1、生物技术原理讲义第一章 生物技术的研究历史和发展动态一、什么是生物技术 生物技术这个词最初是由匈牙利工程师 Karl Erehy 于 1917 年提出的。当时他提出的生物技术这一名词的涵义是指用甜菜作为饲料进行大规模养猪，即利用生物将原材料转变为产品。 19 世纪人类有意识地利用酵母进行大规模发酵生产。当时进行大规模生产的发酵产品有乳酸、酒精、面包酵母、柠檬酸和蛋白酶等初级代谢产物。 1928 年， Flemming 爵士发现了青霉素，从此生物技术产品中增加了一大类新的产品即抗生素。 到 20 世纪 40 年代，以获取细菌的次生代谢物 抗生素为主要特征的抗生素工业成为生物技术产业的支柱产业。
2、20 世纪 50 年代，氨基酸发酵工业又成为生物技术产业的一个新成员。 到 20 世纪 60 年代，在生物技术产业中又增加了酶制剂工业这一新成员。什么是生物技术？生物技术=生物工程应用自然科学及工程学原理，以微生物体、动物体、植物体或其组成部分作为生物反应器将物料进行加工，以提供产品来为社会服务的技术。现代生物工程包括发酵工程、酶工程、细胞工程、基因工程（一） 传统生物技术传统生物技术主要是通过微生物的初级发酵来生产商品，它一般包括 3 个重要的步骤：第一步：上游处理过程。所谓上游过程，是指对于粗材料进行加工，作为微生物的营养和能量来源；第二步：发酵和转化。发酵指的是目的微生物的大量生长，发酵
3、过程必须在一个大的生物反应器内进行，反应器容积通常大于 100L，可以连续生产某一个目的产品，比如抗生素、氨基酸或蛋白质等；第三步：下游处理过程。主要是指所需目的产物的纯化过程，人们既可以从细胞的培养液中纯化，也可以直接从细胞中纯化。生物技术研究的主要目标是最大限度地提高这 3 个步骤的整体效率，同时寻找一些可以用来制备食品、食品添加剂和药物的微生物。 （二）现代生物技术1953 年，Watson 和 Crick 发现了 DNA 双螺旋结构，奠定了现代分子生物学的基础。1973 年，美国加利福尼亚大学旧金山分校的 Heber Boyer 教授和斯坦福大学的 Stanley Cohen 教授共同
4、完成了一项著名的实验。他们选用了一个仅含有单一 EcoR位点的质粒载体 pSC101 ，并用 EcoR将其切为线性分子，然后将该线性分子与同样具有EcoR 粘性末端的另一质粒 DNA 片段和 DNA 连接酶混合，从而获得了具有两个复制起始位点的新的 DNA 组合。意义：这一实验是人类历史上第一次有目的的基因重组的尝试。虽然这两位科学家在这次实验中没有涉及任何有用的基因，但是“基因克隆”具有重大作用和深远意义。 DNA 重组技术使得生物技术过程中生物转化环节的优化过程变得更为有效，而且它所提供的方法不仅可以分离到那些高产量的微生物菌株，还可以人工制造高产量的菌株，原核生物细胞和真核细胞都可以作为
5、生物工厂来生产胰岛素、干扰素、生长激素、病毒抗原等大量的外源蛋白； DNA 重组技术还可以简化许多有用化合物和大分子的生产过程。植物和动物也可以作为天然的生物反应器，用来生产新的或改造过的基因产物； DNA 重组技术大大简化了新药开发和检测系统。Boyer 和 Cohen 的 DNA 重组实验（三）现代生物技术的进展 现代生物技术在商业领域、科研领域，都在非常短的时间内变成了非常热门的领域。 美国技术评估委员会 1987 年对现代生物技术的发展作出了评估，他们认为现代生物技术是一次象当年的工业革命和今天的计算机革命一样，可以改变生命和人类未来的科学革命。 操纵遗传物质来满足生命体的特殊的要求，
6、将会给人类的现代生活带来根本性的重大变化。 世界生物技术产业现状 （2001 统计数据）： 全球生物技术公司 4284 家 ；美国 1457 家 全球收入 384.7 亿美元；美国 253.19 亿美元 全球研发费用 164.27 亿美元；美国 115.32 亿美元 我国生物技术产业现状：300 家公司，有能力生产的 150 家，上市 40 多家。产品总销售额 200 亿 RMB。生物技术在各个领域中的应用1.医药生物技术基因工程药物和疫苗研究与开发突飞猛进。新的生物治疗制剂的产业化前景十分光明，21 世纪整个医药工业将面临全面的更新改造；基因治疗取得重大进展，有可能革新整个疾病的预防和治疗领
