1、17721772ICS 65.020.30B 22备 案号 ： DB32江 苏 省 地 方 标 准DB32/T 17722011副猪嗜血杆菌病诊断技术Diagnostic Techniques for Haemophilus parasuis2011-05-06 发布 2011-07-06 实施江 苏 省 质 量 技 术 监 督 局 发 布DB32/T 17722011I前 言为规范副猪嗜血杆菌病的诊断技术，特制定本标准。本标准按GB/T 1.12009标准化工作导则 第 1部分：标准的结构和编写 编制。 本标准由江苏省农业科学院提出。本标准起草单位：江苏省农业科学院。 本 标 准 起 草 人
2、 ： 刘 茂 军 、 邵 国 青 、 周 勇 岐 、 王 海 燕 、 冯 志 新 、 孙 佩 元 、 甘 源 。DB32/T 177220111副猪嗜血杆菌病诊断技术1 范 围本 标准 规定 了副 猪嗜 血杆 菌病 诊断 技术 要求 。 本标准规定的分离鉴定和 PCR法适用于本病的确诊，间接血凝试验适用于大批量样品的普查。2 规范性引用文件下 列 文 件 对 于 本 文 件 的 应 用 是 必 不 可 少 的 。 凡 是 注 日 期 的 引 用 文 件 ， 仅 注 日 期 的 版 本 适 用 于 本 文 件 。 凡 是不 注日 期的 引用 文件 ，其 最新 版本 （包 括所 有的 修订 单）
3、适用 于本 文件 。GB 16548 病害动物和病害动物产品生物安全处理规程GB/T 66822008 分 析 实 验 室 用 水 规 格 和 试 验 方 法NY/T 541 动物疫病实验室检验采样方法3 术语和定义下 列术 语和 定义 适用 于本 文件 。3.1副猪嗜血杆菌病副 猪 嗜 血 杆 菌 病 ， 又 称 格 拉 泽 氏 病 或 革 拉 泽 氏 病 (Glassers disease)， 该 病 由 副 猪 嗜 血 杆 菌（ Haemophilus parasuis, HPs） 引起 ， 可 以影 响各 年龄 段猪 ，主 要在 断奶 前后 和保 育阶 段发 病， 通常 见于58周龄的
4、猪，表现为猪的纤维性多发性浆膜炎、关节炎、胸膜炎和脑膜炎等。4 诊 断据流行病学、临床症状和特征病变可作出初步诊断，典型病变PCR检测病原可确诊。4.1 流行性病学诊断副 猪嗜 血杆 菌只 感染 猪， 感 染 2 周 龄到 4 月 龄的 青年 猪， 主 要在 断奶 前后 和保 育阶 段发 病， 通 常见于 5 周龄8 周龄的猪，发病率一般在 10 % 15 %， 严 重 时 死 亡 率 可 达 到 50 %。 在 敏 感 猪 群 内 ， 副 猪 嗜血杆菌引起的死亡主要发生在幼猪。4.2 临 床 诊 断由 副 猪 嗜 血 杆 菌 引 起 的 急 性 型 疾 病 是 非 特 异 性 的 但 却 是
5、 特 征 性 的 ， 临 床 症 状 包 括 发 热 、 食 欲 不 振和 厌食，严重时可见呼吸困难、发绀、不愿活动、关节肿胀、跛行、运动不协调以及死亡。急 性 发 病 耐 过 猪 可 以 痊 愈 ,但 病 症 严 重 ， 猪 耐 过 后 往 往 表 现 慢 性 病 症 ， 主 要 是 被 毛 粗 乱 、 咳 嗽 、呼 吸 困 难 和 生 长 迟 滞 。 有 些 猪 由 于 发 生 脑 膜 炎 而 表 现 肌 肉 震 颤 、 麻 痹 和 惊 厥 ， 有 些 因 腹 膜 粘 连 而 常 引 起 肠 梗阻。DB32/T 1772201124.3 病 理 变 化肉 眼 可 见 的 损 伤 主 要 是
6、 在 单 个 或 多 个 浆 膜面 ， 可 见 浆 液 性 和 化 脓 性 纤 维 蛋 白 渗 出 物 ， 这 些 浆 膜 包 括 腹 膜 ， 心 包 膜 和 胸 膜 ， 这 些 损 伤 也 可 能 涉 及 脑 膜 和 关 节 表 面 ， 尤 其 是 腕 关 节 和 跗 关 节 。 胸 腹 腔 积 液 或粘 连 ， 关 节 肿 胀 、 关 节 腔 粘 液 增 多 ， 肺 脏 出 血 、 表 面 有 纤 维 素 性 渗 出 物 附 着 ， 全 身 淋 巴 结 水 肿 、 出 血 。 在 显 微 镜 下 观 察 渗 出物 ， 可 见 纤 维 蛋 白 ， 中 性 粒 细 胞 和 较 少 量 的 巨
