1、微生物生物技术是一门将微生物相关的上游研究技术和下游加工技术紧密联系起来的一门学科，其主要任务就是在全面了解微生物理论知识的基础上，通过研究运用各交叉学科的相关知识，为微生物资源的开发、利用、控制和改造提供理论依据并建立可行的模式。涉及分子生物学、微生物学、生物化学、遗传学、细胞生物学以及化学工程学等多个学科。通过本课程的学习，要求大家初步掌握运用微生物资源生产发酵产品以及防治有害微生物的原理和方法，为全面学习生命科学理论和生物技术奠定基础。显微技术、检测技术、无菌技术、生长测定技术、培养分离技术、育种技术和保藏技术七大微生物基本操作技术是生物技术的基础和核心之一。丰富的微生物资源：细菌、放线
2、菌、酵母菌、霉菌等存在于土壤、水体、空气各种环境，包括极端环境促进自然界的物质循环和转化与农业、工业发酵、医学等有非常密切关系微生物的应用：1. 直接利用微生物营养菌体单细胞蛋白（Single Cell Protein, SCP ） 、酸奶、微生态制剂、疫苗，酵母片、蘑菇和受体菌等2. 利用微生物代谢产物包括初级代谢产物和次生代谢产物，各种氨基酸、有机酸、抗生素、酶类等3. 利用微生物的基因主要是不可培养微生物采样提取总的 DNA 基因克隆 目的基因表达4. 利用微生物的新陈代谢微生物的分解、转化、修饰作用5. 利用微生物的拮抗作用生物防治、生物农药等应用领域：1. 在环境污染物治理与修复中的
3、应用（Bioremediation）环境污染的发生综合治理微生物所起的重要作用固体废物、污水等2. 在发酵工业中的应用有机酸：柠檬酸、乳酸、乙酸等氨基酸：各种氨基酸，如谷氨酸等抗生素：青霉素、链霉素酶制剂等：工业用酶：如蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶科研用酶：如限制性内切酶等 3. 在农业中的应用肥料：固氮菌肥，磷细菌肥料，钾细菌肥料杀虫剂： 病毒杀虫剂真菌杀虫剂（白僵菌）农用抗生素：5406植物生长促进剂等 4、在医学中的应用：疫苗的制备和大规模生产；抗生素治疗；针对病原菌开展的以预防、治疗疾病为目的的各项研究；5. 技术应用 PCR（从嗜热菌中分离的 DNA 聚合酶） 利用质粒、病毒为载体进行基
4、因工程研究； 利用细菌细胞固定化技术进行发酵生产； 基因工程技术。1988 年 Saiki 等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌( T. aquaticus) 中提取到耐热 DNA 聚合酶。耐高温 ，94C 时半衰期为 40min；72 C 下催化 DNA 合成，该酶的发现促进了PCR 的应用6、特殊应用 华人科学家发现降解疯牛病蛋白的酶； 能“挤出”石油的细菌； 能制氢的细菌； 能治理污水的细菌； 能清洁土壤中毒素的细菌； 能协助排雷的细菌；微生物技术发展简史微生物技术：直接或间接的利用微生物、微生物的机能、微生物的组成部分或其代谢产物来加工生产产品，或为社会提供服务的技术。1. 传统酿造：各种
5、酒类、酸奶、乳制品2. 微生物的发现（ Antony van Leeuwenhoek, 1632-1723) 3. 微生物与发酵的关系 Louis Pasteur（1822-1895） 酒病，巴斯德消毒，传染病4. 柯赫（ Robert koch, 1843-1910 ） 建立纯培养技术 柯赫法则 促进了医学微生物和发酵工业的发展5. 弗 莱明（Fleming）发现青霉素，开创了抗生素工业，也促进了发酵工业6. 现代微生物技术的发展 各个领域中的应用 各种水平的应用 各种不同目的 与其他学科紧密联系微生物的特点： 体积小、面积大 吸收多、转化快 生长旺、繁殖快 适应强、易变异 分布广、种类多常