7、域。估计到 21 世纪初，恶性肿瘤、艾滋病等严重疾病的防治可望有所突破。生物技术药物：胰岛素，促红细胞生成素，干扰素等2. 农业生物技术 生物技术在农业中的应用是基于对植物、动物基因学和蛋白质学的认识。 很多专家认为只有依靠生物技术，发展中国家才能战胜饥饿，全球因人口增长而产生的食品短缺才有望得以缓解。 通过利用动植物中的特定基因，可以实现用更少的土地种植更多的作物，同时减少农药的使用。利用生物技术，可以在恶劣的气候环境下生产作物。利用生物技术，还可以改善食品的营养和口感等。生物技术用于育种是一种快捷、有效的育种方法。通过引入特定的基因，以改变动植物的品质。例如，科学家在西红柿中植入抗成熟的基
8、因，可以延长西红柿的货架期。在植物中引入对人体无害的抗虫基因，可以防止病虫害，减少农药的使用，在水稻中介入产生维生素 A 的基因，可以提高稻米的营养价值。 生物技术在农业中的另一个可能的应用是生产食用疫苗，利用水果、蔬菜生产抗肝炎、霍乱等传染病的疫苗。克隆技术用于动物，可以保留高品质动物的高产性能。 目前市场上的农业生物技术产品主要是转基因的大豆、玉米、油菜、棉花等。转基因植物以其优异的品质很快被农户接受。2001 年，世界上转基因植物的种植面积达 5300 万公顷，比 2000 年增加 19。 3. 工业与环境生物技术生物技术应用于工业制造和环境管理，是为了推动工业的可持续发展。微生物被认为
9、是天然的化学工厂。它们正取代工业催化剂而用于化学品的制造。例如，酶制剂能取代洗涤剂中的磷和皮革鞣制过程中的硫化物。在造纸过程中，酶制剂可以减少氯化物在纸浆漂白过程中的用量。微生物在工业生产过程中的应用，使工业生产变得清洁、高效，具有可持续性。 酶也可以作为生物催化剂将生物质转化为能源、乙醇等。 4. 生物技术的其它应用 现在开发畜牧医用产品的生物公司越来越多，美国每年用于动物健康的产品市场约 40亿美元，美国农业部批准的动物用生物制品约 100 种，主要是防止动物传染病和常见病的疫苗和治疗药。 生物技术也应用于珍稀野生动物的保护，通过 DNA 识别来鉴别动物的种类，跟踪其活动地域等。 海洋生物
10、技术的应用使受过度捕捞而濒临灭绝的海洋生物的生存得到发展。同时又给人类从丰富的海洋生物资源汇总发现新药提供了途径。例如海螺中的一种毒素是有效的止痛药，海绵可以用作抗感染等。生物技术也可用于人类考古和犯罪调查，通过 DNA 分析可以研究人类种群的进化史。DNA 技术应用于犯罪案件调查可以帮助执法人员确认罪犯。 生物反恐 美国 911 恐怖事件和随后的炭疽菌案件，使大部分美国人感到，今后的生物恐怖事件可能发生，对生物恐怖事件的防卫必须予以重视。专家预测，生物反恐将成为国防的新领域，美国将利用生物技术防卫各种可能的生物恐怖袭击。生物反恐将与公共健康系统、传统国防工业、生物技术和制药业紧密关联。 二、
11、现代生物技术的商业化（一）现代生物技术商业化的前景生物技术研究的最终目标是生产商业产品，因此，与很多科学研究不同，现代生物技术在某种程度上是由经济的发展所推动的，商业投资不仅在支撑着现代生物技术的研究，而且对于商业回报的预期也使人们积极地对它进行投资。（二）现代生物技术商业化的特点1. 属于典型的技术密集型产业2. 市场迅速扩张3. 世界各国均投入了巨额资金4. 现代生物技术产品不断增加5. 经营现代生物技术产品的公司竞争激烈6. 各生物技术公司的研究目标日趋集中，生产的产品更加专一7. 医学生物技术产业化进程最快三、现代生物技术的前景21 世纪为生命科学的世纪，生物技术产业为 21 世纪的朝
12、阳产业。一方面是由于现代生物技术发展迅速，用途广泛；另一个方面是由于现代生物技术具有其他技术所无法比拟的优越性，即可持续发展。由于生物技术是以生物为原料生产产品的，因此其原料具有再生性，同时利用生物系统生产产品产生的污染物很少，对环境的破坏性很小或几乎没有，重组微生物甚至还可以消除环境中的污染物。（一） 现代生物技术对人类生活的影响 现代生物技术为人类生活提供了多方面的便利，主要包括： 更加准确地诊断、预防或治愈传染病和遗传疾病； 有效地提高作物的产量，获得具有抗虫、抗真菌、抗病毒、抗逆境等优良性状的植物； 开发制造可以生产化学药物、生物多聚体、氨基酸、酶类和各种食品添加剂的微生物； 创造带有