7、噬 细 胞 。 病 死 猪 及 病 料 应 符 合 按 GB 16548 的 规定 。5 病原学诊断除另有规定，所用试剂均为分析纯，水为符合 GB/T 66822008的灭菌二级水。5.1 病原分离与鉴定5.1.1 材 料 准 备巧 克 力 琼 脂 平 板 ， 鲜 血 琼 脂 平 板 ， TSA固 体 培 养 基 ， TSB液 体 培 养 基 ， 副 猪 嗜 血 杆 菌 标 准 菌 株 ， 细 菌 微量生化鉴定管，灭菌棉拭子等。5.1.2 病 料 采 集按 NY/T 541规定的方法，采集呼吸道分泌物，采取具有特征的肺脏、肝脏、脾脏、胸膜、胸腹腔积 水 、心 包积 液、 心血 、关 节液 和脑
8、 组织 。5.1.3 病 原 分 离采 集 样 品 ， 首 先 在 巧 克 力 琼 脂 平 板 、 TSA固 体 培 养 基 、 鲜 血 琼 脂 平 板 上 分 别 划 线 接 种 ， 37 培 养 48 h72 h以后挑取单个菌落，再进行纯培养并鉴定。细 菌 涂 片 ， 革 兰 氏 染 色 镜检 。 如 果 为 革 兰 氏 阴 性 小 杆 状 或 多 形 性 小 杆 菌 ， 再 进 行 一 次 巧 克 力 琼 脂亚 克隆培养，同时接种鲜血琼脂平板和普通琼脂平板。巧 克 力 琼 脂 平 板 生 长 良 好 ， 而 鲜 血 琼 脂 平 板 和 普 通 琼 脂 平 板 没 有 菌 落 生 成 则
9、菌 株 保 存 待 进 一 步 鉴 定 。5.1.4 病 原 鉴 定5.1.4.1 生 长 特 性 试 验挑 取 被 检 分 离 株 和 副 猪 嗜 血 杆 菌 标 准 株 菌 落 接种 绵 羊 鲜 血 琼 脂 平 板 和 2%胨 琼 脂 平 板 上 ， 再 以 金 黄色 葡萄球菌点种或垂直划线，置37 培养48 h。观 察 葡 萄 球 菌 菌 落 周 围 菌 落 生 成 情 况 ， 如 愈 靠 近 金 黄 色 葡 萄 球 菌 菌 落 生 成 的 半 透 明 菌 落 愈 大 ， 愈 远 的 愈小 ，甚 至不 见菌 落生 长， 且不 出现 溶血 现象 判为 阳性 。5.1.4.2 生 化 实 验
10、培养物接种于添加有NAD的脲酶、氧化酶、吲哚，接触酶、葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、果糖、核糖、 半乳糖、硝酸盐还原酶等细菌微量生化鉴定管，置 37 培养 48 h。按细菌微量生化鉴定管说明书判定。脲 酶 试 验 、 氧 化 酶 试 验 、 吲 哚 试 验 均 阴 性 ， 并 接 触 酶 、 葡 萄 糖 、 麦 芽 糖 、 蔗 糖 、 果 糖 、 核 糖 、 半 乳 糖 、硝 酸盐 还原 试验 均阳 性者 判为 副猪 嗜血 杆菌 阳性 。5.1.4.3 聚合酶链式反应（PCR）DB32/T 177220113按5.2进行操作和判定。5.1.5 结 果 判 定以上实验皆为阳性判为副猪嗜血杆菌。5.2 聚
11、合酶链式反应（PCR）5.2.1 材 料 准 备PCR 引 物 P1 5- GTG ATG AGG AAG GGT GGT GT - 3和 P2 5- GGC TTC GTC ACC CTC TGT - 3，PCR 相关试剂。副猪嗜血杆菌标准菌株 DNA 提取物为阳性对照，水作为阴性对照。高速离心机（10000 r/min）、PCR 仪、电泳仪、水平电泳槽凝胶成像系统（或紫外投射仪）、移 液 器等 仪器 。5.2.2 DNA 模板的制备按 NY/T 541 规定的方法，采集待检猪的病料置于-20保存。取约 1 g 病 料 ， 剪 碎 后 匀 浆 器 加 5 mL水 研 磨 成 糊 状 ， 煮
12、沸 10 min， 高 速 10000 r/min 离 心 5 min， 取 上 清 -20 保 存 备 用 。 另 外 ， 按 GB 16548 规 定处 理待 检猪 。取 可疑 培养 物 10000 r/min 离 心 5 min， 弃 上清 ， 沉 淀以 无菌 水重 悬， 煮 沸 10 min， 高 速 10000 r/min 离 心 5 min，取上清-20 保 存 备 用 。分 离纯 化的 菌株 用接 种环 刮取 2 个 菌落 洗脱 于含 100 L 无 菌水 的离 心管 ， 煮 沸 10 min， 高 速 10000 r/min 离 心 5 min，取上清-20 保 存 备 用 。
