1、ICS 65.020.20B 31 备 案 号 ： 33994-2012 DB32江 苏 省 地 方 标 准DB32/T 2089-2012梨品种 DNA 指 纹 图 谱 鉴 别 规 范Rules of identification for DNA fingerprinting in pear cultivars2012-05-08 发布 2012-08-08 实施江 苏 省 质 量 技 术 监 督 局 发 布 DB32/T 2089-2012前 言为 规 范 梨 品 种 命 名 和 保 护 新 品 种 产 权 ， 促 进 梨 苗 木 市 场 有 序 发 展 ， 特 制 定 本 标 准 。本
2、标 准 编 写 按 GB/T1.1-2009 标 准 化 工 作 导 则 第 1 部分 标 准 的 结 构 与 编 写 规 则 的 规 定 编 写 。 本 标 准 由 南 京 农 业 大 学 提 出 。本 标 准 由 南 京 农 业 大 学 负 责 起 草 和 制 定 。 本 标 准 主 要 起 草 人 ： 吴 俊 、 张 绍 铃 、 张 明 月 、 陶 书 田 、 齐 开 杰 、 黄 小 三 、 张 虎 平 。DB32/T 2089-20121梨品种 DNA 指纹图谱鉴别规范1 范 围本 标 准 规 定 了 梨 品 种 登 记 、 样 本 采 集 和 处 理 、 DNA 提 取 与 检 测
3、、 分 子 标 记 扩 增 与 检 测 、 谱 带 数 据 分 析 、 DNA 指 纹 图 谱 建 立 及 品 种 鉴 别 。本 标 准 适 用 于 梨 品 种 资 源 的 鉴 定 。2 术 语 和 定 义下 列 定 义 适 用 于 本 标 准 。2.1DNA 指 纹 图 谱 DNA Fingerprint指 通 过 DNA检 测 技 术 ， 获 得 由 多 个 位 点 上 的 等 位 基 因 组 成 的 长 度 不 等 的 特 征 图 纹 ， 这 种 图 纹 极 少 有 两 个 完 全 相 同 ， 故 称 为 “DNA指 纹 “， 意 思 是 它 同 人 的 指 纹 一 样 是 每 个 人
4、所 特 有 的 。2.2SSR 标 记 Simple Sequences Repeat marker指 以 少 数 几 个 核 苷 酸 (1 5)为 单 位 多 次 串 联 重 复 的 DNA 序 列 ,由 于 基 本 单 元 重 复 次 数 的 不 同 而 形 成 SSR 座 位 的 多 态 性 。2.3SRAP 标记 Sequence-related amplified polymorphism marker指 相关 序列 扩增 多态 性， 该标 记对 DNA 的内 含 子、 启动 子区 域进 行特 异 扩增 ， 因 个体 不同 以及 物 种 的 内 含 子 、 启 动 子 与 间 隔 长
5、 度 不 等 而 产 生 多 态 性 。3 品 种 登 记记 录 待 鉴 定 品 种 资 源 的 来 源 ， 并 对 该 品 种 系 谱 关 系 的 背 景 进 行 了 解 和 登 记 。4 仪 器 设 备PCR 仪 、 核 酸 定 量 分 析 仪 （ Nanodrop） 、 水 平 电 泳 仪 、 凝 胶 成 像 仪 、 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 仪 。5 材 料 采 集 与 处 理5.1 叶 片 采 集选 取 生 长健 康良 好的 梨树幼 嫩叶 片， 要求 发育 良好， 而尚 未完 全展 开， 一般在 枝的 生长 点附 近 。 注 意 要 选 取 完 整 、 无 病 虫 害 或
