1、生物酶解破壁提制葛根黄酮的工艺引言 葛根富含葛根淀粉和总黄酮（含量约为 1-12%）。由于我国农作物利用较粗放，葛产业基本上集中在葛根淀粉的提取1，淀粉中异黄酮含量仅占葛根总黄酮的 2.4，95以上尚留在葛根废渣被丢弃，高附加值的天然活性成分浪费严重。作为医药和保健食品的原料或添加剂2，目前，国际市场葛根黄酮每年需求量约在500800 吨，在美国，食用酮类食品的人数超过亿千多万人；而我国的每年需求量约在 150 吨左右。将生物酶促法应用到葛根黄酮的提取，主要是利用微生物充分破坏植物细胞组织结构，将植物组织分解成小分子物质，减少提取传质阻力，充分释放活性成分，具有提取物稳定、纯度高、能耗低、有机
2、溶 剂使用量少等特点3；目前，汤海鸥4、施英英5等采用纤维素酶和木聚糖酶等对提取葛根黄酮进行报道。随着人们对葛根功能性和营养性研究的深入，采用生物酶化工艺，在减少葛产业集约化发展引起的葛根废渣环境污染的同时，实现葛根废渣的资源化利用提供一条新途径。 1 主要仪器、试剂和测试方法 1.1 仪器与试剂 仪器：UV-2450 紫外可见光光度计，DELTA 320-5pH 计，RE-2000 旋转蒸发器，126P/166P 高效液相色谱仪，SPX-250-Z 振荡培养箱原料：葛废渣取至重庆北碚农村（除去葛根淀粉）试剂：葛根素（标品）；乙醇（分析纯）、正丁醇（分析纯）、硫酸(分析纯) 、氢氧化钠( 分析
3、 纯)、葡萄糖(分析纯) 、甲醇(分析纯) 1.2 实验 1.2.1 菌种培育选用黑曲霉，分别经过斜面培养、种子液体培养后，将培养好的菌种接种装入液量为 60 ml250ml 三角瓶中，接入量为 5%，29，180rpm，混合培养 48h。 1.2.2 微生物酶化提取葛根黄酮 取烘干、粉碎后过 40 目筛的葛渣样品 3.5g，加入豆粕 1.0g 至 250ml 干净的锥形瓶中，加入蒸馏水，接入一定量种子液, 设定 pH 值和发酵时间，考察接种量和培养基质及不同工艺参数对葛根黄酮溶出的影响 1.2.3 主要控制参数及发酵工艺流程 葛根渣与辅料之比为 7:2，固液比为 1:20，接种量 50%，发
4、酵温度为 30，发酵时间为 60h，pH 值为 5，豆粕的重量百分量为 5%25%；接种量为 40%；pH 值为 6，在 30下连续反应 48h 反应在生化培养箱中进行，间歇通过无菌空气(平均 10min/h) 1.3 葛根黄酮的测定 采用色谱分析方法6测定葛根素标品。精密称取葛根素标准品 5.2mg，经甲醇定容并配置成 1.04mg/ml 的标准溶液后，分别移取1ml、0.5ml、250ul、100ul、50ul、25ul、5ul 标准溶液，再用甲醇稀释并定容至 5ml；设定色谱 条件为色谱柱 C18，柱温 30，流动相为：甲醇-水（25：75），检测波长为 250nm，流速为 1.0ml/
5、min，进样体积为 10ul；通过分析检测得出峰面积绘制葛根黄酮的标准曲线。得回归方程为：y=35415x-14502， R?=0.9993。 2 结果与讨论 2.1 不同方法的对比实验 2.1.1 葛渣不同处理方式对葛根黄酮含量影响 葛根黄酮等植物有效成分大都被包裹在葛渣细胞壁中。微生物能产生木聚糖酶和内切-葡聚糖酶(CMC 酶) ，破坏葛渣细胞壁的纤维结构，甚至将其分解成小分子物质，减少提取传质阻力，有效释放葛根黄酮等活性成分。通过图 2 葛渣不同 处理方式的对比可知，采用黑曲霉和康宁木霉发酵 36h 后所得葛根黄 酮的含量均高于未发酵处理，其中黑曲霉在发酵 60h 时葛根黄 酮含量达到最
