1、第一章 生物药物概论1.生物药物有哪几类？DNA 重组药物与基因药物有什么区别？( 1 ）重组 DNA 药物（又称基因工程药物）（2）基因药物：以遗传物质 DNA、RNA 为物质基础制造的药物（3）天然生物药物（4） 合成或半合成生物药物2.生物药物有哪些作用特点？（一）药理学(pharmacology)特性：1、活性强: 体内存在的天然活性物质。2、治疗针对性强,基于生理生化机制。3、毒副作用一般较少，营养价值高。4、可能具免疫原性或产生过敏反应(二)、理化特性：1. 含量低、杂质多、工艺复杂、收率低、技术要求高；2. 组成结构复杂，具严格空间结构，才有生物活性。对多种物理、化学、生物学因素
2、不稳定。3. 活性高，有效剂量小，对制品的有效性，安全性要严格要求（包括标准品的制订） 。3.DNA 重组药物主要有哪几类？举例说明之。1）细胞因子干扰素(IFN)类药物（2）细胞因子白介素类和肿瘤坏死因子（3）造血功能药物（4）生长因子类药物（5）重组蛋白和多肽类激素（6）心血管病治疗剂与酶制剂（7）重组疫苗与治疗性抗体4.术语：药物与药品 生物药物，DNA 重组药物:又称基因工程药物，应用基因工程和蛋白质工程技术制造的重组活多肽,蛋白质及其修饰物基因药物：这类药物是以基因物质（RNA 或 DNA 及其衍生物）作为治疗的物质基础，包括基因治疗用的重组目的 DNA 片段、重组疫苗、反义药物和核
3、酶等。反义药物：以人工合成的 10几十个反义寡核苷酸序列与模板 DNA 或 mRNA 互补形成稳定的双链结构，抑制靶基因的转录和 mRNA 的翻译，从而起到抗肿瘤和抗病毒作用。核酸疫苗：是指将编码外源性抗原的基因插入到含真核表达系统的载体上，然后直接导入人或动物体内，让其在宿主细胞中表达抗原蛋白，该抗原蛋白可直接诱导机体产生免疫应答。RNAi ：在实验室中是一种强大的实验工具，利用具有同源性的双链 RNA（dsRNA）诱导序列特异的目标基因的沉寂，迅速阻断基因活性。第二章 生物制药工艺技术基础1. 生物活性物质的浓缩与干燥有哪些主要方法？ 浓缩方法：盐析；有机溶剂沉淀；高分子脱水； 超滤；真空
4、浓缩或薄膜浓缩 干燥方法：低温真空干燥；喷雾干燥；冷冻干燥2. 简述生物活性物质分离纯化的特点和分离纯化的主要原理。生化制药工艺中分离纯化特点:(1) 生物材料组成复杂(2) 目的物含量低(3) 易变性、失活(4) 分离方法有很大经验成分(5) 步骤多，逐级分离(6) 产品验证与化学上纯度概念不完全相同分离纯化原理： (1)根据分子形状与分子大小(2)根据电荷差异(3)根据分子极性与溶解度大小(4) 根据吸附特性(5) 根据生物配基特性3.怎样保存微生物菌种？何谓菌种退化？如何检查菌种退化？菌种保藏方法：斜面低温保存 液体石蜡封藏法 甘油冷冻法 冷冻干燥法 液氮保藏法菌种退化：菌种的生活能力、
5、产孢子能力衰退和特殊产物产量的下降统称退化检查方法：单位容积中发酵液的活性物质含量，琼脂培养皿上的单菌落形态，不同培养时期菌体细胞的形态和主要遗传特性，发酵过程中 PH 变动情况，发酵液的气味、色泽。3. 诱变育种的总体流程是怎样的？选择出发菌需注意哪些事项？1）出发菌株的选择稳定性； 具备某种优良性状的菌株；对诱变剂敏感；生理状态及生长时间（2）诱变处理化学诱变； 物理诱变； 生物诱变（3）筛选：随机筛选； 半理性化筛选4. 生物制药工艺中试放大的目的是什么？ （1）建立稳定工艺、大批量制备足量合格产品，供应临床前与临床研究；（2）研究工艺参数制定工艺规程和检定规程，为正式生产提供工艺参数，