13、更多优良性状的家畜和其他动物； 简化从环境中清除污染物和废弃物的程序。目前，生物技术已走入寻常百姓家，成为提高全民日常生活质量的重要方法。 美国的一些州已经建立起州级的 DNA 数据库以用于侦破案件，确定罪犯； 系统地对胎儿进行染色体检查，以确定胎儿是否携带有遗传缺陷基因，提高人口质量（尽管对这种做法还有争论） ；转基因植物、转基因动物逐步“走”上人们的餐桌，为人们提供质量更高、营养成分搭配更合理的膳食； 胰岛素、干扰素、白细胞介素等基因工程药物已大批量生产，并投放市场； PCR 等方法也逐步广泛地用于多种疾病的分子诊断。总而言之，现代生物技术已开始渗人到人们生活的多个方面。（二）现代生物技术
14、对人类社会及环境的影响在现代生物技术对人类和自然环境的影响方面，人们主要关心的是下面一些问题： 那些经过基因工程改造的生物体是否会对其他的生物体或环境造成危害； 使用和开发基因工程生物是否会降低自然界的遗传多样性； 人是否也可以成为基因工程操作的对象； 基因诊断的程序会不会侵犯个人隐私权； 对现代生物技术的经济资助是否会影响或限制其他重要技术的发展； 农业生物技术是否会彻底改变传统的耕作方式； 用现代生物技术生产的药物进行治疗是否会压抑同样有效的传统治疗方式； 现代生物技术专利的申请是否会阻止科学家之间自由的思想交流。 （三） 现代生物技术的规范化管理正是出于对现代生物技术可能带来的不良后果的
15、担忧，在 1975 年，一些美国科学家自发地要求禁止一切有潜在危险性的基因转移实验，甚至有人要求全面禁止所有的基因操作实验。从那时起，现代生物技术就不再仅仅是一个科学问题，而且已成为一个为各国政府所关注的杜会问题。 四、现代生物技术与中国（一）中国现代生物技术的应用成果鉴于现代生物技术所具有的巨大潜能，各国政府都十分重视它的发展。在这方面美国一直居于领先地位，欧洲和日本则在紧紧追赶。虽然中国目前的现代生物技术研究和开发水平与发达国家相比仍有一定的差距，但自86 年中国开始实施生物技术领域“863”计划以来，这一领域已经取得了举世瞩目的成就。 虽然中国目前的现代生物技术研究和开发水平与发达国家相
16、比仍有一定的差距，但自 86 年中国政府开始实施生物技术领域“863”计划以来，这一领域已经取得了举世瞩目的成就。目前中国的生物技术水平在亚洲地区已名列前茅，特别是中国的医药生物技术在过去的 10 年中取得了一系列突破性进展。现代生物技术生产药物方面： 成功生产了重组乙肝疫苗，人干扰素、白细胞介素 2 、人红细胞生成素等多种药物。农业生物技术方面：转基因水稻、大豆、小麦、棉花、番茄、烟草等多种转基因植物已培育成功，有些已被批准进行大田释放或试种。目前中国已成为世界上转基因植物种植面积最大的国家，并成为继美国之后第二个拥有转基因抗虫棉花的国家。家畜胚胎工程方面：中国已跻身于国际先进行列，获得了首
17、例核移植山羊的产羔成果。植物基因工程方面：而植物组织培养、原生质的培养、染色体工程、花药育种、体细胞杂交等已成为现代分子育种的重要手段。在动物基因工程方面：中国也取得了许多可喜的成果，目前已获得了转基因鱼、兔、鸡等多种转基因动物。（二）中国面临的现代生物技术研究的挑战中国政府对于现代生物技术的 R & D 一直十分重视，中国科学家在政府的支持下确实取得了不少成果，但仍面临不少严峻的问题。 过多的仿制； 低水平的重复； 目前中国的现代生物技术还面临着专业及管理人才紧缺的严重问题。总的来说，目前中国的现代生物技术水平有较大提高，并在某些方面处于国际领先地位。将培育出比现有杂交水稻增产 20 左右的
18、新水稻品种；将研制出一批抗虫、抗病毒的水稻、玉米等主要粮食作物的株系或品系；研制成功具有优良特征的转基因鱼和猪；大约有 2030 种药物、疫苗、诊断试剂投放市场。第二章 核酸的结构与功能一、核酸的发现 1944 年 Avery 等通过肺炎球菌转化试验证明 DNA 是遗传物质。1928 年，荷兰细菌学家格里菲斯（Griffith）在研究肺炎球菌时发现肺炎球菌有很多不同菌株，其中有一种菌株它的球菌有毒性，能引起小鼠得败血病。这些有毒的球菌外面有一层多糖荚膜，在固体培养基上培养得到光滑型的菌落，叫 S 型菌株；另外一些菌株无多糖荚膜，菌落呈粗糙型，不会引起疾病，叫 R 型。1928 年格里菲斯进行活
