1、双水相萃取技术在生物活性物质分离中的应用(华东理工大学化学与分子工程学院,上海 200237)摘要： 双水相萃取技术作为一种不破坏生物活性的分离手段，一直受到广泛的关注。本文中，综述了近年来抗生素、酶、蛋白质等生物活性物质的的的双水相萃取方法。 关键词：双水相萃取，生物活性物质The Application of Aqueous Two-Phase Extraction in the Segregation of Bioactive Substance（School of Chemistry and Molecular Engineering, East China University of
2、 Science and Technology, Shanghai 200237）Abstract: As the separation method does not destroy the biological activity of aqueous two-phaseextraction technology has been subject to widespread concern. This article reviews therecent years, antibiotics, enzymes, proteins and other bioactive substances i
3、n theaqueous two-phase extraction method. Keywords: aqueous two-phase extraction, bioactive substance1 引言某些亲水性高分子聚合物的水溶液超过一定浓度后可以形成两相，并且在两相中水分均占很大比例，即形成双水相系统（Aqueous Two-Phase System,ATPS） 。利用亲水性高分子聚合物的水溶液可形成双水相的性质，在 1956年, 瑞典的Albertsson首次开发了双水相萃取法（Aqueous Two-Phase Extraction）来提取生物物质，自此对于双水相体系的研究和应
4、用逐步展开, 并取得了一系列研究成果。由于传统溶剂萃取法所需试剂较为单一，蛋白质和酶在有机溶剂中得溶解度低并且会变性，双水相萃取技术在生物萃取方面有很大的优势，其特点是能够保留产物的活性，整个操作过程可连续化，在除去细胞或细胞碎片时，还可以纯化蛋白质。双水相萃取中最常见的就是聚乙二醇(PEG)/葡聚糖(Dextran)和 PEG/无机盐(硫酸盐、磷酸盐等) 体系，其次是聚合物/低分子量组分，Gutowski 等于 2003 年首次提出了离子液体双水相的概念，研究发现了亲水性离子液体BmimCl 和水合磷酸钾可以形成上相富集离子液体和下相富集磷酸钾的双水相体系，并且证明这一双水相体系可能在分离萃
5、取上有极好地应用。此外，还有被称为智能聚合物的双水相体系被开发出来，这些新兴的分离体系是通过刺激-相应型聚合物(Stimulus-responsive polymers)当外界环境(如温度、pH值、离子强度、外加试剂、光、电场或磁场等)发生快速、可逆的转变，使其从亲水性变为疏水性，从而提升分离效率。本文综述了关于双水相萃取技术在抗生素、酶、蛋白质、激素等生物活性物质提取工作中的应用2 双水相萃取在生物活性物质提取中的应用2.1 萃取分离抗生素朱自强等 1用8% 的PEG 2000与20%的(NH 4)2SO4组成的双水相体系直接萃取青霉素G发酵液，分配系数高达58.39，浓缩倍数为 3.53，
6、回收率为93.67%，青霉紊G对糖的分离因子和对杂蛋白的分离因子分别为 13.36和21.9。Su2在室温以及pH=10的条件下，利用16.1%的PEG 和12%的硫酸盐，0.5molL -1高氯酸钠组成的双水相体系成功地从鸡蛋蛋清中分离出高纯度的溶解酵素。刘庆芬等 35用BmimBF 4/NaH2PO4双水相体系分离了青霉素G 钾盐，考察了NaH2PO4浓度、青霉素浓度以及离子液体用量对双水相形成和萃取率的影响。结果表明：离子液体双水相萃取青霉素是一项高效分离新技术，体系pH 为45时，青霉素的萃取率可达93.7%，萃取过程不发生乳化现象，而且青霉素的降解率也有所降低。Jiang等 6在采用