6、保证能在以后生产中应用。6.酶固定化的方法有哪些类别？（1）吸附法：分为物理吸附法和离子交换吸附法；（2）包埋法：将酶或细胞定位于凝胶高聚物网络中，如卡拉胶，海藻胶，聚丙烯酰胺；（3）共价键结合法：酶分子与载体分子，通过化学偶联使酶与载体共价结合；（4）交联法：用双功能试剂将酶与载体交联固定化。7.术语 冷冻干燥：较低温度（-15以下） ，快速地将细胞冻结，并且保持细胞完整，然后在真空中使水分升华。喷雾干燥 薄膜浓缩 自然选育 诱变育种 转基因动物 蛋白质工程：在基因水平上设计表达新的功能蛋白蛋白质组学：研究细胞、组织或个体全部蛋白质的表达状态与功能状态是后基因组时代的重要研究方向，我国已承担
7、肝脏蛋白质组学的 10%研究工作。酶工程：是酶学与工程学互相渗透结合，发展形成的生物技术，它是从应用目的出发，研究酶和应用酶的特异催化功能，并通过工程化过程将相应原料转化成所需产物的技术。immobilized enzyme：同一个克隆的杂交瘤细胞基因相同，合成并分泌的特异性抗体质地均一，这种抗体即是单克隆抗体。抗体酶：具催化能力的免疫球蛋白称为抗体酶模拟酶：用合成高分子来模拟酶的结构、特性、作用原理以及酶在生物体内的化学反应过程。组合生物合成：是指应用基因重组技术重新组合微生物药物的基因簇，产生一些新的非天然的基因簇，从而合成许多新的非天然的化合物，为生物药物的筛选提供丰富的化合物资源药物基
8、因组学：是一门研究个人的基因遗传如何影响身体对药物的反应的一门科学。DNA Shuffling：通过对目的基因酶切成随机片段,然后进行 PCR 重聚,由于同源重组而产生基因突变的方法.定向进化: 在实验室条件下人工模拟生物大分子自然进化过程，在体外对基因进行随机诱变，使基因发生大量变异，并定向选择出所需性质的突变体，从而可以在短时间内实现自然界几百万年才能完成的进化过程。甘油冷冻保藏法，液氮保藏法，斜面保藏法，沙土管保藏法第三章 生物材料的预处理1.去除发酵液中杂蛋白有哪几种方法？（1）加入凝聚剂 （2）加入絮凝剂（3）吸附（4）等电点沉淀 （5）加各种沉淀剂沉淀（6）变性沉淀2.去除发酵液中
9、钙、镁、铁离子的方法有哪些？3.影响絮凝效果的主要因素有哪些？（1） 絮凝剂的分子量（2）絮凝剂的用量（3）溶液 pH 值（4）搅拌速度和时间：4.细胞破碎有哪些方法？各有什么特点？5.超声波破碎细胞的原理？超声波空穴作用使细胞破裂。6.术语 凝聚作用：在某些电解质作用下，使胶体粒子的扩散双电层的排斥电位降低，破坏了胶体系统的分散状态，而使胶体粒子聚集的过程。絮凝作用：往胶体悬浮液中加入絮凝剂时，胶粒可强烈的吸附在絮凝剂表面的功能基团，而且一个高分子聚合物的许多链节分别吸附在不同颗粒的表面，产生架桥连接，形成粗大的絮凝团沉淀出来，有助于过滤，这一过程既是絮凝作用。渗透压冲击法： 先把细胞放在高
10、渗溶液中，细胞发生收缩，然后将介质快速稀释或将细胞转入水或缓冲液中，细胞快速膨胀，使产物释放至溶液中。错流过滤 超声波破壁 酶法破壁 高压匀浆法 高速珠磨法 反复冻融法 渗透压冲击法 液氮研磨法 丙酮粉第四章 萃取法1、 溶剂萃取法的基本原理，其特点是什么？物质在两种互不相溶的液相中分配特性不同。溶剂萃取法优点：操作可连续化，速度快，生产周期短；对热敏物质破坏少；采用多级萃取时，溶质浓缩倍数大、纯化度高。2、 溶剂萃取法按操作方式不同，可分为哪几类？各有什么特点？单级萃取：操作简单多级错流萃取：当萃取剂量相同时，多级萃取收率较单级萃取高。多级逆流萃取： 萃取剂耗量较少，萃取液平均浓度较高。3、