19、体试验，如下：第一节 核酸的种类、分布和化学组成一、核酸的种类和分布脱氧核糖核酸（DNA） ，核糖核酸（RNA）：包括 mRNA、tRNA、rRNA1. 真核细胞中 DNA真核细胞中，DNA 的 98% 以上分布于细胞核内。不同种生物的细胞核中的 DNA 含量有很大差异，但同种生物的体细胞核中的 DNA 含量是相同的。线粒体和叶绿体中均有各自的 DNA 。2. 原核细胞中 DNA原核细胞没有明显的细胞核结构， DNA 存在于称为类核的结构区，也没有与之结合的染色质蛋白，每个原核细胞只有一个染色体，每个染色体含一个双链环状 DNA 分子。原核细胞染色体之外还存在能进行自主复制的遗传单位，称为质粒
20、，某些低等真核生物（如酵母）中也存在质粒。3. 病毒中 DNA 病毒由核酸和蛋白质外壳组成，其中所含的核酸或是 DNA ，或是 RNA 。 另外在植物中还发现一类比病毒还小得多的侵染性致病因子称为类病毒，它是不含蛋白质的游离 RNA 分子，称为阮病毒。其入侵生物后可使正常蛋白转变为病原体蛋白。4. RNA 的分布 在细胞内的 RNA 主要存在于细胞质中，约占 90 % ，少量存在于细胞核中。叶绿体、线粒体中也有各自与细胞质不同的 mRNA、tRNA 和 rRNA 。二、核酸的化学组成核酸的元素组成 组成核酸的基本元素：C 、H、O 、N、P； 其中 P 的含量比较稳定，占 9%-10%，通过测
21、定 P 的含量来推算核酸的含量。 DNA 平均含磷量为 9.9%，RNA 为 9.4%。 任何核酸都含磷酸，所以核酸呈酸性。核酸的结构组成：1、核糖和脱氧核糖 RNA 中所含的戊糖是 -D- 核糖；DNA 中的戊糖是 -D-2- 脱氧核糖，它们在核酸中均以呋喃糖态存在。为了与碱基分子中的原子编号相区别，戊糖的碳原子编号都要加上“ ” 。 OHOHHHOC2 HOC2OHOHHD-D-22、碱基两类核酸所含的主要碱基都是 4 种，其中两种嘌呤碱基完全相同，即腺嘌呤和鸟嘌呤。所含的嘧啶碱基不完全相同， RNA 中是胞嘧啶和尿嘧啶， DNA 中是胞嘧啶和胸腺嘧啶。3、核苷核苷是戊糖与碱基生成的糖苷。
22、由戊糖第 1 位碳原子上的羟基与嘌呤碱的第 9 位氮原子或与嘧啶碱的第 1 位氮原子相连接。戊糖与碱基之间的连键是 CN 糖苷键。核苷：A, G, U, C脱氧核苷：dA, dG, dT, dC核苷的结构核糖核苷 NOHHONH2HONOHH2 NNNH2OHOHHC2 OCHOHOHC2 HOHC2脱氧核糖核苷4、核苷酸和稀有核苷酸核苷（脱氧核苷）和磷酸以磷酸酯键连接形成核苷酸（脱氧核苷酸） 。 POOOHOH OCH2OHOHNNNH2O核苷酸的核糖有 3 个自由羟基，可以酯化分别生成 2-, 3-和 5-核苷酸。脱氧核苷的糖上只有 2 个自由羟基，只能生成 3-和 5-脱氧核苷酸。生物体
23、内存在的核苷酸，多是 5 -核苷酸。核苷酸种类 RNA 中含有腺苷酸 AMP，鸟苷酸 GMP，胞苷酸 CMP， 尿苷酸 UMP， DNA 中含有脱氧腺苷酸 dAMP，脱氧鸟苷酸 dGMP，脱氧胞苷酸 dCMP，脱氧胸苷酸 dTMP OBOHH2CPOHOB= OH2CPHOBOH稀有核苷酸常以其核苷的形式表示。常见的甲基化修饰基团以“m”表示，修饰基团在碱基上的写在碱基符号左方，修饰基团在核糖上的写在碱基符号右方。 （修饰基团数写在其右下角，修饰位置写在右上角） 。例如：m26A 表示腺苷碱基 6 位有 2 个甲基，即 N6,N6二甲基腺苷；m32,2,7G 表示鸟苷的 2 位有 2 个甲基，
24、第 7 位有一个甲基，共三个甲基。第二节 核酸的分子结构一、 DNA 的分子结构1、DNA 的一级结构 核酸是由四种脱氧核苷酸通过磷酸二酯键连接而成的线形或环形多核苷酸链。DNA 分子上四种核苷酸的排列顺序叫核酸的一级结构。由于 DNA 分子上的核糖和磷酸无差别，仅是碱基有差异，所以用碱基序列表示核酸的一级结构。 由于脱氧核糖 C2 上不含羟基， C1 又与碱基相连接，所以唯一可以形成的键是 3 ,5 磷酸二酯键。 在 DNA 分子上，由于所有核苷酸间的磷酸二酯键有相同的走向，多核苷酸链都有特殊的方向性，使每条线形核酸链都有一个 5末端和一个 3末端。OHOHHHOC2 HOC2OHOHHD-