7、相同的体系萃取青霉素后，又采用憎水性离子液体BmimPF6对富离子液体相进行了二次萃取，以此实现离子液体与青霉素的分离。赵弟海等 7建立了由亲水性离子液体EPyBr和K 2HPO4形成的双水相体系对鸡蛋中痕量氯霉素(CAP)检测的高效液相色谱方法。优化了离子液体EPyBr和K2HPO4成相的条件，研究了萃取CAP 的最佳体系。采用混合溶液(pH 7磷酸盐溶液、NaCI溶液、甲醇 )提取样品，离子液体双水相体系富集，V(甲醇)：V( 水) ：30：70为流动相，流速1.0 mL/min，UV检测器，检测波长278 nm，柱温25，进样量20L。对鸡蛋中氯霉素残留进行了测定，在0.0515 mg/
8、L范围内，CAP的响应峰面积与其相应浓度呈良好相关性(r=0.9994)。不同浓度的回收率为90.3%101.7%，相对标准偏差为 1.7%2.6%。该方法检测鸡蛋中氯霉素残留具有干扰小、速度快、灵敏度高等优点。最低检出限为1g/kg。张建敏等 8提出了一种在离子液体双水相中抗生素类药物制备分离一体化的新方法，即亲水性离子液体溶液酸化后加入无机盐形成双水相从水溶液中析出，抗生素盐或者抗生素发酵滤液分离富集于离子液体相。体系中水溶液为循环母液，离子液体本身又不挥发，因此离子液体不损失，可以循环使用。2.2 萃取分离酶Babu等 9用18%的PEG 1500与14%的磷酸盐组成的双水相从菠萝中萃取
9、菠萝蛋白酶和多酚氧化酶，菠萝蛋白的纯化倍数为4.0，酶活性恢复达到22.8%，而多酚氧化酶的纯化倍数为2.07，酶活回收率达到90%。Sarote等 10利用80%的 PEG及15%的(NH 4)2SO4组成的双水相体系从木瓜乳浆中萃取出高纯度的木瓜蛋白酶。Mirjana11利用PEG 4000/Dex体系从Polyporus squamosus发酵液中分离果胶酶，该酶主要分配在上相，酶活回收率80.2%，纯化倍数2.45。Duarte等 12采用16%的PEG 6000和8%的磷酸盐组成的双水相系统从3种不同的微生物中纯化碱性木聚糖酶，净化因子为57，产量为41%。Pan等 13利用PEG
10、1500/NaH2PO4体系从Trichoderma koningii发酵液中分离纯化-木糖苷酶，该酶主要分配在下相，下相酶活回收率96.3%，纯化倍数33。Wu等 14利用PEG 8000/(NH4)2SO4体系从Kluyveromyces marxianus发酵液中分离胞外多聚半乳糖醛酸酶，该酶主要分配在上相，酶活回收率9l%，纯化倍数19。黄瑛等 15采用10% 的PEG 2000/15%的磷酸盐和1%的NaCI 组成的双水相系统从洋葱假单细胞G-63发酵粗酶液中提取脂肪酶，当系统的pH为8.0时，分配系数4.36，纯化因子3.98，脂肪酶的回收率达到87.25%。张兰威等 16采用20
11、%的PEG 1000/25%的MgSO 4组成双水相萃取技术，提取风干香肠中的蛋白酶，在此体系中风干香肠的蛋白酶主要分布在上相，最高酶活为12.37Ug -1.纯化倍数为 4.61，回收率为85% 。苏玉春等 17采用19%的PEG 4000/10%的NaH 2PO4组成最优组成，从黑曲霉AS3.4309的发酵液中提取木聚糖酶，分配系数和上相产率分别为6.23和88.67%。王蕾等 18采用30%PEG/20%的NaH 2PO4在pH值6，在此条件下GeotrichumspSYBCWU-3脂肪酶粗酶被纯化了22 倍。房耀维等 19在采用pH值5.0的15%的PEG 1000/15%的磷酸盐双水
12、相体系从Pseudoalteromana arctic GS230 发酵液中直接萃取分离低温-淀粉酶，得到最优的纯化倍数为4.8回收率为87%。周念波等 20采用20%PEG600/20%(NH 4)SO4/0.1%NaCl且pH 值6.0时双水相体系最优化直接从Bacillus sp.LS发酵液上清液中分离壳聚糖酶，分配系数为5.91，萃取率达88.7%。舒国伟等 21利用26%PEG4000/8%(NH 4)SO4且pH值4.8最优化萃取纤维素酶，分配系数为5.21，萃取率为79.4%。张娟等 22利用27%PEG1000/19%(NH 4)SO4/0.002%NaCl且pH 值5.0时最