11、 影响有机溶剂萃取的因素有哪些？萃取剂的选择需遵循哪些原则？ 乳化液 PH 温度和萃取时间 盐析作用 溶剂种类、用量及萃取方式的选择萃取剂选择原则：分配系数愈大愈好，若分配系数未知，则可根据“相似相容”的原则，选择结构相似的溶剂 选择分离因素大于 1 的溶剂 料液与萃取溶剂的互溶度愈小愈好 尽量选择毒性低的溶剂 溶剂的化学稳定性要好，腐蚀度低，沸点不宜太高，挥发性要低，价格便宜，来源方便，便于回收。4、 使用有机溶剂萃取时，改变 pH 值将如何影响酸性或碱性抗生素的分配系数？PH 低有利于酸性抗生素萃取，分配系数高；PH 高有利于碱性抗生素萃取，分配系数高。5、 乳化剂为何能使乳状液稳定？1
12、界面膜形成 防止液滴碰撞聚沉 界面电荷 液滴间互相排斥阻止液滴聚集 介质粘度 增强界面膜强度。6、 破坏乳状液的方法有哪些？1加入表面活性剂 2 离心 3 加电解质 4 加热 5 吸附法破乳 6 高压电破乳 7 稀释法7、 影响乳状液类型的因素有哪些？ 相体积 乳化剂分子空间构型 界面张力 容器壁性质8、 双水相萃取的优缺点有哪些？影响双水相萃取的因素有哪些？9、 超临界流体萃取有哪些特点？常用的流体为哪种？影响超临界流体萃取的因素有哪些？超临界萃取的流程主要有哪几种类型？具有广泛的适应性： 萃取效率高，过程易于调节： 分离工艺流程简单： 有些分离过程可在接近室温下完成分离过程必须在高压下进行
13、，设备及工艺技术要求高，投资比较大，普及应用较为困难。 2 二氧化碳 3 压力大小、温度、助溶剂、物料性质4 等温法 等压法 吸附法10、 术语：有机溶剂萃取 反萃取：萃取逆过程，萃取液与反萃取剂接触，溶剂由有机相转入液相的过程。 双节线 多级错流萃取 多级逆流萃取反胶束萃取 超临界流体萃取 双水相萃取，能斯特分配定律，表观分配系数，萃取因素，萃取剂，萃余液，HLB 值第五章 沉淀和结晶1、 什么是“盐析沉淀”？盐析的基本原理？盐析法是利用各种生物分子在浓盐溶液中溶解度的差异，通过向溶液中引入一定数量的中性盐，使目的物或杂蛋白以沉淀析出，达到纯化目的的方法。中和表面电荷 破坏蛋白质表面水化层2
14、、 影响盐析效果的因素有哪些？无机盐种类 蛋白质种类 蛋白质浓度 温度 PH3、 影响有机溶剂沉淀的因素有哪些？有机溶剂种类及用量 PH 温度 无机盐含量 某些金属离子的助沉淀作用 样品浓度4、 有哪些方法可形成过饱和溶液？蒸发法 温度诱导法 盐析结晶法 透析结晶法 有机溶剂结晶法 等点点法 微量扩散法 化学反应结晶法 共沸蒸馏结晶 5、 哪些因素可影响晶体的大小？过饱和度 温度 搅拌速度 晶种6、 等电点沉淀有哪些特点？如何应用？对于两性物质，等电点时净电荷为零，分子间排斥电位降低，吸引力增大，能相互聚集起来，发生沉淀。7、 术语：Ks 盐析：在一定 PH 和温度下改变离子强度进行盐析。 盐
15、析：在一定离子强度下改变 PH 和温度进行盐析 盐析分布曲线：表征蛋白质沉淀速度，-Ds/dP 对盐饱和度 P 的关系曲线透析结晶法：第六章 吸附法1、 化学吸附与物理吸附的区别？2、 吸附剂及被吸附物的极性对吸附的影响如何？极性吸附剂易吸附极性物质，非极性吸附剂易吸附非极性物质；极性吸附剂适宜从非极性溶剂中吸附极性物质；非极性吸附剂适宜从极性溶剂中吸附非极性物质。3、 吸附剂用量及被吸附物浓度对吸附效果的影响如何？一般吸附物浓度大时，吸附量也大，但吸附选择性下降。吸附剂用量大，吸附总量上升，选择性下降。4、 例举两种以上常用吸附剂的性质和用途。5、 大网格高聚物吸附剂（大孔吸附树脂）与传统吸