25、D-2DNA 分子中核苷酸的连接方式及表示方法A.结构式表示法：结构式反映出 DNA 中的所有元件。B. 线条式表示法：用垂直线表示戊糖的碳链，A 、C 、T、G 表示不同的碱基，P 代表磷酸基，由 P 引出的斜线一端与 C3 相连，另一端与 C5 相连，代表两个核苷酸之间的 3,5磷酸二酯键。A G P5 P T PG PC PT P OH 3 C.文字式表示法：P 在碱基左侧，表示 P 在 C5 位置上。P 在碱基之右侧，表示 P 与 C3 相连。有时，多核苷酸中磷酸二酯键上的 P 也可省略，但一般末端核苷酸的 P 不得省略，以其表示多核苷酸链的方向。5 pApCpTpGpCpT-OH 3
26、 文字式表示法5 pA C T G C T 3 简化式DNA 的碱基组成 Chargaff 规则1950 年，Chargaff 用纸层析法分析多种生物 DNA 分子的组成成分，发现所有物种内的 DNA 的 A 与 T，G 与 C 之比值都接近 1.0。他对 DNA 双螺旋结构模型的提出提供了重要依据。要点如下：（1）同一种生物中，DNA 分子中碱基组成：AG=CT；A=T,G=C（2）种的特异性，同种生物（各组织、器官）DNA 碱基组成相同，异种生物 DNA 碱基组成差异很大，可用不对称比率 A+T/G+C 的相近程度表示种间亲缘关系的远近。（3）DNA 碱基组成没有器官和组织的特异性，不受年
27、龄，营养状况及环境的影响。因为生物的遗传信息贮存于 DNA 的核苷酸序列中，生物界物种的多样性即寓于 DNA 分子四种核苷酸千变万化的不同排列之中。测定 DNA 分子上四种核苷酸的排列顺序（即序列） ，是分子生物学家多年要解决的重要问题。这一问题的解决曾一度是十分困难的，但随着分子生物学的发展，特别是基因重组技术的建立和发展，一级结构分析已成为生物化学和分子生物学实验室的一种常规方法。2、DNA 的二级结构Watson 和 Crick 于 1953 年提出了 DNA 双螺旋结构模型，说明了 DNA 的二级结构。DNA 的二级结构：两条单链 DNA 通过碱基互补配对的原则，所形成的双螺旋结构。(
28、1) DNA 双螺旋结构模型要点DNA 双螺旋结构模型要点：螺旋中的两条链反向平行，两条链共同围绕一个“中心轴”呈右手双螺旋结构。 DNA 双螺旋结构模型要点：疏水的碱基（嘌呤碱和嘧啶碱）位于双螺旋的内侧，碱基平面与纵轴垂直。亲水的基团（磷酸与脱氧核糖）位于螺旋外侧，彼此之间通过磷酸二酯键连接，形成 DNA 的骨架。糖环平面与纵轴平行。DNA 双螺旋结构模型要点：双螺旋的直径为 2nm ,顺轴方向每隔 0.34nm 有一个核苷酸，两个核苷酸之间的夹角为 36，因此，沿中心轴每转一周有 10 个核苷酸。双螺旋的表面有大沟和小沟。二者交替出现。DNA 双螺旋结构模型要点：一条多核苷酸链上的嘌呤碱基
29、与另一条链上的嘧啶碱基以氢键相连，匹配成对，配对的原则是 A=T，之间形成二个氢键，GC，之间形成三个氢键。因此 DNA 的两条链互补；大多数天然 DNA 属双链结构 DNA（dsDNA ） ，某些病毒的 DNA 是单链 DNA（ssDNA） 。 DNA 双螺旋模型最主要的成就是引出“互补”（碱基配对）概念。 Watson 和 Crick 曾据此提出 DNA 的半保留复制假说。（2） DNA 双螺旋构象的多态性DNA 双螺旋构象多态性的基础： 在多核苷酸链中，脱氧核糖的五员环能折叠成多种构象； 分子还可绕 CN 糖苷键以及 3，5磷酸二酯键旋转一定的角度。这就使具有同样碱基配对的 DNA 双螺
30、旋可以采取另一些构象，DNA 构象上这种差异称为多态性。 Watson 和 Crick 所描述的 DNA 双螺旋构象为 B 型 DNA，另外还有 A 型和 Z 型等构象类型的 DNA，在一定条件下 BDNA 可转变为 ADNA 或 ZDNA。 A. ADNA ：B 型（湿度：92% DNA 钠盐纤维的构象） DNA 脱水时，就转变为 A 型， A 型 DNA 也是由反向的两条多核苷酸链组成右手螺旋。 每一螺圈含 11 个碱基对，碱基对与中轴的倾角约为 20，两个核苷酸之间的夹角为 33。RNA DNA 杂交双链即为 ADNA 结构。B. ZDNA ：磷酸基在多核苷酸骨架上的分布呈“Z” 字型。