6、者 损 伤 的 叶 片 。5.2 样 品 处 理DB32/T 2089-20122将 采 集 的 样 品 放 在 冰 盒 中 ， 保 持 新 鲜 状 态 ， 并 及 时 带 回 实 验 室 。 将 所 采 集 的 样 品 叶 片 经 过 水 清 洗 后 ， 擦 干 ， 可 直 接 用 于 DNA 提 取 。 如 不 立 即 使 用 ， 也 可 将 叶 片 经 液 氮 速 冻 后 ， -70 冰 箱 保 存 备 用 。6 DNA 提 取 与 检 测6.1 取样微 量 提 取 ， 可 称 取 0.2 0.5g 幼 嫩 叶 片 ； 也 可 按 实 际 检 测 需 求 量 ， 增 加 叶 片 量 ，
7、但 提 取 液 也 按 相 应 比 例 增 加 。6.2 DNA 提 取 方 法采用 CTAB 法 提 取 梨 叶 片 的 基 因 组 DNA， 试 验 步 骤 如 下 ：6.2.1 样 品 研 磨取适量 叶片 加入 快速 液氮 研磨至 粉末 状 ， 在 样品 解 冻前 ， 迅 速转 移至 2ml 离 心管中 ， 并加 DNA 提取 液 3ml， 上 下 颠 倒 混 匀 后 ， 放 入 65 恒 温 水 浴 中 提 取 ， 水 浴 时 间 30-50min， 期 间 每 隔 8-10 分 钟 上 下 轻 轻 颠 倒 混 匀 样 品 。6.2.2 样 品 的 抽 提水 浴 后 取 出 样 品 ，
8、 在 20 下 ， 12000rpm 离 心 15min， 并 将 上 清 液 转 移 到 新 离 心 管 中 ； 等 体 积 加 入 氯 仿 /异 戊 醇 (24： 1)抽 提 ， 颠 倒 混 匀 后 摇 床 平 和 摇 动 15 分 钟 ， 再 次 12000rpm 离心 10min； 将 离 心 管 取 出后， 小 心 吸取 上清 液 移 至新离 心管 中， 再加 入 氯 仿/异 戊醇( 24： 1)抽 提； 如此反 复 23 次(可 室 温 下 操 作 )。6.2.3 DNA 的 沉 淀将 最 终 抽 提 的 液 相 移 至 新 的 离 心 管 中 ， 并 加 入 1/10 体 积 N
9、aAc (3M， pH5.2)， 混 匀 后 ， 加 入 2 倍 体 积 的 无 水 乙 醇 (-20 )， 缓 慢 颠 倒 混 匀 ， 并 于 -20 冰 箱 中 放 置 30min 沉 淀 DNA； 之 后 将 样 品 取 出 ， 于 4 12000rpm 离 心 10min。 小 心 倒 去 上 清 液 ， DNA 沉 淀 则 用 1ml 70 乙 醇 溶 液 清 洗 ， 12000rpm 离 心 5min， 倒 去 乙 醇 溶 液 ， 如 此 反 复 2 次 后 凉 风 吹 干 DNA。6.2.4 RNA 消 化待 管 内 液 体 挥 发 干 并 无 乙 醇 味 时 ， 用 500 l
10、 TE 缓冲 液(pH8 .0)溶解 DNA，加入 2 l RNaseA(10mg/ml) 降解 RNA， 37 水 浴 保 温 60min； 再 用 等 体 积 的 氯 仿 /异 戊 醇 (24： 1)抽 提 ， 4 12000rpm 离心 10min， 小 心 吸 取 上 清 液 到 新 的 1.5ml Eppendorf 管 中 ， 进 行 DNA 的 沉 淀 ， 步 骤 同 第 一 次 DNA 的 沉 淀 。将 吹 干 的 样 品 DNA， 加 入 5-100 l 灭 菌 纯 水 溶 解 DNA， -20 保 存 备 用 。6.3 DNA 检测取 3 l DNA 样 品 在 1.0 A