13、优化了果胶酶的提取条件，分配系数达到14.0陈丽梅等 23研究了葡萄糖氧化酶的提取条件，发现在25%PEG4000/10%(NH4)SO4的双水相体系下可以得到最优化条件，萃取率为81.11%，分配系数为0.134。2.3 萃取分离蛋白质刘杨等 24以PEG/硫酸钠双水相体系，经一次萃取从钝顶螺旋藻(Spirulina platensis)细胞破碎液中富集分离藻蓝蛋白。结果表明，萃取最适宜的条件为12%PEG 4000，15%Na 2SO4，1%KCl，藻蓝蛋白收率为 91.2%，分配系数达到8.01，分离因数达到6.33。对于螺旋藻藻蓝蛋白的富集分离，双水相萃取法与传统的盐析沉淀法相比，具有
14、节省操作时间、简化操作过程、降低能耗和成本以及易于工艺放大等优点。Long等 25描述了生物偶联技术对胶状金纳米粒子在聚乙二醇(PEG)/葡聚糖双水相系统(ATPS)中分离蛋白质的影响。山葵过氧化物酶(HRP)通过直接吸附结合胶状Au纳米粒子。虽然HRP很少存在于相中，但HRP/Au纳米粒子结合分离到PEG相，结合15nm胶状金的因子高达150:1。其他蛋白质/ 金纳米粒子结合在右旋糖酐相中分离大于2000:1，而自由蛋白为5:1。分离程度取决于聚合物浓度，分子量，纳米粒子宜径，在某些情况下取决于纳米粒子在ATPS中的浓度。通过结合金纳米粒子大幅度提高蛋白质分离，在既不改变蛋白质的化学性质或聚
15、合物的亲和力配体，增加聚合物浓度，也不增加盐类浓度的情况下，很大程度上归因于偶联物表面积的增加。吸附胶体粒子从而提供一个有吸引力的路线，以增加酶和其他蛋白质在ATPS中的分离。此外，这些结果表明在净化生物分子/纳米粒子结合中ATPS分离作为一个强有力的手段，正越来越多地应用于诊断和材料方面。Silva等 26研究了不同分子量的PEG和pH值在聚乙二醇(PEG)+磷酸钾+尿素+水双水相体系中的液-液平衡，描述了实验技能和分析方法，得出了25时PEG(1450，3350，10000)+磷酸钾(pH7和9)+ 尿素(质量分数为6%)+水的双水相体系的平衡数据。每个体系测得了4条连接线。研究了25时p
16、H 7和9，尿素质量分数为3% 和6% 的体系中溶解酵素、过氧化氢酶、肛牛乳糖的分离现象。邓凡政等 27引用亲水性离子液体BmimBF 4/KH2PO4双水相体系萃取分离牛血清白蛋白(BSA)，研究了不同种类盐、盐的浓度、离子液体浓度以及蛋白质浓度、溶液pH及其他共存物质对双水相体系的影响和 BSA萃取效率的影响。结果表明，KH 2PO4浓度为80 g/L，离子液体浓度为160240 g/L，BSA浓度为3050 mg/L，溶液酸度在pH 48之间，离子液体双水相体系对BSA有较高的萃取率。邓凡政等 28还在离子液体BmimBF 4和NaH 2PO4形成的双水相体系中，研究了茜素红S(ARS)
17、 与牛血清白蛋白 (BSA)作用形成复合物的光谱行为及离子液体的用量、盐的浓度、溶液酸度及共存物质对体系成相及复合物测定影响。结果表明，在总体积为5.00 mL的离子液体双水相中，离子液体用量在1.5 mL，磷酸二氢钠量在2.0 g，茜素S 1.0 mL，ARS 与BSA复合物吸光度较大。在离子液体相中，复合物摩尔吸光系数(占)为2.81*10 -4Lmol-1cm-1，最大吸收波长在53lnm，比单纯ARS红移109 nm，并初步探讨了茜素红S 与牛血清白蛋白之间的作用机理。Ruiz-Angel等 29测定了BmimCl/K 2HPO4和BmimC1/K 2CO4双水相体系的相图，并结合逆流
18、色谱分离了卵清蛋自，分配系数高达180，而传统的双水相体系PEG/K 2HPO4的分配系数仅为1.4。Du等 30首次报道了采用离子液体BmimCl/K 2HPO4双水相体系直接从人类的尿液中萃取分离蛋白质，分相后蛋白质富集于上层离子液体相，分配系数在10左右，可以实现蛋白质的在线分离和量化分析。王军等 31研究了新型离子液体NebmBF 4和KH 2PO4形成的双水相体系对牛血清白蛋白(BSA)的萃取行为，考察了盐的加入量、离子液体浓度、溶液pH、蛋白质浓度等因素对萃取率的影响。结果表明:当KH 2PO4的加入量为85 g/L、离子液体浓度在200250 g/L、BSA的浓度60120 mg