31、直径 1.8nm，螺距 4.5nm，每一螺圈含 12 个碱基对，整个分子比较细长而伸展，大沟外凸而变得不明显，小沟则窄而深。甲基化的 DNA 在接近生理条件的盐浓度时会从 B-DNA 转变为 Z-DNA。 DNA 双螺旋结构的参数类型 旋转方向螺旋直径（nm）螺距(nm) 每转碱基对 数目 碱基对间垂直距 离（nm） 碱基对与水平 面倾角ADNABDNAZDNA右右左2.32.01.82.83.44.51110120.2550.340.3720073、DNA 的三级结构在细胞中，由于 DNA 与其它分子（蛋白质）的相互作用，使 DNA 双螺旋进一步扭曲成三级结构。 某些小病毒、细菌质粒、真核生
32、物线粒体和叶绿体以及某些细菌染色体中的 DNA 为双链环形，其三级结构为超螺旋结构。 真核细胞中，线性 DNA 分子则与组蛋白结合形成核小体，核小体再进一步盘绕压缩成更高层次的结构。(2) 核小体 真核生物中 DNA 双螺旋沿着组蛋白八聚体核心的短轴绕 1.75 圈，形成左手超螺旋，称为核小体。 许多核小体由 DNA 链连接在一起构成念珠状结构。 串珠状结构进一步卷曲形成螺线管，后者再进一步卷曲形成超螺旋管，形成染色单体。由核小体构成的念珠状结构进一步盘绕压缩成更高层次的结构。二、RNA 的分子结构大多数 RNA 分子是一条单链，其可以发生分子自身的回折从而使互补碱基区形成局部类似 DNA 的
33、双螺旋区，不能配对的碱基区域则形成突环。不同的 RNA 分子因碱基序列不同而具有不同比例的双螺旋区。（一） tRNAtRNA 的特点 : 约占总 RNA 的 10-15%。 它在蛋白质生物合成中起翻译 mRNA 信息的作用，并将相应的氨基酸转运到核糖体，参与蛋白质体的合成。 每一种氨基酸都有其相应的一种或几种 tRNA。 有较多的修饰核苷酸。1、tRNA 的二级结构为三叶草形结构（1）A-U 、G-C 碱基对构成的双螺旋区叫臂；不配对的部分叫环。tRNA 一般由四臂四环构成。 （2）叶柄aa 臂，3端： -CpCpAOH 结构，接受氨基酸。 （3）反密码环中间三个核苷酸组成反密码子。 （4）左
34、臂DHU 环 （5）右臂TC 环（含 TC 序列） （6）额外环（可变环）反密码环与右臂 TC 环之间。2、tRNA 的三级结构为倒 L 形tRNA 的三叶草型结构进一步扭曲折叠形成一种形状象倒 L 型的三维结构。L 型结构的特点： 氨基酸接受茎和 TC 茎组成一个螺旋，D 茎和反密码子茎组成另一个螺旋，这两个螺旋构成了象字母 L 的形状； 3-CCAOH 位于 L 的一端，反密码子位于 L 的另一端； 在二级结构的基础上又形成了一些新的碱基对使三叶草型结构发生扭曲。(二) rRNA 约占全部 RNA 的 80%，含量最多。 与多种蛋白质结合成核糖体，是构成核糖体的骨架，后者是合成蛋白质的场所
35、。rRNA 的种类（根据沉降系数）沉降速度是颗粒在单位离心力场中粒子移动的速度，以时间表示。蛋白质，核酸等生物大分子的 S 实际上常在 10-13 秒左右，故把沉降系数 10-13 秒称为一个 Svedberg 单位，简写 S，量纲为秒。 真核生物 rRNA：28S rRNA 18S rRNA 5.8S rRNA 5S rRNA原核生物 rRNA：23S rRNA 16S rRNA 5S rRNA（三）mRNA 约占总 RNA 的 3%-5%，含量最少，但种类最多。 成熟 mRNA 不含内含子，hnRNA 含有内含子，经转录切除内含子后成熟后的 mRNA 不含内含子。 mRNA 从 DNA 转
36、录遗传信息，并作为蛋白质合成的模板，决定蛋白质的氨基酸顺序。1.原核细胞 mRNA 的结构原核细胞 mRNA 的结构与真核细胞显著不同：5 端无帽子结构；3 端不含 polyA 结构；一般为多顺反子结构，即一个 mRNA 中常含有几个蛋白质信息，能指导几个蛋白质的生物合成；2.真核细胞 mRNA 的一般结构1) 5端有帽子结构，3端有 poly A 尾巴；2) 一般为单顺反子结构，即一种基因编码一种多肽链或 RNA 链，每个基因转录有各自的调节元件。 （一个 mRNA 中只含有一条多肽链信息，能指导一个蛋白质的生物合成）（1） mRNA 成熟过程大多数真核生物的基因为不连续基因。所谓不连续基因
37、就是基因的编码序列在 DNA分子上是不连续的，被非编码序列所隔开。编码的序列称为外显子，是一个基因表达为多肽链的部分；非编码序列所称为内含子，又称插入顺序。内含子只转录，在前 mRNA 时被剪切掉。如果一个基因有几个内含子，一般总是把基因的外显子分隔成 n+1 部分。内含子的核苷酸数量可比外显子多许多倍。（2） mRNA 的结构特点 大多数真核 mRNA 的 5末端均在转录后加上一个 7-甲基鸟苷，同时第一个核苷酸的C2 也是甲基化，形成帽子结构： m7GpppNm-。 大多数真核 mRNA 的 3末端有一个多聚腺苷酸(polyA)结构，称为多聚 A 尾。帽子结构(3) 帽子结构和 polyA