13、5.2.3 PCRPCR反 应 体 系 ： 10PCR Buffer 2.5 L， Mg2+（ 25 mM） 1.3 L， P1（ 20 pmol/ L） 1.0 L， P2（20 pmol/L） 1.0 L ，dNTPs（2.5 mM）2.0 L，Taq DNA 聚 合 酶 （ 5 U/L） 0.5 L，模板 2 L 5 L ，加ddH2O至总体积 25 L。 反 应 条 件 ： 94 5 min，94 30 s，59 30 s， 72 45 s，34个循环，72 10 min。5.2.4 电 泳制备1 %琼脂糖凝胶，内加适量溴化乙锭或其替代物，取PCR产物10 L 20 L分别与适量加样
14、缓冲液混合后，加样到鸟叫孔中，9 V/cm恒压下电泳15 min 30 min。 将 电 泳 好 的 凝 胶 放 到 紫 外 投 射 仪 或凝 胶成 像系 统上 观察 结果 。5.2.5 结 果 判 定阳性对照扩增到821 bp条 带 ， 同 时 阴 性 对 照 为 扩 增 到 条 带 时 ， 试 验 成 立 。 在 试 验 结 果 成 立 的 前 提下 ， 如 果 样 品 扩 增 到 821 bp条 带 ， 可 确 认 为 可 疑 培 养 物 或 分 离 纯 化 的 菌 株 副猪嗜血杆菌PCR阳性。6 间接血凝试验（IHA）6.1 材 料 准 备6.1.1 96 孔 V 型（110）有机玻璃
15、反应板、25 L 微量移液器、微量振荡器等。6.1.2 副猪嗜血杆菌纯化灭活抗原、副猪嗜血杆菌标准阳性血清、副猪嗜血杆菌标准阴性血清。6.1.3 致敏红细胞:为副猪嗜血杆菌灭活抗原致敏的绵羊红细胞。DB32/T 1772201146.1.4 稀释剂:含 1%健康兔血清 pH 7.2 PBS。6.2 操 作 方 法6.2.1 血清的处理取 被 检 血 清 0.2 mL于无菌小试管中，56 水 浴 30 min灭活，冷却后加入0.3 mL 2 %戊 二 醛 红 细 胞 悬液，摇匀，置37 水浴3 min，离心后吸出血清供检验用。阳 性血 清、 阴性 血清 的处 理同 被检 血清 。6.2.2 间接
16、血凝试验（IHA）用 微 量 移 液 器 先 向 反 应 板 每 孔 中 加 25 L稀 释 剂 ， 再 向 第 1孔 加 人 25 L已处理好的被检血清，充 分 混 匀 后 ， 吸 取 25 L 加 入第 2孔 ， 依 次 做 倍 比 连 续 稀 释 至 第 6孔 （ 血 清 的 稀 释 倍 数 为 1:2、 1:4、 1:8、 1:16、1:32、1:64），混匀后从第6孔取出25L弃去。向每孔中加入25 L 2 %致 敏 红 细 胞 ， 血 清 的 最 终稀释倍数为 1:4、 1:8、 1:16、 1:32、 1:64、 1:128。同时应设阴、阳性血清对照及致敏红细胞空白对 照。置微型
17、振荡器上震荡30s后，室温静置2 h， 观 察 结 果 。6.3 结 果 判 定6.3.1 成 立 条 件致 敏 红 细 胞 对 照 无 自 凝 现 象 ， 阳 性 对 照 血 清 抗 体 价 1:32；阴性对照血清抗体价 1:16时表明试 验 成立 。6.3.2 判 定 标 准+ + + +: 红 细 胞 100 %凝 集 ， 在 孔 底 凝 集 浓 缩 成 团 ， 面 积 较 大 ；+ + +: 红细胞75 %凝集，在孔底形成较厚层凝集，面积较大，卷边或呈锯齿状；+ +: 红 细 胞 50 %凝 集 ， 其 余 不 凝 集 的 红 细 胞 在 孔 底 中 央 集 中 成 较 大 的 圆 点
18、 ；+: 红细胞25 %凝集，不完全沉于孔底，周围有散在少量的凝集；-: 红 细 胞 呈 点 状 沉 于 孔 底 ， 周 边 光 滑 。6.3.3 判 定被检血清效价大于1:32为阳性；低于1:16为阴性；在1:161:32之间为可疑。7 最 终结 论判 定下列任何情况之一，均可判为副猪嗜血杆菌感染猪： a） 发 病 不 分 年 龄 、 季 节 、 个 体 临 床 表 现 明 显 ， 病 例 解 剖 病 变 典 型 ， 用 第 5章 中 任 何 一 种 实 验 确 诊 为副 猪嗜 血杆 菌阳 性者 ； b） 临 床 症 状 和 发 病 情 况 不详 ， 群 体 解 剖 检 查 病 变 典 型 ， 用 第 5章 中 任 何 一 种 实 验 确 诊 为 副 猪 嗜 血 杆菌阳性者；c）发病情况、临床症状、病理变化不详，如用第5章中任何一种实验确诊为副猪嗜血杆菌阳性者； d）未免疫过副猪嗜血杆菌疫苗，如用第6章中实验确诊为副猪嗜血杆菌抗体阳性者。