16、附剂相比有何优点？选择性好 解吸容易 理化性质稳定 机械强度好 可反复使用 流体吸力较小其孔隙大小、骨架结构和极性，可按照需要，根据不同的原料和合成条件而改变，因此可适用于吸附各种有机化合物。适合弱电解质及非离子型化合物分离6、 术语：正吸附：吸附提取液中有效成分负吸附：吸附除去提取液中杂质大网格高聚物吸附剂：第七章1. Ve=V0+Vi Kd项目 物理吸附 化学吸附Ve-淋出体积 V0-粒间体积Vi Kd-对于某种大小的溶质分子来说可以渗透进去的那部分孔体积，是总的孔体积 Vi 的一部分Kd-分配系数凝胶层析原理：当具有一定分子量分布的高聚物溶液从柱中通过时，较小的分子在柱中停留时间比大分子
17、停留的时间较长，样品各组分即按分子大小顺序而分开，最先淋出的是最大的分子2.常用的凝胶层析的名称，特点和用途a葡聚糖凝胶商品名为 Sephadex G 类其交联度是通过交联剂的加量及反应条件来控制的。 特点：孔径。稳定性。吸附作用。芳香族化合物和杂环化合物用途：对烯酸，稀碱，盐溶液稳定还能经受高压灭菌B修饰葡聚糖凝胶（一）亲脂性葡聚糖凝胶（Lipophilic Sephadex）骨架结构上引入一些有机基团，如甲基、羟丙基，使呈亲脂性，同时保留亲水性。（二）交联葡聚糖离子交换剂（Sephadex ion-exchanger）将活性交换基团连接于葡聚糖凝胶上制成的各种交换剂。（三）Supperde
18、x 系凝胶由高交联度多孔琼脂糖与葡聚糖共价结合而成。（四）Sephacryl 系凝胶是由烯丙烷基葡聚糖经甲叉双丙烯酰胺共价交联制成的。理化稳定性好，为硬性凝胶，可耐高压灭菌。C聚丙烯酰胺凝胶商品名为生物凝胶-P（Bio-Gel P）该凝胶由丙烯酰胺组成；以亚甲基双丙烯酰胺为交联剂，聚合而成。特点：1、孔径；2、稳定性、强度；3、无非特异吸附，保存方便；4、编号反映出它的分离界限。D琼脂糖类凝胶（Sepharose ）特点：1、没有共价键的交联。2、孔径 琼脂糖的浓度。3、琼脂糖凝胶的化学稳定性较差。4、非特异性吸附力低。5、颗粒强度差。6、分离范围大。3. 凝胶的选择凝胶性质、分离目的 (1)
19、.将分子量极为悬殊的两类物质分开，如蛋白质与盐类，称作类分离或组分离。 (2).将分子量相差不大的大分子物质加以分离，如分离血清球蛋白与白蛋白，这叫做分级分离。4. 一）层析柱的选择对于类分离，柱床体积一般为样品溶液体积的 5 倍，柱比 5 到 10。对于分级分离，柱床体积大于样品体积 25 倍以上，甚至多达 100 倍。柱比在 25 至 100 之间二）填柱凝胶柱底部支持物，有棉花、玻璃纤维、玻璃珠、垂熔玻璃等。空柱中应留约 1/5 的水或溶剂.不断搅拌下使胶粒均匀沉降，使不发生凝胶分层和胶面倾斜。5. （一）分子扩散（二）涡流扩散（三）流动相中传质阻力（三）固定相中传质阻力6.分子量的测定
20、在凝胶的分离范围内，不同分子量的物质其洗脱体积 Ve及分配系数 Kd值随分子量增加而下降。对于一个特定凝胶柱，待测定物质的洗脱体积与分子量的关系符合公式Ve=-KlogM+C （1）求解法:（两个已知分子量的蛋白质过柱） Vel=C KlogM1 Ve2=C KlogM2 （2）标准曲线法:（先以 3 个以上已知分子量的标准蛋白过柱 ）: 标准曲线法准确性较高 7.名解A层析柱长度与直径的比值称作“柱比”B全排阻：分子量最大，大于该种凝胶的排阻限，完全不能进入颗粒内部，只能从颗粒间隙流过C全渗入：分子量最小，小于该种凝胶的渗入限，其分子可以自由进出凝胶颗粒D排阻系数 Kd：他反应了物质分子进出
