1、 微生物限度检查操作方法1 实验前准备1.1 实验用物品1.1.1 对照用菌液大肠埃希菌【CMCC（B）44102】以上标准菌株由中检所提供。取相应菌株营养琼脂培养基斜面新鲜培养物 1白金耳，接种于营养琼脂培养基内，培养 18-20小时后，稀释至 1：10 6。1.1.2 稀释水、刻度吸管、平皿稀释水：生理盐水瓶装，塞上胶塞，按高压蒸气灭菌操作程序，121湿热灭菌30分钟。取 0.2ml、1ml、5ml、10ml 刻度吸管、平皿置于金属容器中，140干热灭菌 2小时。1.1.3 培养基准备：营养琼脂、玫瑰红钠琼脂、营养肉汤、4-甲基伞形酮葡糖苷酸（MUG）培养基、胆盐乳糖培养基。以上实验所需干
2、粉培养基均由中检所提供，分别按说明加适量水加热溶解后，塞上胶塞，湿热灭菌 30分钟备用。1.1.4 无菌衣将无菌衣、头罩、口罩、乳胶手套叠好，置于无菌衣袋中，湿热灭菌 30分钟。1.2 无菌室及操作台的准备用 0.1%的新洁尔灭溶液或 75%乙醇溶液将操作台，天花板，墙壁，地面擦洗一遍，同时将操作台用 0.1%新洁尔灭溶液或 75%乙醇溶液擦洗一遍。将实验所需物品通过传递窗移入无菌室，打开空气净化系统，打开紫外灯，杀菌 0.5-1个小时。2 实验操作2.1 进入无菌室更衣间，用 0.1%新洁尔灭溶液或 75%乙醇溶液消毒手及腕部至少一分钟，戴上头罩、口罩，穿好无菌衣及无菌手套后，进入无菌室，开
3、始实验操作。2.2 供试液的制备2.2.1 液体供试品2.2.1.1取供试品 10ml，加 PH值 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至 100ml（必要时可啬稀释液） ，浸泡、振摇，作为 1：10 的供试液。油剂可加入适量的无菌聚山梨酯 80使供试品分散均匀。水溶性液体制剂也可用混合的供试品原液作为供试液。2.2.2 固体、半固体或黏稠性供试品2.2.2.1取供试品 10g，加 PH值 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至 100ml，溶解混匀，作为 1：10 的供试液。2.2.3膜剂供试品2.2.3.1 取供试品 100cm2，剪碎，加 0.9%无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液 100ml（必要时可增加稀
4、释液） ，浸泡 1分钟，振摇，作为 1：10 的供试液。2.2.4包装用复合膜供试品2.2.4.1用开孔面积为 20cm2的消毒过的金属模板压在试样的内表面上，将无菌棉签用无菌生理盐水稍沾湿，在板孔范围内擦抹 5次，换 1支棉签再擦抹 5次，每个位置用 2支棉签共擦抹 10次。共擦抹 5个位置 100 cm2 。每支棉签擦抹完后立即剪断（或烧断） ，投入盛有 30ml无菌生理水的三角烧瓶（或大试管）中。全部擦抹棉签均投入瓶中后，将瓶迅速摇晃 1min，静置 10min即得 1：10 供试液。2.3 细菌、霉菌及酵母菌计数2.3.1 平皿菌落计数法 取均匀供试液，进一步稀释成 1：10 1、1：
