1、生 物 质 转 化 酶 的 改 进 ： 一 个 基 本 的 研 究 视角论文翻译Improving Enzymes For Biomass Conversion: A Basic Research Perspective生 物 质 转 化 酶 的 改 进 ： 一 个 基 本 的 研 究 视 角班纳吉1，约翰S斯科特-克雷格1和乔纳森 D.沃顿1 （1）能源部大湖生物能源研究中心，植物研究实验室，密歇根州立大学，东兰辛，MI 48824，USAJonathan D.沃顿的在线发布时间：2010年1月9日抽 象植物生物质原料转化为可发酵糖酶的成本是一个实用的纤维素乙醇产业发展的一大障碍。私人产业界
2、，学术界和政府实验室正在积极追求的目标降低成本的材料，如玉米秸秆生物质转化成葡萄糖，木糖，和其他糖酶优化研究。部能源大湖生物能源研究中心的主持下，我们采取几种方法来解决这个问题，包括优越的关键酶，蛋白质工程，在植物中表达和高层次的“生物勘探” 。一个特别的重点是发展合成酶的混合物，以了解已知的酶的数百重要在什么比例。一组核心包括切纤维素酶，内切葡聚糖-葡萄糖苷酶，木聚糖酶和 -葡萄糖苷酶。配件的酶包括酯酶，蛋白酶，非水解蛋白质和糖基水解酶，裂解不太频繁的植物细胞壁中发现的化学联系。关键词纤维素 半纤维素酶 木聚糖酶 氨纤维膨胀 玉米秸秆 生物能源 木糖苷酶，葡萄糖苷酶，纤维二糖水解酶 内切葡聚
3、糖酶 木霉 曲霉介 绍从木质纤维素材料液体运输燃料被看作是一个重要的潜在替代石油 35 。预计纤维素乙醇有利于温室气体的分布，减轻对外国石油的依赖，弥补全球石油储量减少，并提供了一个经济的推动作用 16 。最受欢迎的木质纤维素生物质转化为乙醇或其他液体燃料的战略涉及多糖的酶催化的解聚反应。然而，酶本质上是昂贵的，因为它们必须产生的生活系统，在热力学上是不稳定的。由于木质纤维素的化学和物理顽抗，酶负荷高降解率是必要的，以合理的。酶的最终成本是阻碍发展的一种经济可行的纤维素乙醇产业 40 的主要开支之一。生 物 质 转 化 酶生物化学和植物木质纤维素材料的化学和微生物酶，解聚，经常被评论 12，4
4、0， 58 。它提醒读者的木素纤维素材料转化为可发酵糖的速率和效率的函数开始的生物质材料，预处理，介于6至60的酶活性的参与，和的定义中的“可发酵糖” 。不同的原料（木材，玉米秸秆，甘蔗渣等）受到不同预处理含有不同浓度（变量）不同的糖。考虑到所期望的最终产品的解聚，野生型的酿酒酵母（酵母）发酵葡萄糖但不木糖， ，而木糖和纤维寡糖是可以接受的其他天然或工程微生物 28，51 。因此，生物质源，预处理，酶混合物，发酵微生物是相互依存的变量。从研究最为透彻的酶系统的角度来看，结晶纤维素的解聚作用的心脏包括纤维二糖水解酶（CBH），内切 1，4 -葡聚糖酶（EG）和 -葡萄糖苷酶（BG）。半纤维素分解
5、的酶学我们的知识是那么广泛。而纤维素是化学均匀，可在高纯度的形式，半纤维素比较丰富，植物物种和组织之间在一个单一的工厂。双子叶植物的半纤维素，例如，含有岩藻糖，O-乙酰化的半乳糖，1，6 -木糖取代的 1，4 -葡聚糖 10，19，46 。酶活性，有必要在双子叶植物的半纤维素降解的联系，因此，包括 1，4 -葡聚糖酶（可专门用于半纤维素，例如木葡聚糖），-岩藻糖苷酶，-葡糖苷酸酶，1,4-木聚糖酶，-和 -木糖苷酶，-阿拉伯糖苷酶和酯酶的几类。果胶是解构果胶裂解酶，果胶酶，果胶,甲基酯酶，以及复杂的果胶（如鼠李 II）的情况下，可能是其他酶。对比草本双子叶植物，谷类中含有较低水平的果胶，更高水
6、平的glucurononoarabinoxylan，和酯化的酚醛树脂。这些成分的解聚的木聚糖酶，1，2 -和 1，3 -阿拉伯糖苷酶，-葡糖苷酸酶，和酯酶 55 。谷物也含有的混合联动葡聚糖（MLG），局部地区发现高浓度的一些组织，如幼苗和胚乳墙。后者是干燥酒糟（DDG）的主要组成部分，玉米淀粉乙醇生产的副产品。MLG 水解的一些常规的纤维素酶（即，1，4 -葡聚糖酶），也可以由专门的酶（称为混合联葡聚糖酶，-葡聚糖酶，或地衣酶） 。除了 直接作用于植物细胞壁多糖的共价键的酶，间接发挥作用的酶，也可能是重要的纤维素分解。这种酶有三类。第一个非酶蛋白质，有助于墙松动，如膨大和真菌和细菌的同源物