19、/L、溶液酸度在pH 4.57.0时，其萃取率达98.0%以上。同时将该体系应用于萃取-淀粉酶，萃取率达到98.5%。2.4 萃取其他生物活性物质Luechau等 32研究了聚乙二醇-磷酸盐双水相体系分离DNA(pDNA)，让一个高分子量(HMW)PEG 1450和一个低分子量(LMW)的聚合物PEG 300与磷酸氢二钾结合。实验结果表明质粒pTX0161在PEG-磷酸盐双水相具有不同的分配系数。在HMW PEG(PEG 1450-磷酸盐体系)，pDNA只分离到下相。在 LMW PEG(PEG 300一磷酸盐体系)，pDNA根据双水相体系中的相组分、体系温度和溶菌液的浓度分离到不同相。在体积比
20、大于1的体系中，pDNA主要分离到上相。体积比在0.51时，pDNA主要分离到界面。体系比小于 0.5的体系，大部分pDNA 在下相。在425时，分离到上相的量减少，但是分离到界面的量稳步增多。在25时，大于80% 的pDNA 分离到界面。随着温度上升至40 ，分离到下相的量稳步增多，分离到界面的量下降。在20时，pDNA分离到界面的量逐渐增多，溶菌液浓度为60%W/W 时，达到80%的最高回收率。在25时，大于80%的pDNA从浓度大于35%W/W 的溶菌液分离到界面。在30“C溶菌液浓度为。020%时，pNDA由上相转到界面。Tubio等 33研究确定了从- 胰凝乳蛋白酶(ChTRP)中分
21、离胰岛素(TRP)的最佳条件，并将其应用到用聚乙二醇/柠檬酸钠(PEG/NaCit)双水相体系从牛胰腺中液一液萃取胰岛素。研究发现PEG的分子量、pH和连接线长度影响TRP和ChTRP的分离。由分子量为3350的PEG和柠檬酸钠形成的双水相体系在 pH为5.20表现为最好的分离。NaCl的加入量达到7%(W/W)时上相/下相的体积比下降到0.1，这导致胰腺TRP 在上相的回收率达到60%，是净化的3倍。生物质量达到总体系的25%(W/W)不影响产量和净化参数。Salabat等 34研究了L-色氨酸、L-苯基丙氨酸、L- 酪氨酸3种氨基酸298.15K时在聚乙二醇+盐+ 水双水相体系中的分离现象
22、，分相盐为硫酸镁、硫酸钠、硫酸铵，并且还研究了连接线长度、盐、侧链结构对氨基酸分配系数的影响。结果表明，增加氨基酸的疏水性和连接线的长度会使分配系数相应的增加。另外，含有Na 2SO4的体系比其他2种盐氨基酸的分配系数大。实验数据由改进后的Virial-type模型计算，比较模型与实验数据得出具有很好的一致性。He等 35应用BmimCl/K 2HPO4从人尿液中萃取分离了睾丸激素、表睾酮，经RP-HPLC分析，一步萃取效率可达 80%90%，为药物分析提供了新的方法。3 结论与展望双水相萃取技术是近年来新发展起来的分离技术，所需设备简单，条件温和，易于操作，且可以获得较高的收率和较纯的有效成
23、分，与常规的有机溶剂萃取技术相比较，最大的优势在于可保持生物物质的活性和构象，因此在生物工程、药物分析、环境科学等方面有着广阔的应用前景。然而，相关研究和应用还不够深入，一些技术难题还有待解决。双水相萃取技术的发展趋势为：(1)解决易乳化，相分离时间长、成相聚合物的成本较高、水溶性高聚物粘度较大且不易定量控制等问题；(2)开发新型优质的双水相体系；(3)进一步拓宽应用领域；(4)与其他技术结合的多元化利用。今后，随着对双水相体系研究的深入，以及其他双水相体系的不断开发，例如离子液体双水相体系，其形成机理，热力学模型、动力学模型以及工艺技术等方面的问题最终会被突破和解决，其应用领域将进一步拓宽，
24、双水相萃取将会成为一种优良的分离技术。参考文献：1 朱自强，关怡新，李勉.双水相系统在抗生素提取和合成中的应用J化工学报2001,52(12):10391048.2 Su C K，Chiang B H.Partitioning and Purification of Lysozyme from Chicken Egg White Using Aqueous Two-Phase SystemJ.Process Biochemistry，2006，41(2):257263.3 刘庆芬，胡雪生，王玉红，等.离子液体双水相萃取分离青霉素J科学通报，2005，50(8):7567594 LIU Qing
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