5、10 2、1：10 3等适宜的稀释度。分别取连续三级 10倍稀释的供试液各 1ml，置直径约 90mm的平皿中，再注入约 45的培养基约 15-20ml，混匀，待凝固后，倒置培养，每稀释度至少制备2个平板。2.3.1.1 细菌计数用营养琼脂培养基，霉菌计数用玫瑰红钠琼脂培养基。液体制剂同时点计霉菌菌落数及酵母菌菌落数。2.3.2 阴性对照试验 取试验用的稀释液 1ml，置无菌平皿中，注入培养基，凝固，倒置培养。每种计数用的培养基各制备 2个平板，均不得有菌生长。2.3.3 菌落计数2.3.3.1 细菌培养时间为 48小时，分别在 24及 48小时点计数落数，一般以 48小时菌落数为准。霉菌、酵
6、母菌培养时间为 72小时，分别在 48及 72小时点计菌落数，一般以 72小时菌落数为准。2.3.3.2 营养琼脂平板一般点计细菌菌落数，玫瑰红钠琼脂平板一般点计霉菌菌落数。在特殊情况下，前者同时点计霉菌、酵母菌菌落数，后者同时点计细菌菌落数。菌落如蔓延生长成片，不宜计数。点计后，计算各稀释级的平均菌落数，按菌数报告规则报告菌数。2.3.3.3 菌数报告规则 2.3.3.3.1宜选取细菌、酵母菌平均菌落数在 30300 之间，霉菌平均菌落数在30100 之间的稀释级，作为菌数报告（取两位有效数字）的依据。2.3.3.3.1.1当仅有 1个稀释级的菌落数符合上述规定，以该级的平均菌落数乘以稀释倍
7、数的值报告菌数。2.3.3.3.1.2当同时有 2个稀释级的菌数符合上述规定时,视两者比值 （高稀释级的菌落数乘以稀释倍数的值除以低低稀释级的菌落数乘以稀释倍数的值）而定。 若比值不大于 2，以两稀释级的菌落数乘以稀释倍数的均值报告菌数；当比值大于 2但不超过 5时，以低稀释级的菌落数乘以稀释倍数的值报告菌数；当出现比值大于5，或高稀释级的菌落数大于或等于低稀释级的菌落数等异常情况时，应查明原因再行检查，必要时，应进行方法的重新验证。2.3.3.3.1.3当各稀释级的平均菌落数均小于 30，以最低稀释级的平均菌落数乘以稀释倍数的值报告菌数。2.3.3.3.1.4如各稀释级的平板均无菌落生长，或
8、仅最低稀释级的平板有菌落生长，但平均菌落数小于 1时，以1 乘以最低稀释倍数的值报告菌数。2.3.4薄膜过滤法2.3.4.1采用薄膜过滤法，滤膜孔径应不大于 0.45um，直径一般为 50mm，若采用其他直径的滤膜，冲洗量应进行相应的调整。选择滤膜材质时应保证供试品及其溶剂不影响微生物的充分被截留。滤器及滤膜使用前应采用适宜的方法灭菌。使用时应保证滤膜在过滤前后的完整性，水溶性供试液过滤前先将少量的冲洗液过滤以润湿滤膜。油类供试品，其滤膜和过滤器在使用前应充分干燥，为发挥滤膜的最大过滤效率，应注意保持供试品溶液及冲洗液覆盖整个滤膜表面。供试液经薄膜过滤后，若需要用冲洗液冲洗滤膜，每张滤膜每次冲
9、洗量为 100ml。每片滤膜的总过滤量不宜过大，以避免滤膜上的微生物受损伤。取相当于每张滤膜含 1g或 1ml供试品的供试液，加至适量的稀释剂中，混匀，过滤。若供试品每 1g或 1ml所含的菌数较多时，可取适宜稀释级的供试液 1ml，过滤。用 PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或其他适宜的冲洗液冲洗滤膜，冲洗方法和冲洗量同“计数方法的验证” 。冲洗后取出滤膜，菌面朝上贴于营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养基或酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基平板上培养。每种培养基至少制备一张滤膜。2.3.4.2阴性对照试验 取试验用的稀释液 1 ml，照上述薄膜过滤法操作，作为阴性对照。阴性对照不得有菌生长。2.3.