7、52 。第二组，可能会对间接关键酶是那些降解非糖苷的壁部结构构件，如木质素和蛋白质，从而便利的糖基水解酶 44 。第三组可能是潜在的重要的辅助酶降解的小分子物质，预处理释放，抑制降解酶的核心或下游发酵步骤 6，7，31 。生 物 酶 的 研 究 景 观目前生物质解构（以及对于大多数其他工业应用）的酶是来自于真菌，特别是木霉属的物种（其有性阶段被称为肉座菌属）和曲霉（有性阶段翘孢霉属）的。一些酶制剂，主要用于食品加工，从有丝分裂的子囊菌腐质霉属或从种芽孢杆菌的细菌，如。20 世纪 50年代以来，里氏木霉已遭受多轮菌种改良增强纤维素酶生产 41 。减少降解物阻遏来自增强的纤维素酶生产 23 ，减少
8、蛋白酶的活性 42 ，简单的营养原料和廉价的纤维素酶诱导剂的高密度的方法来种植木耳的发展。目前蛋白生产 T. 里氏木霉据报道，接近 100克/升，并要求最小的后发酵处理。最突出的方面，目前的研究环境对生物酶是其集中在私营部门，尤其是在两个主要的工业酶制剂公司，杰能科和诺维信。这种状况，明确支持在美国能源署（DOE）的生物能源研究的主要资助者。在过去的10年中，已经有两个大的方案，在这些和其他酶公司资助研究。2001年，诺维信和杰能科赠款15亿美元和17亿美元，分别。这笔资金已经指出，导致20 - 30倍，减少酶的成本生产乙醇酸处理玉米秸秆 53 ;http:/www.nrel.gov/awar
9、ds/2004hrvtd.html？打印 。但是，这些数据还没有被发表在同行评审期刊，因此，这种说法无法进行验证。在接受记者采访时发表于2009年6月，诺维信的发言人给酶的目前成本“约为1美元/加仑” 9，这意味着联邦政府资助的研究之前的成本是20-30美元/加仑。显然，在这方面有很大的不确定性。2008年，新一轮3380万美元的资金用于酶研究分布在四家公司诺维信，杰能科，帝斯曼创新中心，Verenium 公司（http:/www.energy.gov/print/6015.htm） 。诺维信和杰能科是丹麦公司，总部设在荷兰帝斯曼创新。这笔资金上的合作伙伴包括三个能源部国家实验室（NREL，西
10、北太平洋国家实验室和桑迪亚国家实验室）和阿文戈亚生物能源新技术（一家西班牙公司） 。2008年美国能源部提案征集的一个重要特点是要求所有得奖使用稀酸处理玉米秸秆作为实验原料。酸预处理能够溶解大多数植物细胞壁中，被丢弃的（从而失去了一个显着的碳量） ，或中和，并重新加入到不溶性级分（主要是纤维素） ，或独立地进行处理的半纤维素。从效率的角度来看，这些战略都没有理想。有几种技术，是强有力的竞争者，成为未来的预处理方法的选择（例如，离子液体和碱性化学品的几种类型的） 。酶的混合物，将需要为每个被重新优化。虽然不能否认它的主要酶公司有巨大的工业酶制剂在各方面的专业知识，有这么多美元的投资在他们现有的研
11、究有两个潜在的缺点。首先，大小在一个特定区域的生物能源研究的补助金，使人们难以对其他实验室的竞争（即小公司，大学，和美国能源部国家实验室的几十万美元被认为是重要的资金，场地） 。其次，酶公司没有义务公布其结果，其实这是不符合他们的最佳利益，因为其知识产权作为商业秘密（也就是说，即使在专利文献中披露）举行。已经进入了公共部门的数据非常少，导致从美国能源部的资金（2001年）的第一轮和第二轮（2008年）的结果，也可能会受到严密举行。缺乏问责制，同行评审，或公共访问可以合理地预期，作为一个强大的克制纤维素乙醇未来在这个关键领域的进展。这笔资金的情况，甚至不知道公司所追求的实验途径，简单的存在可以推
12、定有窒息作用，对其他地区的研究。有关的酶被美国能源部资助私营部门进行的研究，我们知道什么？根据新闻稿，专利，在科学会议上举行会谈，以及散布在英特网上的演示文稿，公司正在采取多种方法来降低成本的酶。这些措施包括筛选新的生物（主要是真菌）的高级版本目前酶和酶与现有的商业酶协同作用，继续通过常规和分子诱变，通过蛋白质工程和定向进化，酶改善和效率改善工业菌种改良规模产酶 1，11，40，48，49，56 。目 前 的 策 略 ， 以 提 高 酶这是一个给定的酶是太昂贵。为降低成本10 - 100倍的潜力是什么？像任何工业的过程中，降低成本可以来自工程和营销解决方案，如更节能发酵罐或发酵副产品销售。在这