6、高，为 1.078ug/ml。 2.1.2 不同发酵方式对葛根黄酮含量影响 不同菌种对生长环境要求不一样。从图 3 可知，采用黑曲霉 进行好氧发酵在每一时段其葛根黄酮浓度均大于厌氧发酵产量，且在 60h 时能得到葛根黄酮的最大浓度为1.078ug/ml。 原因在于：黑曲霉生长会产生酶，加快葛渣纤维组织降解能力；在这过程中，充足的氧气会促使微生物生长，增加酶产生量，从而促进葛渣纤维组织的降解，提高葛根黄酮的溶出量。 此外，通入氧气还可减少因厌氧发酵造成的恶臭。 2.2 培养基质对葛根黄酮含量的影响 2.2.1 辅料碳氮源对葛根黄酮含量影响 菌种生长有一周期，需要营养底物；如果营养不足，会导致菌种
7、生长所需的能量、碳氮源等成分不足影响生长，减缓纤维素等植物组织分解减缓，阻碍葛根黄酮溶出；但如果营养过剩，又会使菌种提早达到衰亡期，使葛根黄酮溶出受抑制。从图 4 可知， 辅料豆粕加入量与葛根黄酮的含量关系呈曲线走势，3.5g 葛渣，加入豆粕量为 1.0g 时，葛根黄酮的含量最大为 0.986 ug/ml。 2.2.2 不同接种量及对葛根黄酮含量的影响 设定黑曲霉接种量为原料的20%、30%、40%、50%、60%的比例加入原料中。由 图 5 可知，接种量为 50%即菌液量为 1.75ml 时，葛根黄酮的含量最高，为 0.529 ug/ml。原因在于菌种含量对葛根黄酮溶出的影响主要表现在如加入
8、的菌种太多，当营养不足时，会加剧菌种之间的竞争，导致太多菌种提前死亡；加入的菌种太少会因营养过剩，还未与植物组织完全发生酶促反应前，便提前达到生长旺盛期顶点，随之衰亡，凋零。 2.2.3 不同发酵温度及对葛根黄酮含量的影响 酶类属于蛋白质类物质，其对温度大都非常敏感。适宜的温度不仅可以加快微生物的生长和繁殖，还可以增大酶活性，促进植物纤维的降解。由图 6 可以看出，发酵温度对葛根黄酮影响很大，在温度为 30C 时，葛根黄酮含量最高为 1.4719 ug/ml。 2.2.4 不同 pH 值及对葛根黄酮含量的影响 体系环境的酸碱性也会影响菌种的生长。由图 7 可以看出，当体系的 pH 值为 5 时
9、，黑曲霉生长最适应，葛根黄酮其浓度能达到最大值，为 346.63 ug/ml。 2.3 超声波萃取葛根黄酮产品 2.3.1 最佳单因素条件的复合实验 通过单因素探讨，确立出生物酶化法提取葛根黄酮的最佳实验条件；取葛渣 3.5，选定各最优单因素条件，进行最优单因素的复合实验，经高效液相色谱法分析，谱图如图 8（a）；测得葛根黄酮浓度为 37.688ug/ml，葛根黄酮含量明显高于任一单因素所得值；对照标品的液相色谱图图 8（b），其峰型与出峰世界时间相似；此外，样品谱图在 9 分钟前还存在其他峰，说明采用生物酶促反应，还可以得到葛渣其他活性成分。 2.3.2 超声波协助生物酶化反应提高产品含量
10、为充分提高葛根黄酮产率，在获得生物酶化反应的最佳工艺条件基础上，分别选用 3.5 克葛渣，通过提取产品量，考察超声波协同作用。其结果见表 1。从图 9 可知，生物酶化反应获得葛根黄酮为 1.446mg/g,而超声波 协同生物酶化反应获得葛根黄酮为2.974 mg/g，含量明 显 高于其他两种反应，葛根黄 酮含量结果表明超声空化作用有助于破坏细胞膜，促进黄酮类化合物释放与溶出,且超声波的不断震荡和热效应,不仅有助于溶质扩散,同时对原料起水浴作用。 3 结论 （1）从生物多样性出发，采用生物酶促反应有助于葛渣中葛根黄酮溶出，并经超声波协同处理葛根废渣后，葛根黄酮含量较单一处理的产物高。 （2）从微生物发酵过程中影响因素出发，选用黑曲霉菌种，最优发酵工艺条件为：菌种接种量为 50%，固液比为1：20，葛根渣与辅料之比为 7：2，发酵温度 30，发酵时间 60h，pH 值为 5，能得到葛根黄酮浓度为 37.688ug/ml，葛根黄酮含量为每克葛渣含葛根黄酮 1.446mg/g；超声波处理能得到 2.974 mg/g。中国硕士论文网提供大量免费硕士毕业论文,如有业务需求请咨询网站客服人员！