10、4.3培养和计数 培养条件和计数方法同平皿法，每片滤膜上的菌落数应不超过100个。2.3.4.5菌数报告规则 以相当于 1g或 1ml供试品的菌落数报告菌数；若滤膜上无菌落生长，以1 报告菌数（每张滤膜过滤 1 g或 1ml供试品） ，或1 乘以稀释倍数的值报告菌数。2.4 控制菌检查：除另有规定外，取供试液 10ml，照以下方法检验。2.4.1 大肠埃希菌（Escherichia coli）取胆盐乳糖培养基 3份，每份各 100ml，1份加入 10ml供试液（相当于供试品 1g、1ml、10cm 2） ， 1份加入对照菌液作阳性对照，1份加入 10ml稀释剂作阴性对照。培养 1824 小时（
11、必要可延至 48小时） 。阴性对照应无菌生长。取上述三份的培养物各 0.2ml，分别接种至 5mlMUG培养基管内培养，分别于 5小时、24 小时在 366nm紫外线下观察，取未接种的 MUG培养基管作本底对照。阳性对照管呈现荧光，MUG 阳性。供试液的 MUG管呈现荧光，MUG 阳性；无荧光，MUG阴性。然后加数滴靛基质试液于 MUG管内，液面呈玫瑰红色为阳性，呈试剂本色为阴性。当阴性对照呈阴性，阳性对照正常生长，供试液胆盐乳糖培养基培养液澄明，并证明无菌生长，判未检出大肠埃希菌。供试液 MUG阳性，靛基质阳性，判检出大肠埃希菌；MUG 阴性，靛基质阴性，判未检出大肠埃希菌。如 MUG阳性、
12、靛基质阴性，或 MUG阴性，靛基质阳性，则应取胆盐乳糖培养基的培养物划线接种于曙红亚甲蓝琼脂培养基或麦康凯琼脂培养基的平板上，培养 18-24小时。若平板上无菌落生长、或生长的菌落与表 1所列的菌落形态特征不符，判供试品未检出大肠埃希菌，若平板上生长的菌落与表 1所列的菌落形态特征相符或疑似，应进行分离、纯化、染色镜检和适宜的生化试验，确认是否为大肠埃希菌表 1 大肠埃希菌菌落形态特征培养基 菌落形态曙红亚甲蓝琼脂呈紫黑色、浅紫色、蓝紫色或粉红色，菌落中心呈深紫色或无明显暗色中心，圆形，稍凸起，边缘整齐，表面光滑，湿润，常有金属光泽麦康凯琼脂 鲜桃红色或微红色，菌落中心呈深桃红色，圆形，扁平，
13、边缘整齐，表面光滑，湿润2.5沙门菌2.5.1取供试品 10g或 10ml，直接或处理后接种至适量（不少于 200 ml）的营养肉汤培养基中，用匀浆仪或其他适宜方法混匀，培养 18-24小时。取上述培养物 1 ml，接种于 10 ml四硫磺酸钠亮绿培养基中，培养 18-24小时后，分别划线接种于胆盐硫乳琼脂（或沙门、志贺菌属琼脂）培养基和麦康凯琼脂（或曙红亚甲蓝琼脂）培养基的平板上，培养 18-24小时（必要时可延长至 40-48小时） 。若平板上无菌落生长，或生长的菌落不同于表 2所列的特征，判供试品未检出沙门菌。若平板上生长的菌落与表 2所列的菌落形态特征相符或疑似，用接种针挑选 2-3个
14、菌落分别于三糖铁琼脂培养基高层斜面上进行斜面和高层穿刺接种，培养 18-24小时，如斜面未见红色、底层未见黄色；或斜面黄色、底层无黑色，判供试品未检出沙门菌。否则，应取三糖铁琼脂培养基斜面的培养物进行适宜的生化试验和血清凝集试验，确认是否为沙门菌。表 2 沙门菌菌落形态特征培养基 菌落形态胆盐硫乳琼脂 无色至浅橙色，半透明、菌落中心带黑色或全部黑色或无黑 色沙门、志贺菌属琼脂 无色至淡红色，半透明或不透明，菌落中心有时带黑褐色曙红亚甲蓝琼脂 无色至浅橙色，透明或半透明、光滑湿润的圆形菌落麦康凯琼脂 无色至浅橙色，透明或半透明、菌落中心有时为暗色3 结果判断3.1细菌菌落数、霉菌（酵母菌）菌落数
15、、大肠埃希菌三项均符合该品种微生物限度项下规定，应判供试品合格；其中任何一项不符合该品种项下规定，应判供试品不合格。3.2 细菌菌落数、霉菌（酵母菌）菌落数第一次测定超过该品种项下微生物限度规定时，应从同一批号样品中随机抽样，复试两次，以三次结果平均值报告。3.3 如发现营养琼脂培养基平板生长霉菌（酵母菌）菌落数或玫瑰红钠琼脂培养基平板上生长细菌菌落数超过该品种项下微生物限度规定时，经复试 2次，如 3次结果平均值仍超过规定，应判供试品不合格。3.4 各类制剂检出大肠埃希菌时，按一次检出结果为准，不再抽样复试，即应判该供试品不合格。4 注意事项4.1 实验完毕后，将实验物品移出无菌室，将各培养基按规定温度移入培养箱中培养至规定时间，并将阳性对照菌液与其接触过的吸管等物品湿热灭菌 30分钟。4.1.1 培养温度 除另有规定外，本检查法中细菌培养温度为 30-35，霉菌、酵母菌培养温度为 23-28，控制菌培养温度为 361。4.2 用 0.1%的新洁尔灭溶液将操作台擦洗一遍，打开紫外灯，杀菌 1小时。4.3 照上述操作方法要求，按时查看并计数，及时出报告。