13、里，我们将讨论限制考虑降酶成本，涉及的微生物或酶的操纵方式。只要酶的蛋白质质量的基础上销售，这些策略的总体目标是增加的比活性的混合物，获得相当于发酵糖产量较少的蛋白质。应变方面的改进，T. 里氏木霉已经进行了广泛的改进。这是很难看到蛋白质如何产生大于100克/升，可以实现。然而，进一步改善菌株可能集中在剪裁的蛋白质比例，特别是生物质基材/预处理组合或由遗传消除分泌酶是没有必要的。如果真菌发酵成为酶降低成本的限制因素，在其他系统中的酶的生产是可能的。农业提供了巨大的植物蛋白质，每亩的产量。已产生一些细胞壁降解酶在植物中，例如，细菌内切葡聚糖酶和真菌纤维二糖水解，几个初创公司是基于这一技术 22，
14、64 。酶可以一起产生在一个单一的植物，或单独，与现有技术的可溶性蛋白萃取。可以有针对性的质外体酶，空泡，或质。可以调节酶的基因，使他们的表达的响应无偿诱导剂，或在一个特定的发育阶段，例如，在衰老 58 。另一种策略，以提高产生了很大兴趣的酶是蛋白质工程。在该策略中的一种酶的三维结构引导的氨基酸残基，如特定的活动或热稳定性影响的某些属性的识别和修改。一些证明原则研究表明，这种做法是可行的20，47，62 ，但目前尚不清楚最终成功，那是因为在特定的生物酶的活性理化限制不能很好地明白了。甲真菌 CBH的特定活性高的在本质上不知道，也许是从未出现通过自然选择的过程中，因为它不只是为热力学可能。对酶行
15、为进化的极限知名的例子包括低亲和力的二磷酸核酮糖羧化酶对 CO 2的事实，只有少数微生物，几乎完全担子菌的真菌，已经演变降解木质素的能力 29 。此外，除了是必须考虑的，但可以是困难的在体外测定的比活和热耐受性酶具有临界性质。例如，除了催化特定的化学反应，酶，必须有效地翻译和分泌，能够抵抗蛋白酶，与其他酶协同行事，并具有较低的产品和反馈抑制。人们可以很容易想象，一个“改良”的酶，根据模型上的衬底上的隔离检测，可能会表现不佳，在一个真实世界的情况 62 。考虑到自然选择进化的力量以惊人的性能和大量的蛋白质和微生物的代谢多样性高，许多研究人员已经把探索更好的酶的性质。这种“生物勘探”可以或多或少随
16、机的，或进化或生态的原则可以遵循。它可以采取隔离微生物生长生物质基材，采矿数据库已知的酶基因的克隆变种的基因组测序，通过聚合酶链反应（PCR） ，或寻找新的基因，通过宏基因组学的形式。一种方法利用随机克隆到表达宿主，所产生的转化，然后被筛选直接在板中含有纤维素或其他模型生物量基板（D 米德和 P Brumm，Lucigen ，公司，个人通讯） 。可用于生物勘探寻找更好的替代已知的重要的酶或酶（例如，CBH和 EG） ，增强（“协同作用” ）与现有的商业纤维素酶的混合物。富有想象力的生物勘探是怎么回事，在许多学术，政府和私人实验室，探索不同的热带堆肥，白蚁肠道，蛀木蜂，和温泉生态龛。然而，尽管生
17、物勘探和 DNA测序技术便于广泛的吸引力，基因的发现是目前没有一个限制因素，在寻找新的，更好的酶。数以千计的基因注释为“纤维素酶”是已经存在的公共数据库中，还有数千新兴每月从高通量测序设施。相反，主要的限制因素，在目前和未来，是由这些基因编码的生化活动能力评估。不幸的是，没有可靠的方法告诉一个“更好”的基础上，其预测的氨基酸序列的纤维素酶。唯一可靠的方法来评估一个新的纤维素酶是产生并测试它在一个现实的生化检测。未 来 的 酶 ： 细 菌 或 真 菌 ？到今天为止，大多数酶降解木质纤维素的开发和测试是由真菌。一个合理的问题是多少额外的进展可能与真菌的酶或前进的方向是否需要新的原核范式。这种观点体
18、现在影响力的美国能源部的报告，“打破纤维素乙醇的生物屏障”，其中纤维素酶体的细菌进行了广泛的讨论（98 次提及），而木霉只提到了两次，两次资格由短语“短期内” 60 。但是，已出版文学仍然是不可知的细菌酶是否优于真菌，无论是纤维素酶体（“络合的”）（一个相关的问题）酶系统优于“非混合”系统 63 。免络合的酶系统被发现在原核生物和真菌，虽然在这两种情况下，被发现仅在厌氧生物络合的系统 14，37，60 。至今为止只有几面侧的细菌和真菌酶的比较。欧文等人。 24 得出的结论是，外切葡聚糖酶 E3和 E6来自褐色热单胞细菌相当于约CBH1的和 CBH2 瑞氏木霉的测定时的滤纸上，和 T。FUSCA
19、 纤维素酶E3和 T. 在功能上等同增效实验里氏木霉 CBH2的。Johnson 等人。 26 得出的结论是无细胞嗜热梭菌的纤维素酶制剂媲美的活动 T. 里氏木霉，但具有不同的温度和最适 pH。吴和 Zeikus 43 研究发现，胞外纤维素酶的活性 C. 嗜热是一个半主动为 T。里氏木霉。这些研究并不支持这一结论优于真菌的细菌酶。但是，该结论的事实，即必须进行回火下的比较研究 嗜热早发现纤维素酶，因此比较“无细胞”准备有可能把 C. 热纤维处于劣势 5 。作为一个潜在的将来更好的酶源对真菌有一种说法是其相对较低的代谢和生态多样性与原核生物相比。乍一看，丝状真菌（至少子囊菌）一整套细胞壁活性酶对