11、garose 凝 胶 上 电 泳 ， 溴 化 乙 锭 染 色 ， 紫 外 检 测 质 量 ， 基 因 组 DNA 主 带 清 洗 ， 大 小 在 2000bp 以 上 ， 无 RNA 和 蛋 白 杂 质 干 扰 。 电 泳 结 果 在 凝 胶 成 像 系 统 下 拍 照 记 录 。同时可 利用 核酸 定量 分析 仪辅助 检测 ， A260/A280 值 在 1.82. 0， 则为 纯净 的 DNA。 利 用 Nanodrop 微 量 检 测 样 品 的 浓 度 ， 根 据 浓 度 的 实 际 度 数 ， 按 20ng. L-1 稀 释 至 使 用 浓 度 。7 DNA 标 记 的 扩 增 和
12、检 测7.1 方 法 选 择在构建 梨指 纹图 谱过 程中 ， 根据不 同的 种质 资源 选择 合适的 分子 标记 方法 ， 目 前 在果树 上广 泛应 用、 且可靠 性 强 的分 子标 记主 要是 SSR 和 SRAP。 SSR 标 记根据 保守 区域 进行 扩增 ， 共 显性 好， 对于 DNA 纯 度 要 求 低 ； SRAP 标 记 多 态 性 高 ， 操 作 简 单 ， 成 本 相 对 较 低 。 使 用 时 可 以 根 据 实 际 情 况 ， 选 择 其 中 的 一 种 分 子 标 记 类 型 。DB32/T 2089-201237.2 SSR 检 测 体 系SSR 标 记 检 测
13、 体 系 ： 取 模 板 DNA 50 ng， dNTPs 0.2 mmolL-1， Mg2+ 2.5 mmolL-1， 上 下 游 引 物 各 0.3 molL-1， Taq 酶 1.0 U， 反 应总 体积 20 L。 反应程 序为 ： 94 预变 性 3 min， 循环 在 94 40s， 55 5 0s， 72 1min 条 件 下 运 行 39 次 ， 随 后 72 延 伸 10min， 最 后 10 10min。7.3 SRAP 检 测 体 系SRAP 标 记 检 测 体 系 ： 取 模 板 DNA 30 ng， dNTPs 0.2 mmolL-1， Mg2+ 2.0 mmolL-
14、1， 上 下 游 引 物 各 0.2 molL-1， Taq 酶 1.0 U， 反 应 总 体 积 20 L。 反 应 程 序 为 94 预 变 性 5 min， 反 应 前 5 个 循 环 在 94 1 min， 35 1 min， 72 1 min 条 件 下 运 行 ； 随 后 的 30 个 循 环 退 火 温 度 提 高 到 50 ， 最 后 72 延伸 10 min。7.4 产 物 的 检 测扩 增 产 物 利 用 2%琼 脂 糖 或 6%聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 分 离 ， 电 泳 谱 带 在 凝 胶 成 像 系 统 下 观 察 统 计 。8 指 纹 图 谱 的 分 析选
15、择 20 对 扩 增 稳 定 的 标 准 引 物 ， 利 用 标 准 分 析 体 系 ， 对 所 有 品 种 的 遗 传 多 态 性 位 点 进 行 分 析 和 鉴 定 ， 并 获 得 扩 增 谱 带 的 记 录 信 息 。 在 不 同 的 位 点 上 将 有 条 带 记 录 为 1， 无 条 带 记 录 为 0， 并 建 立 所 有 数 据 的 相 似 矩 阵 。应 用 数 据 统 计 对 获 得 的 指 纹 进 行 相 似 性 及 特 异 性 分 析 ， 形 成 不 同 品 种 的 指 纹 图 谱 。 采 用 NTSYS-pc 程 序 ， 最 后 以 非 加 权 数 据 分 析 法 (UPGMA)来 生 成 系 统 树 。9 品 种 鉴 别基于所 建立 的一 定量 的品 种资 源 DNA 指纹 数据 库， 根 据相似 系数 的高 低 判 断所 鉴定的 品种 是否 为相 同 或 不 同 的 品 种 。基 于 与 已 有 品 种 遗 传 信 息 的 相 似 性 分 析 ， 为 品 种 资 源 的 合 理 保 存 提 供 科 学 依 据 。
