNA by RT & Label,4. Hybridize to
6、 Chip,5. Wash and Image,3. Mix with labeledreference DNA,3. Mix with labeledreference cDNA,把蛋白质点阵到经化学方法或酶、受体、抗体等生物学方法处理过的固体表面, 通过衡量与芯片表面的亲和力来分析未知分子。,蛋白质芯片可以用来进行免疫分析，蛋白蛋白间 的相互作用分析和配体结合分析。,蛋白质芯片（ Protein Chip）,蛋白芯片与基因芯片的原理相似,不同之处：,一、芯片上固定的分子是蛋白质, 如抗原或抗体等,二、检测的原理是依据蛋白分子、蛋白与核酸、蛋白与其它分子的相互作用,MacBeath G an
7、d Schreiber S L，2000 哈福大学率先报道了蛋白质芯片的尝试性工作,蛋白质芯片研究,第一个包含一种生物全部蛋白质分子的蛋白质芯片-酵母蛋白质组芯片（耶鲁大学 Zhu等，2001 ）,5800 yeast ORF over expressionprotein Chips用于蛋白质与磷脂间相互作用的检测发现了新的钙调蛋白和磷脂结合蛋白,这种只有两英寸大小的蛋白质芯片已由深圳益生堂生物企业有限公司投产。只需要微升（一滴血的十分之一）血清或血浆，小时后就能检测出结果。而每次的检测费用只有100元左右。,2003年4月中国军事医学科学院宣布，研制出丙型肝炎蛋白质芯片是第一个获国家药监局颁
8、发的生物制品一类新药证书的蛋白质芯片也是迄今为止世界上惟一得到政府药品监督管理机构颁发新药证书的蛋白质芯片。,国内蛋白质芯片的研究进展,2003年5月,中科院上海生命科学研究院宣布研制出SARS蛋白质芯片检测系统，其包含SARS病毒五种主要结构蛋白质N蛋白、E蛋白、S蛋白、M蛋白和3CL蛋白的抗原，以及相应的配套对照蛋白, 对送检血清样品进行检测。获得检测结果大约需1个半小时. 台大医学院医研制出肿瘤蛋白质芯片, 其包括肺癌、乳癌、大肠癌及口腔癌 等四种肿瘤的生化标记，目前筛检的准确率将近八成，虽然无法借此确定肿瘤的发生部位，但是可以当成临床诊断癌症的参考。,抗体芯片（Antibody Mic
9、roarray，Ab Microarray ）,是蛋白质芯片的一种，是检测生物样品中蛋白表达模式的新方法。,芯片上排列了378种已知蛋白的单抗(Ab Microarray 380), 这些单抗对应的蛋白都是细胞结构和功能上十分重要的蛋白，涉及信号传导、肿瘤、细胞周期调控、细胞结构、细胞凋亡和神经生物学等广泛的领域。,第一张商品化的抗体芯片是由美国BD Clontech公司推出的。,通过这张芯片，我们在一次实验中就能够比较几百种蛋白的表达变化。,抗体芯片的操作流程,Extracting proteinLabeling protein with Cy5 and Cy3 dyesRemoving u
10、nbound dyeIncubating labeled protein with Ab MicroarraysScanning microarrays to measure bound antigen,The Ab Microarray Protocol,Protein Isolation,Protein Labeling,Incubation and Washing,Image and Data Analysis,Micro-array with specific mAbs,Ab Microarray Schematic,根据芯片表面化学修饰物的不同,生物芯片的分类（2）,多聚赖氨酸修饰芯
11、片 （Poly-L-Lysine）,氨基修饰芯片 （Amino Silane/Silanated）,醛基修饰芯片 （Aldehyde/Silylated）,生物芯片,多聚赖氨酸芯片 （Poly-L-Lysine）,世界上制作的第一块芯片就是用多聚赖氨酸包被处理的（Schema等，1996）。 优点：处理方便、杂交性能优越，能够得到很好的杂交效果。 缺点：不能长久保存，存放时间少于4个月， 表面易被点样针损伤，在沸水中变性处理时易成片脱落，杂交时也易受到损伤， 措施：包被后的片基存放几周进行熟化。,氨基修饰玻片 （Amino Silane/Silanated）,氨基修饰玻片对高温没有多聚赖氨酸修