20、方似乎颇为相似。大多数真菌（真菌在酵母菌亚门如属黑粉菌，蜡蘑，和鹅物种的共生或活体营养担子除外），有一个庞大而重叠的品种细胞壁活性酶（通常 150 糖基水解酶） 38，42 。这可以作为一个论点，即“一木耳是另一个好”。另一方面，也有有理由相信，许多附加的酶仍然被发现真菌，均优于形式的当前已知的酶以及酶具有新颖结构和活动。例如，一些细胞壁活性酶在真菌，例如钒氯过氧化物（主要限制的子囊真菌类 /子囊菌纲 ）的煤层气（至今发现，只有在禾谷镰刀菌基因标识符 FG10004 ，果胶裂解酶）的分类分布窄，果胶甲酯酶催化结构域（在少数真菌，包括禾谷镰刀菌 ; FG04439）和因子（仅限几个物种的在的散囊
21、菌肉座菌目）的。另一个事实点什么人可以称之为“神秘的”多样性是低水平的同源性（氨基酸身份）之间同一类酶真菌之间。例如，最好的比赛 T. 里氏木霉 CBH1（Cel7A）在非冗余数据库（木霉外）有 65的氨基酸身份，提高那些 35不同的氨基酸的意义是什么的问题。作为一个例子，真菌纤维素分解到我们的理解，不断贡献新的见解如何，最近的研究表明褐腐，木耳 Postia胎盘（界门担子菌纲多孔菌）的基因组中有一个糖基水解酶的数量减少与其他真菌相比， 39 。部分由于这个原因，它一直推测， P. 胎盘降解纤维素的氧化机制，类似于白腐真菌如白腐真菌降解木质素（即芬顿化学和强扩散氧化剂生产） 29 。另一个新的
22、真菌范式是由厌氧真菌（界门厌氧真菌门） ，其中组织他们的墙活 性酶的纤维素酶体样结构 14 。Orpinomyces SP 表示。菌株 PC-2使得一些纤维素酶，GH 家庭所有成员的5和6，以及木聚糖酶，-葡萄糖苷酶，地衣多糖，和至少两个酯酶 37 。还有许多要了解组织的基因组，生物合成，组装和真菌纤维素酶的活性。任何讨论未来的酶模型的相关性的清单的事实，即在自然木素纤维素的分解不是由无细胞提取物，而是由生物体组织成复杂的社区。一种含义是完整的有机体纤维素的增长率可能不会反映当减小到无细胞系统的潜在贡献。也就是说，我们不应该期望纤维素和体外对纤维素酶的活性在体内生长良好的相关性。这就牵涉到搜索
23、新酶在有机体生物勘探水平，例如，某些真菌（如丝状子囊菌）通常更快速增长的文化比别人（如鳃担子） ，即使它们的基因组表明，它们都降解木质纤维素具有较高的遗传潜力。不幸的是，即使担子菌门显然会发现，但在任何其它生物（即，由白腐金孢属的 P.胎盘和木质素的纤维素的氧化降解）的木质纤维素的能力，其生长缓慢阻碍生物勘探在这门。有一些证据表明，对部分降解生物降解木质纤维素在体内需要代谢活跃，并不能完全复制的无细胞制剂。P. 胎盘，例如，有各种各样的酶，如铁通透，三价铁还原酶，细胞色素 P450，和奎尼酸，可能参与木素纤维素降解的转运，但细胞质或膜结合。这样的酶可以是用于产生的胞外酶为底物的氧化剂或调解的关
24、键。即使是充分研究的非混合系统，如 T。里氏木霉和好氧性细菌，我们知道一点仍然附着的细胞，即细胞内，绑定到质膜上，或附着到细胞壁的酶，参与。一个悬而未决的，但有趣的方面未复合系统，如 T. 里氏木霉的氧化反应的作用。T. 里氏木霉分泌少量的氧化还原酶 38，42 ，尚未有报道氧的存在下刺激纤维素降解，无细胞的酶制剂，T. 里氏木霉和其它真菌 15 。人们普遍木质纤维素乙醇的未来在于综合生物加工（CBP） ，也就是酶的生产，并组合成一个单一的微生物生产乙醇的 61 。在这种情况下，可能是细菌酶在原核 CBP微生物会更好地工作（例如，运动发酵单胞菌或三杆菌，真菌酶，将更好地工作在 CBP的基因的真
25、核微生物（如酿酒酵母，树干毕赤酵母，或瑞氏木霉） 61 。因此，很可能是需要良好的原核以及良好的真核细胞的酶，这取决于它们的目的。配 件 酶 的 重 要 性虽然目前有一些正在出售生物能源应用的酶制剂，它们是高度相似的活动和组成。这是因为，根据美国能源部的任务（见上文） ，他们已酸预处理玉米秸秆进行了优化。然而，生物能源的景观，将来可能会包括多个原料和多种化学预处理，并因此将需要许多不同的酶鸡尾酒。玉米叶，玉米棒子，玉米茎多糖和木质素组合物 3 中显着不同。DDG，而目前由于粮食乙醇生产大量供应，这是有别于其他地区的玉米植株多糖轮廓。芒草和柳枝，虽然玉米墙组成，有量化的差异，和所有三个从双子叶或