38、 尾巴的功能5帽子结构作用：1）抗核酸外切酶降解的作用；2）与蛋白质合成的正确起始有关；3）协助核糖体与 mRNA 结合。3polyA 作用：1）抗核酸外切酶降解的作用；2）与 mRNA 半寿期有关；3）与 mRNA 从细胞核到细胞质的转移有关。注意： 某些真核生物病毒也有 3 polyA； 某些真核病毒也有 5 帽子结构； 原核细胞 mRNA 一般没有 5 帽子结构。(4) mRNA 的功能 把 DNA 所携带的遗传信息，按碱基互补配对原则，抄录并传送至核糖体，用以决定其合成蛋白质的氨基酸排列顺序。第三节 核酸的理化性质及其应用一、核酸的一般性质 提纯的 DNA 为白色纤维状固体，RNA 为
39、白色粉末，都微溶于水，不溶于一般有机溶剂，因此常用 70 乙醇来沉淀 DNA； DNA 分子由于直径小而长度大， 因而 DNA 溶液黏度大于 RNA； 溶液中的核酸在引力场中可以下沉，沉降速度与分子量和分子构象有关。可用超速离心技术测定核酸的沉降常数（当分子颗粒以恒定速度在溶剂中移动时，即净离心力与摩擦力处于平衡时，单位离心力场的沉降速度为定值，称为沉降常数 S） 。 核酸是两性电解质， （含弱碱性的碱基及酸性磷酸基团） ，因磷酸的酸性强，常表现酸性。 由于核酸分子在一定酸度的缓冲液中带有电荷，因此可利用电泳进行分离和研究其特性。最常用的是凝胶电泳。电泳后 DNA 的相对位置可以通过溴乙锭染色
40、进行测定。 溴乙锭是一种扁平分子，很容易插入 DNA 分子碱基之间，从而使 DNA 分子在紫外灯下发射红橙色荧光。 一般在电泳 loading buffer 中加入溴酚蓝，起指示电泳位置的作用 二、核酸的紫外吸收性质 在核酸分子中因嘌呤碱和嘧啶碱都含有共轭双键体系，因而在 240290nm 的紫外波段有强烈吸收，在 260nm 附近有最大吸收值； 蛋白质在 280nm 附近有一吸收峰，因而可利用 OD260 /OD 280 判断核酸样品的纯度。1. 用 OD 值判断核酸纯度的依据蛋白质在 280nm 有一吸收峰，因此利用 OD 260 /OD 280 比值可判断核酸样品的纯度。纯 DNA OD
41、 260/ OD 280 值=1.8纯 RNA OD 260/ OD 280 值=2.0当 OD 260/ OD280 值 1.8 时，溶液含 RNA；当 OD 260/ OD280 值 1.8 时，溶液含蛋白质和苯酚。 2. 减色效应：核酸的光吸收值常比其各核苷酸成分的光吸收值之和少 3040%，此现象称为 DNA 的减色效应。三、核酸的变性、复性和分子杂交（一）变性 1、变性的概念：核酸的变性指核酸双螺旋的氢键断裂，变成单链的过程。并不涉及共价键的断裂。 2、变性因素能够引起 DNA 变性的因素有：o 温度升高引起热变性；o 酸碱度改变引起酸碱变性；o 变性试剂引起变性，如尿素、酰胺、甲醛
42、等；o 有机溶剂、射线、机械力等。DNA 变性的本质是双链间氢键的断裂。DNA 变性的特征： 变性后的核酸变成无规则线团，将失去其部分或全部的生物活性。 变性改变了 DNA 的二级结构。核酸的变性并不涉及磷酸二酯键的断裂，所以它的一级结构(碱基顺序)保持不变。 DNA 的变性过程是突变性的，它在很窄的温度区间内完成。 变性后 260nm 紫外吸收值明显增加，即产生增色效应。 粘度降低，浮力密度升高。增色效应：当 DNA 分子从双螺旋结构变为单链状态时，它在 260nm 处的紫外吸收值便增大，此现象称为增色效应。 （1）变性温度（Tm ） 变性温度（ Tm）：引起 DNA 发生变性的温度变化范围
43、的中点，又称熔点。或当 50% 的 DNA 变性时的温度称为该 DNA 的熔点或变性温度（tm） ，即光吸收达到最大吸收（完全变性）一半时（或双螺旋结构失去一半时）的温度； 变性作用发生在一个很窄的温度范围之内（爆发式的） ，一般 DNA 的 Tm 值在 70-85C 之间；影响 tm 值的因素： 核酸的均一程度，均一性愈高的样品，变性过程的温度范围愈小。 Tm 值与 GC 含量成正比：G-C 碱基对之间有三个氢键， A-T 碱基对之间有两个氢键，因此 GC 含量高的 DNA tm 值也高。（G-C）%=(Tm-69.3)2.44 Tm 值与介质离子强度成正比。介质离子强度较低，DNA 的 t