12、饰玻片那样敏感。目前，商业上可获得高质量的氨基修饰玻片，杂交效果更佳，并且受时间变化的影响小。,醛基修饰芯片 （Aldehyde/Silylated）,醛基修饰的玻片可与5端接头被氨基修饰的DNA结合，因此可在PCR引物的5端加上一个氨基。醛基修饰的玻片结合效率较高，背景较低，但长时间空气中贮存的醛基修饰片基可能会因氧化而损失一些醛基基团。,生物芯片的分类（3）,根据芯片固相支持物的不同,生物芯片,无机芯片,有机芯片,有硅芯片,玻璃芯片,陶瓷芯片,聚丙烯薄膜,尼龙膜,第一， DNA样品以共价键的形式结合在处理过的玻片上。第二，玻璃是一种耐用的材料，能够耐高温和高离子强度溶液的洗涤。第三，玻璃不
13、是多孔材料，使杂交的容量能保持在最小，因此能提高探针与目标分子的退火效率。第四，由于材料的低荧光性，不会有背景的影响。第五，两种不同的探针能够标上两种不同的荧光标记，在一片芯片上同一个反应中同时孵育；尼龙就受到连续或平行杂交的限制。,玻璃片材料的优点,有机芯片,有机芯片主要包括聚丙烯薄膜和尼龙膜其上的探针主要是预先合成后通过特殊的微量加样装置滴加而成的另有以聚丙烯膜支持物,可用传统的亚磷酰胺固相法原位合成高密度探针序列,生物芯片的分类（4）,根据芯片的用途不同,生物芯片,表达分析芯片(Expression chip),测序芯片(sequencing chip),芯片实验室(lab on chi
14、p),基因表达分析芯片,将克隆到的成千上万个基因特异的探针或其cDNA片段固定在一块DNA芯片上，将标记后的不同来源的mRNA或反转录的cDNA与芯片上的cDNA或寡核苷酸阵列进行杂交，检测基因的表达情况。,cDNA clones (probes),mRNA target),overlay images and normalise,Hybridise target to microarray,检测基因的表达情况,DNA测序芯片,DNA测序芯片主要是利用大规模特异的寡核苷酸阵列，与被测DNA片段进行杂交，通过对大量阵列杂交结果的分析，得到被测DNA的序列，从而获得基因突变或单核苷酸多态性等方面的
15、信息。,寡核苷酸阵列 (probes),Target DNA,Hybridise target to microarray,analysis,基因突变 单核苷酸多态性,overlay images and normalise,芯片实验室,芯片实验室又名“缩微实验室”，这一技术是将核酸分离，PCR扩增，DNA酶切，分子杂交和检测，竞争性免疫分析，毛细管电泳等一系列的操作过程集中组装在一块2cm2大小的芯片上，其全自动化、无污染，反应速度、灵敏度和准确度大大提高。Nanogen公司做出了世界上第一块缩微实验室的芯片模型。Affymetrix公司目前已能将全套温控装置，包括冷却器、加热器和通氧孔等组
16、件组装在一块芯片上使PCR得以顺利进行。,芯片实验室为高度集成化的、集样品制备、基因扩增、核酸标记及检测为一体的便携式生物分析系统它最终的目的是实现生化分析全过程全部集成在一片芯片上完成，实现生物分析过程自动化、连续化和微缩化属未来生物芯片的发展方向。,生物芯片的分类（5）,根据探针阵列合成方法的不同,生物芯片,在片/原位合成法 （on chip/in situ synthesis）,离片合成法 （off chip synthesis）,在片/原位合成法（on chip/in situ synthesis）， 即在支持物表面原位合成寡核苷酸探针），适用于寡核苷酸芯片,一是原位光刻合成（Affy
17、merix公司专利技术），该方法的主要优点是可以用很少的步骤合成极其大量的探针阵列。,原位合成有两种途径，,另一种原位合成是压电打印法，其原理与普通的彩色喷墨打印机相似，所用技术也是常规的固相合成方法。,制备单个探针,克隆探针(如DNA探针、cDNA探针等)，,化学合成的寡核苷酸探针,将探针按一定的顺序固定在经过特殊处理的固相载体表面,优点,探针的制备或合成技术是成熟,任意选择探针的长度,比较容易固定,缺点,单位面积芯片上固定的探针数量较少,探针的数量较大时，其制备、合成及固定过程十分复杂,适合于制备较小规模的探针阵列，尤其适合于检测基因突变,离片合成法（off chip synthesis)是预合成后直接点样，多用于大片段DNA，有时也用于寡核苷酸，甚至mRNA。,