26、针叶木本植物 46 有很大的不同。有重大分歧，多糖和单糖，因此受到不同预处理的生物质原料组成，例如，酸，但不是基础，剥离了大部分半纤维素。定制的酶混合物，未来将可能从目前的混合物不同的方法之一是不是主要集中在核心纤维素酶和木聚糖酶，而在其他无数的“附件”的酶，作用于植物细胞壁中发现了较丰富的联系。配件可包括酶的重要性相关相关黑曲酶，葡聚糖酶，裂解酶，果胶酶，和几种类型的酯酶 8 。所有这些都是已知的分泌的木素纤维素降解真菌如 T。的里氏 42 。丝状真菌的非酶蛋白（例如，因子）和功能未知的蛋白质（例如，预测的糖基水解酶）分泌一些。植物细胞壁中含有显着量的蛋白质，如木葡聚糖内切转糖苷酶伸展蛋白和
27、阿拉伯半乳聚糖丰富的糖蛋白，蛋白酶，因此可能有助于高效生物质转化（即使他们已设计出商业瑞氏木霉菌株） 42，53 。丝状真菌的一些（但不是瑞氏木霉）产生的氧化还原酶，如漆酶，木质素过氧化物酶，植物细胞壁多糖和木质素 29，39 中的氧化解聚合作。这些酶可能增加的效率是标准的糖基水解酶的真菌如 T. 里氏木霉，无论是通过提供另一种方式来切割多糖联系，或使多糖更容易。未 来 酶 的 研 究 ： 定 义 酶 的 混 合 物在我们看来，有两个迫切的需求，在生物酶的研究。首先是要提高我们的理解是至关重要的解构纤维素酶或蛋白质。所有的木素纤维素降解微生物分泌的许多其他蛋白质的重要性，而这是很好理解纤维素和
28、木聚糖转化为葡萄糖和木糖，核心纤维素酶和木聚糖酶是必不可少的，仍是未知的。这方面的知识是必不可少的指导酶生物勘探，工程设计和生产的植（图1） 。图 1计划显示了一组核心的核心重要性，改善生物酶由木质纤维素的微生物分泌的蛋白质纤维素分解实际参与有系统的理解有一些额外的后果。例如，它也导致不重要的酶识别，消除从基因组的一种酶的生产主机，将有效地提高酶的特定活动。的另一个分枝来自的事实，那就是频繁的酶和底物的丰度之间的关系的重要性不是简单的，也不是一个简单的催化活性在体外和体内的对应关系。有许多可能的原因。人们可以试图预测根据我们的知识，细胞壁的的同源化学联系的存在下的降解木质纤维素的酶是必要的，并
29、且甚至可以大胆地根据特定联动的丰度的定量预测。然而，许多酶有多个活动（例如，一些 1,4-木聚糖酶切割 1,4-葡聚糖） ，和其他人没有得到准确的特点（他们的名字反映了基板用于净化，并不代表其在体内的活动） 。一些蛋白质有没有已知的活动共价键（例如，因子）的，而另一些可能会出现不成比例的重要，因为他们的基板掩盖其他酶的底物。有些酶可能当存在于合成底物的某些联系，但工作是无法接近那些相同的债券，在木质纤维素范围内。总的来说，这些因素可以混淆我们的预测能力是必要的有效的纤维素解构酶和蛋白质。唯一可靠的方法来确定一种特定的蛋白质的贡献，是能够添加或删除它，使用一个真实的木质纤维基片结合，来控制它的复
30、杂混合物中的存在。另一个研究个别酶的作用降解木质纤维素的衍生物，从而我们可以学习的催化功能，所以具体的化学键，是非常重要的纤维素解构。该信息可以被用来引导力度，培育更好的生物质发电厂，并设计出更有效的预处理化学。第二个关键酶的研究需要有一种方法来评估新的替代酶的现实途径。例如，给定 CBH是必不可少的一部分，任何酶混合，自然希望找到（或合成）最好的 CBH。但是，我们怎么会知道，如果一个CBH比另一种更好呢？（为了简化讨论，我们将限制“更好”意味着更高的具体标准条件下的活性蛋白酶性，热稳定性，或者涂改的最佳 pH值，虽然可能会更相关） 。现在，人们普遍认识到：（1）单组分检测不捕获重要的酶的功
31、能，例如协同作用的程度，及（2）的基础上合成的底物（如对 - 硝基苯酚的糖或纯的纤维素）的检测并不反映行为针对真正的基材如原生木质纤维素预处理。这些限制，使其难以评估策略设计新的酶（改进） 。正如前面讨论的，已经有成千上万的纤维素酶，木聚糖酶，等，在公共序列数据库中，但没有可靠的方法，实际组合在现实的衬底上与其他需要的酶的酶测定，以确定是否一种酶更好或比另一个。为了解决上面提出的两个问题，我们的实验室正在建设以定义必要的木质纤维素的活动和他们的最佳比例（图 1）的合成酶混合物的方法 。此前，已经有一些尝试来创建和测试用于这些目的的混合物。超越纤维素降解为葡萄糖，即大多数工作一直没有进展，但与现