44、m 也低。因此 DNA 制品应保存在比较高浓度的缓冲液或溶液中。（二）复性 变性 DNA 在适当条件下，又可使彼此分开的链重新缔合成为双螺旋结构，全过程称为复性。DNA 复性后，许多理化性质、部分生物活性可得到恢复。注意：将热变性 DNA 骤然降温时， DNA 不能复性，只有在缓慢冷却时，才可复性。DNA 片断越大，复性越慢；DNA 浓度越大，复性越快。（三）分子杂交核酸分子杂交技术，是 Roy Britten 及其同事在 1968 年发明的。所依据的原理是，带有互补的特定核苷酸序列的单链 DNA 或 RNA，当它们混合在一起时，其相应的同源区段将会退火形成双链的结构。不同来源的 DNA 分子
45、（有一定的同源性）放在一起热变性，然后慢慢冷却，让其复性形成双螺旋结构的过程称为分子杂交。有互补或部分互补序列的异源 DNA 之间复性时形成的分子称为“杂交分子”。 DNA 与互补的 RNA 之间也可以发生杂交。1. 核酸分子杂交的应用1）确定两种核酸分子间的序列相似性2）检测某些专一序列在待检样品中存在与否3）是基因芯片技术的基础2. 几种杂交方法的简介DNA 探针是一个单链的 DNA，其核苷酸序列是人工特定的、已知的，经放射性标记的一条链。通过这条特定的 DNA，让探针 DNA 上的碱基和目标 DNA 的碱基配对。（1）Southern DNA 印迹杂交根据毛细管作用的原理，使在电泳凝胶中
46、分离的 DNA 片段转移并结合在适当的滤膜上，然后通过同位素标记的单链 DNA 或 RNA 探针的杂交作用检测这些被转移的 DNA 片段，这种实验方法叫做 DNA 印迹杂交技术。由于它是由 E.Southern 于 1975 年首先设计出来的，故又叫 Southern DNA 印迹转移技术。 Southern Blot：DNA-DNA 杂交：1、将 DNA 样品用限制性内切酶降解。2、用琼脂糖凝胶电泳分离。将胶浸泡在碱溶液中使 DNA 进行变性，然后将变性 DNA 转移到硝酸纤维素膜上，在 80焙烤 46h，使 DNA 牢固地吸附在硝酸纤维素膜上。3、与放射同位素标记的变性 DNA 探针进行杂
47、交，然后通过洗涤，除去未杂交上的标记物。4、将硝酸纤维素膜烘干后进行放射自显影。（2）Northern RNA 印迹技术（Northern blotting）1979 年，J.C.Alwine 等人发展而来，是将 RNA 分子 从电泳凝胶转移到硝酸纤维素滤膜或其他化学修饰的活性滤纸上进行核酸杂交的一种实验方法。由于这种方法与Southern DNA 印迹杂交技术十分类似，所以叫做 Northern RNA 印迹技术（Northern blotting） 。（3）基因芯片技术基因芯片又称为 DNA 微阵列，在一块基片（硅片，玻璃片或塑料片）表面大量固定序列已知的核苷酸的探针。当溶液中带有荧光标记
48、的核酸序列与基因芯片上对应位置的核酸探针产生互补匹配时，通过确定荧光强度最强的探针位置，获得一组序列完全互补的探针序列。据此可得到靶核酸的序列。第三章 核酸的生物合成 核酸是生物遗传的物质基础。除少数 RNA 病毒外，几乎所有的生物均以 DNA 为遗传信息载体。 在细胞分裂过程中，通过 DNA 复制把亲代细胞所含的遗传信息忠实地传递给两个子代细胞。 遗传信息通过转录传递给 RNA，再由 RNA 通过翻译转变成相应的蛋白质多肽链上的氨基酸序列，由蛋白质执行各种各样的生物学功能。中心法则：简洁明了的表述了生物遗传信息的传递方向中心法则逆转录RNADNA翻译蛋白质转录第一节 DNA 的生物合成一、DNA 的复制是指以亲代 DNA 分子的双链为模板，按照碱基配对的原则，合成出与亲代 DNA 分子相同的两个双链 DNA 分子的过程。（一）DNA 的半保留复制1、半保留复制的概念： 在 DNA 复制过程中，亲代的一个 DNA 双螺旋分子通过复制形成了两个与原先的碱基序列完全相同的子代 DNA 分子，每个子代分子中有一条链来自亲代 DNA，另一条链是新合成的，这样的复制方式，称为半保留复制。2、半保留复制的证据19