21、凝胶的程度，对一定种类规格的凝胶，物质的排阻系数值为该物质的特征常数（ Ve=V0+Vi Kd）E将分子量极为悬殊的两类物质分开，如蛋白质与盐类，称作类分离或组分离F将分子量相差不大的大分子物质加以分离，如分离血清球蛋白与白蛋白，这叫做分级分离G层析柱由于进出口之间液位压力差形成的对凝胶颗粒的压力称作“操作压”H凝胶层析中，两物质（A 和 B）和分辨率（ R）定义为I用交联葡聚糖作为薄层层析的支撑载体，称“薄层凝胶层析”J内水体积：凝胶过滤层析中，柱床的凝胶颗粒内的溶剂体积。外水体积：层析中物质在过柱过程中完全不被滞留的洗脱液体积，相当于层析柱流动相的体积。第八章1.洗脱：（ 1）调节洗脱液的
22、 pH 值。（2）用高浓度的同性离子将目的物离子取代下来。对阳离子交换树脂而言，目的物的 pI 值愈大（愈碱） ，将其洗脱下来所需溶液的 pH 值也愈高。2.命名：强酸类 1100 号弱酸类 101200 ；强碱类 201300；弱碱类 301400；中强酸类 401500交联度：是合成载体骨架时交联剂重量的百分数，用“”将树脂编号与交联度分开。弱酸 101 4 其交联度为 4。国内常用树脂命名：724；732；717例：（一）苯乙烯型离子交换树脂（二）丙烯酸型离子交换树脂3. 影响离子交换选择性的因素：离子价与离子水合半径离子价与离子浓度交换环境树脂结构偶极离子排斥4.偶极离子的排斥作用（
23、p251）：偶极离子RSO3-Na+ + H3+NRCOO - RSO3- H3+ NRCOO - +Na+ 钠盐树脂RSO3- H + + H3+NRCOO - RSO3- H3+ NRCOO H 氢型树脂与钠型树脂相比，氢型树脂有较大的有效交换容量5. （一）大孔型离子交换树脂的特征1）载体骨架交联度高。（2）孔径大。（3）表面积大，表面吸附强，对大分子物质的交换容量大。（4）孔隙率大。（二）均孔型离子交换树脂交联度均匀，孔径大小一致，交换容量都较高，膨胀度、机械强度好。6. 离子交换纤维素特点： (1)开放的长链骨架，亲水性强，表面积大，易吸附大分子。(2)交换基团稀疏，对大分子的实际交
24、换容量大。 (3)吸附力弱，交换和洗脱条件缓和，不宜变性。(4)分辨率高。 升高环境的 pH、降低 pH 或是增加离子强度都能将被吸附物质洗脱下来。7. 酸、碱性蛋白如何选用合适的离子交换纤维素（P259-260）8. 色谱聚焦的原理：（一）自动形成 pH 梯度。（二） 蛋白质的色谱行为（三）聚焦效应 9.常用的离子交换树脂：724 ；弱酸阳离子交换树脂732；强酸阳离子交换树脂717；强碱阴离子交换树脂常用离子交换纤维素：羧甲基纤维素（CM-C）：弱酸性阳离子交换纤维素，pK=3.6 。二乙基氨基乙基纤维素（DEAE-C）：强碱型阴离子交换纤维素，pK=9.19.CMC：羧甲基纤维素DEAE-C：二甲胺基乙基纤维素PBE94：PBE94 是以交联琼脂糖 6B（Sepharose 6B）为载体，并在糖基上通过醚键偶合上配基制成的多缓冲交换剂，是阴离子交换剂尼柯尔斯方程：交换带：交换带：交换离子 A1 由于被树脂吸附，其浓度从起始浓度 Co 逐渐下降到 0 的树脂层。交换容量：meq/g 树脂树脂再生：使用过的树脂重新获得使用性能的处理过程。偶极离子排斥：P250-251蛇笼树脂：两性树脂