32、实的木质纤维基材，也不糖葡萄糖以外的处理。Walker 等人。59 比较混合物的 CBH，EG，BG 从混合细菌和真菌来源的纤维素（微晶纤维素）为底物，使用。一个优化的混合物仍然不如粗 T. 里氏木霉准备，导致作者得出结论， “额外的纤维素需要” 。欧文等人。 24 6纤维素酶相比，除了有和没有从 T.的 CBH1 CBH2 从木聚糖酶的放线菌褐色热单胞纯化 里氏木霉。混合物含有 6个组件。T. FUSCA外切葡聚糖酶 （E3）和 T. 里氏木霉 CBH2是相当于混合物。细菌 E3自己，有些较不活跃的两个真菌 CBH会对羧甲基纤维素，纤维素肿，或滤纸上。所有六个 T.的混合物 FUSCA纤维素
33、相当于原油 T.fusca的混合物，但此外，T. 里氏木霉 CBH1增加另外 67的活性。Kim 等人。 30 用相同酶工作，但使用因子实验设计优化比率。regard 等。 50 优化比四个 T。里氏木霉酶（两个 CBH会对和两个环境产品） 。然而，这是通过以下方式获得，因为酶的米曲霉（曲霉属真菌 hrp基因）或镰刀菌的表达，并没有的纯度的纯化方案或证据，难以评价其结果。这些真菌都将分泌的纤维素酶类似的 T. 里氏木霉。关于合成酶混合物，一些最有趣的研究仅适用于非同行评审的专利文献。Hill 等人。 21 优化 T.的混合物 里氏木霉纤维素酶降解酸预处理麦草。其基准的共混物为 57CBH1 序
34、列（基因库CAA49596） ，29CBH2（P07987） ，7EG1（AAA34212） ，和7EG2（AAA34213） 。优化的比例能够提高 10-15的活动。虽然这项工作的重点是两个 CBH会对和两个环境产品的的优化，这些酶组合将不会释放出单个葡萄糖，除非加入战场。作者指出，他们从黑曲霉也加入战场，但没有迹象表明其纯度。A.标准 尼日尔战场准备的诺维信公司 188在许多实验室使用含有许多污染酶的活动，包括纤维素。如果是这样的 Hill等人所使用的 BG。21 ，然后以他们的结果是更复杂的。在随后的从同一组中，Scott 等人的专利申请。 54 附件酶 CIP1（基因库登录 AAP57
35、751） ，Cel61A（CAA71999） ，和因子（CAB92328）时，添加到核心酶测试的组合。得到约 35的改进。美 国 能 源 部 大 湖 生 物 能 源 研 究 中 心 在 酶 研 究 进 展鉴于 T. 里氏木霉是一种高效纤维素降解菌（虽然不一定是最好的） ，它感兴趣的是知道什么蛋白质分泌。要回答这个问题，我们分析了由十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和液相色谱-质谱 T所分泌的蛋白质 里氏木霉 RUT-C30上生长时氨纤维膨胀（AFEX）处理后的玉米秸秆 42 。与此同时，我们在商业的“纤维素”的准备（SPEZYME CP）的蛋白质进行了分析。据我们所知，这是首
36、次发表的蛋白质组学分析 T. 里氏木霉分泌组要完整的基因组序列的基础上 38 。可以得出几个结论从这种分析，并从比较的两个 T。里氏木霉制剂。首先，分泌组是复杂的，含有至少为80的蛋白质。在这方面，它是类似的其他子囊菌的 45 。这个数字是一个保守的估计，95的概率截止（脚手架，蛋白质组软件公司，俄勒冈州波特兰，美国） 。在90的概率，可以检测到234蛋白。其次，商业和“自制”的准备工作是相当类似的，尽管事实上，一个是从一个高度工业株生长在工业条件下，从“原始”所选菌株生长在实验室中对玉米秸秆和其他。有没有重大的质的差异（除蛋白酶，见下文） ，只有少数蛋白质的相对丰度显着不同（例如，木聚糖酶3
37、 BAA89465和 -木糖苷酶CAA93248） 。SPEZYME CP从任何其他有机体中没有的蛋白质，这表明商业生产菌株 T。里氏木霉用来做 SPEZYME CP尚未与外源基因的遗传工程（至少目前还没有） 。最大的定性的区别SPEZYME CP和 RUT-C30是五个商业纤维素丰富的蛋白酶缺乏。编码该蛋白酶的基因已被有意进行变异，在商业生产菌株，以提高稳定性的商业化的产品，据我们所知，尚未发布本技术的进步，这是最简单的解释。第三，虽然如预期，糖基水解酶主导两种制剂中的丰度和多样性，T. 里氏木霉分泌许多其它细胞壁活性蛋白，包括碳水化合物酯酶，蛋白酶，和非酶促的或未知的蛋白质，如因子和CIP
38、（它们都包含建立信任措施） 。在一些真菌如 P. 黄孢原毛平革菌中，只有一个假定的氧化还原酶是存在于分泌组的 T。的里氏 42 。我们的实验室正在使用这些蛋白质组的结果最小的酶，合成一套指导施工。我们的目标是产生的混合物以及 SPEZYME CP或其他商业纤维素酶，但在较低的酶量，可以执行的，通过优化所必需的酶的比率，通过省略不必要的蛋白质。有好几个因素指导我们在我们选择的酶构成的合成集。首先，我们认为这是最好选择从一个单一的有机体任何酶酶的相互作用，可能发生的理由是，将有利于共同进化的蛋白质之间的协同酶。其次，我们选择开始的酶里氏木霉的，因为我们知道其酶的生化功能，更详细地，比其他任何单一生
39、物体（细菌或真菌） 。这一点是特别重要的，因为为了使用大部分其他生物的酶，必须推导出函数直向，进行显着的风险。考虑真菌（通常低于60）的同源蛋白质的氨基酸之间的身份的多样性和低的水平，这似乎是审慎的选择酶的生化功能已被实验证实。作为一个例子，如何扣除直向功能可能会产生误导，最重要的 GH家庭3酶的构巢曲霉（其中有20）可能不切割纤维二糖，GH 系列3 吨的主导酶 里氏木霉。这是不可能的，以确定哪些 A。功能性纤维二糖酶构巢曲霉基因编码序列 4，42，以及未发表的结果） 。第三，虽然 T。里氏木霉有较少的糖基水解酶基因比其他一些子囊菌 42 ，它从所有已知的主要，重要的细胞壁降解酶的家庭至少有一
40、个基因具有良好的代表性。T.缺乏 里氏木霉在整体数量的糖基水解酶，主要是由于在的糖苷水解酶家庭43和61的基因的数量和很强的还原性没有冗余 GH家庭51（主要含 -阿拉伯糖）和 GH系列53（内 1 ,4-galactanases 的） 42 。在这条线的研究实验主要挑战是获得足够数量的高纯度酶的难度。以前发表的研究报告已获得纯酶在几个方面，包括商业纤维素酶制剂的净化，从源头上真菌生长在房子或由其他丝状真菌的异源表达。2004年第 z1期评定许多研究是很困难的，因为他们往往 不提供纯度的证据，并在某些情况下，所使用的酶的纯化方法有关的信息。发表的报告数量惊人的不表明蛋白质定量方法，或者，如果该
41、方法是，什么样的蛋白质作为标准。如果没有准确的信息的纯度和具体活动，这是不可能的实验室之间的结果进行比较。尽管在基因表达和蛋白质纯化的重大进展，但仍然具有挑战性，使足够数量的高纯度的酶，即，它是昂贵的。正如许多其他研究人员已经发现，生产纯蛋白质技术上并不琐碎，无论是从商业纤维素酶制剂通过常规的蛋白质纯化，异源表达，或在体外 18 。蛋白质可以直接纯化，由商业纤维素酶制剂，它具有高的蛋白浓度（100毫克/毫升） 17 。然而，纯化变得越来越困难过去最丰富的酶（CBH1，EG，EX，等） 。异源表达宿主，如巴斯德毕赤酵母，大肠埃希氏菌，或 S。酵母是有吸引力的，特别是因为它们具有较低的背景潜在干扰
42、活动 13 。许多的真菌糖基水解酶和其他蛋白质中成功表达，P. 酵母 例如，25，32， 36 。有两个问题与纯化从本地源和在异源系统中表达，即糖基化作用的异质性，异常糖基化，分 别为（其他翻译后修饰，也可以复杂化的问题，请参阅拉帕莱宁等人 33 ）相关联。许多分泌性真菌蛋白的糖基化在本质上是异质的，妨碍了有效的纯化方法，如离子交换。例如，T。里氏木霉 EX2（基因库登录 AAB29346）过度表达 T. 里氏木霉在十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳运行紧张的双峰，但分成阴离子交换色谱（未公布结果） 12峰。蛋白亚型的差异，针对此行为没有被确定，虽然在此相同的酶的早期的工作表明，产生自然的异质性
43、，一部分是由谷氨酰胺脱氨作用 33 。某些异源宿主产生的酶异常糖基化，例如，酵母和 P. 酵母。这可以改善所使用的糖基化突变体 20 。异常糖基化关键酶特性活性，蛋白质折叠，分泌效率，稳定性，溶解性，最适 pH值，与其他蛋白质的相互作用可能产生不利影响的忧虑，使得同源表达更具吸引力。同源表达（即，在里氏木霉本身）的主要问题是由内源性的糖基水解酶和其它分泌酶的污染。这可避免由工程的标记，如他的6成的蛋白质，它可以被用于与一个单一的镍树脂上的色谱步骤纯化。从主要的酶，以避免污染的另一种方法是使用一个基因敲除菌株作为宿主。一株里氏木霉的缺少的两个主要 CBH会对两个主要的环境产品已被用于这一目的 2
44、7 。在我们自己的实验中，我们发现两个 P. 酵母和 T. 里氏木霉是合理的中等规模的（10-20毫克）生产高纯度酶主机。现在，我们正在贴现 P.异常糖基化的潜在问题 酵母。我们有此决定于两个因素：第一，其实有报道非常少，糖基化活动有很大不同，至少在体外。第二，有没有这样的东西作为“正常的”糖基化，糖基化 T. 里氏木霉，例如，取决于在两个菌株和生长条件 57 。因此，一个酶（如 CBH1）从不同的 T。里氏木霉菌株不是严格相同的酶。在初步实验中，我们的重点和优化的“核心”设置，可以用来找到更好的替代酶和作为一个平台，以测试配件酶（图 1） 。一组核心的理由是，如果没有这些酶至少，没有显着释放
45、的游离葡萄糖或木糖有望从任何木质纤维基板。我们的核心集包括一个纤维二糖水解酶（CBH，基因库登录 CAA49596） ，其中内切葡聚糖酶（EG AAA34212） ，-葡萄糖苷酶（BG AAA18473） ，一个内切木聚糖酶（EX BAA89465） ，-木糖苷酶（BX，CAA93248） 。所有这些都是 T所分泌产生的最丰富的蛋白质 里氏木霉生长时，荣辉处理玉米秸秆 42 。成立一个平台，优化酶混合物，可以使用机器人液体处理和统计实验设计，优化一套核心，针对不同的条件，如替代原料和替代预处理。最令我们感兴趣的是利用该平台的测试替代的核心酶（即找到更好的 CBH1，EG 等替代）和测试附件的核
46、心集时（例如，-葡萄糖醛酸酶和酶乙酰木聚糖酯酶） 。机器人辅助检测和糖的测量，结合适当的统计方法，如响应面法，使这项工作的实际和有意义的 2，17，30，34 。致谢我们感谢梅丽莎和苏珊娜汽车的技术援助。在我们的实验室中对真菌酶研究多年的支持，由美国农业部国家研究项目竞争性赠款计划（NRICGP） ，目前由美国能源部能源大湖生物能源研究中心（美国能源部科学办公室的 BER DE FC02-07ER64494） 。我们 GLBRC资助的研究是一个协作实验室的布鲁斯戴尔（密歇根州立大学化学工程学系） ，我们感谢分享试剂和许多富有成效的讨论。参 考 文 献1。Agbogbo FK，温格 KS（200
47、7）生产乙醇的玉米秸秆半纤维素水解液，用树干毕赤酵母。工业微生物学和生物工程34:723-727号对照表考研2。安德森 MJ，：惠特科姆 PJ（2004 ）RSM 简化：优化流程采用响应曲面实验设计方法。生产力出版社，纽约3。安德森 WF，类似于 DE（2008年）的结构和化学性质的草木质纤维素转化为生物燃料有关的。 工业微生物学和生物工程35:355-366号对照表考研4。鲍尔瓦苏 S，P，S，佩尔森莫特 AJ，萨默维尔 CR（2006） ，一套用于分析植物细胞壁多糖降解酶的开发与应用。PROC Natl 科学院学报美国103:11417-11422号对照表考研5。拜耳 EA，LAMED，白
48、 BA，弗林特 HJ（2008）从纤维素酶 cellulosomics 的。化学记录8:364-377号对照表考研6。柏林 A，中号 Balakshin，吉尔克斯 ，Kadla J（2006）软木木质素制剂抑制纤维素酶，木聚糖酶和 -葡萄糖苷酶的活动。生物工程学报125:198-209 号对照表考研7。布拉柏林 A，吉尔克斯 的，Kurabi A，R，涂铭，基尔 ，萨德勒 J（2005）弱木质素结合酶：一种新的方法，以提高木质纤维素水解，纤维素酶的活性。应用生物化学与生物技术121:163-170号 对照表8。吉尔克斯 V Maximenko，柏林 A，N ，萨德勒 J（2007）木质纤维素水
49、解酶复合物的优化。生物工程 Bioeng 97:287-296号对照表考研9。Bevill K（2009）的产酶前列。乙醇生产商杂志15（6）:100-10510。Carpita NC，麦肯 MC（2000 ）第2章：细胞壁。在布坎南 BB，W Gruissem，琼斯R（EDS ）生物化学和分子生物学，植物。 ，PP，马里兰州罗克维尔市我 SOC 植物生物学52-10811。樱桃 JR，AL Fidantsef（2003 ）工业酶的定向进化更新。当前奥平生物工程 14:438-443号对照表考研12。德棉 AL，纽科姆男，吴 JH（2005）纤维素酶，梭状芽胞杆菌，和乙醇。微生物分子生物学69:124-154号对照牧师考研13。德快门 K，林 YC，P Tiels，范赫克韦伯-莱曼格林卡 A，S，J 等人（2009年）生产重组蛋白的宿主毕赤酵母的基因组序列。自然生物工程27:561-5