6、用微生物类群微生物是一切肉眼看不见或看不清楚的微小生物的总称。包括属于原核类的细菌、放线菌、支原体、衣原体、立克次氏体和蓝细菌（过去称蓝藻或蓝绿藻） ，属于真核类的真菌（酵母菌和霉菌） 、显微藻类、原生动物，以及属于非细胞类的病毒、类病毒和朊病毒等。 细菌细菌的基本形态：球形 球菌：直径 0.52um杆形 宽长 0.5115um 大肠杆菌：0.52um螺旋形 宽长 0.51150um 其它形状：丝状、三角形、方形等异常形态：畸形：由于化学或物理因素刺激，阻碍了细胞的发育，从而引起了异常的形态。衰颓形：由于培养时间过长，营养缺乏，代谢排泄物浓度积累过高等使细胞衰老而引起的异常形态细菌的基本结构：
7、一般结构：细胞壁，细胞膜，核区，细胞质；特殊结构：荚膜，芽孢，鞭毛革兰氏染色：（1）细菌细胞壁细胞壁：位于细胞最外层的一层厚实、坚韧的外被，主要成分是肽聚糖，具有固定细胞外形和保护细胞不受损伤等生理功能。 细胞壁的生理功能： 提高机械强度、固定细胞外形、保护细胞不受损伤 为细胞生长、分裂和鞭毛运动所必需 一定的屏障作用（阻碍有害大分子的进入） 与细菌抗原性、致病性及对噬菌体的敏感性有关（2） 细胞壁的分类革兰氏阳性菌(G+) 肽聚糖 磷壁酸革兰氏阴性菌(G-) 脂多糖 磷脂 脂蛋白 肽聚糖（3）革兰氏染色：阳性菌 G+紫色; 阴性菌 G-红色细胞固定结晶紫初染碘液媒染乙醇脱色番红复染革兰氏染色
8、原理：通过初染和媒染后，细胞内形成了不溶于水的结晶紫-碘的大分子复合物。革兰氏阳性细菌由于细胞壁较厚、肽聚糖含量较高和其分子交联度较紧密，故在用乙醇洗脱时，肽聚糖网孔会因脱水而明显收缩，加上它基本不含类脂，故乙醇处理不能在壁上溶出缝隙，因此，结晶紫与碘复合物仍牢牢阻留在细胞壁内，使其呈现紫色。而革兰氏阴性细菌因其壁薄、肽聚糖含量低和交联松散，故遇乙醇后，肽聚糖网孔不易收缩，加上它类脂含量高，所以当乙醇把类脂溶解后，在细胞壁上就会出现较大缝隙，复合物容易溶出细胞壁，因此通过乙醇脱色后，细胞又成无色。这时再用红色染料进行复染，革兰氏阴性细菌获得一层新的颜色红色，而革兰氏阳性菌则仍呈紫色。放线菌1
9、放线菌的形态构造 细胞呈分枝丝状，介于细菌和真核生物之间；与细菌相似 细胞壁主要为肽聚糖 革兰氏染色阳性原核 单细胞、多核菌丝直径与细菌相仿2 菌丝基内菌丝（一级菌丝、营养菌丝）气生菌丝（二级菌丝）孢子丝（繁殖菌丝）无细胞壁真细菌支原体：介于细菌、立克次氏体之间。不具细胞壁，细胞膜含甾醇类。G-，直径0.20.25um，可滤过。已知可独立生活的最小的细胞型生物。可人工培养，营养要求苛刻，油煎蛋菌落。 立克次氏体：介于细菌、病毒之间，专性真核活细胞内寄生，不能人工培养。不滤过，直径 0.3-0.6um，存在与寄主细胞质和核中。细胞球状或杆状，不运动。G-，膜疏松，酶系统不完全，不完整的产能代谢，
10、抵抗性差。衣原体：介于立克次氏体、病毒之间。可滤过，专性活细胞内寄生。G-，“ 能量寄生物 “。古菌1.古细菌细胞的结构特点 细胞壁古细菌细胞壁物质极为多样：类似肽聚糖的物质、假肽聚糖(假胞壁质) ，多糖、蛋白质和糖蛋白。有的古细菌细胞壁含假肽聚糖(假胞壁质) ；而有的古细菌则是由两个双向的、不完全结晶的蛋白质或糖蛋白在细胞表面排列而成的表层；其它古细菌在原生质膜外有厚的多糖的细胞壁。古细菌有鉴别性的特征之一是在原生质膜中脂类的性质不像细菌的脂类由酯键连接甘油，而和真核生物一样由醚键连接甘油，它们的脂类也是长链和分支的脂肪酸。古细菌的 DNA：与细菌的染色体相似，由不含核膜的单个环状 DNA
11、分子构成，但大小通常小于大肠杆菌的 DNA。古细菌的核糖体：同细菌的核糖体同样大小，但在某些特性上，它们与真核生物的核糖体相似。如对抗生素链霉素和氯霉素的抗性及对白喉毒素的敏感性。细菌和古细菌的差异 特 征 细 菌 古 菌细胞壁 有胞壁酸 无胞壁酸脂类 酯键连接 醚键连接甲烷生成过程 没有 可能有RNA 多聚酶 一个 几个起始 tRNA 甲酰甲硫氨酸 甲硫氨酸核糖体 链霉素和氯霉素敏感白喉毒素抗性链霉素和氯霉素抗性白喉毒素敏感古细菌的生长环境：极端环境真核微生物酵母菌：泛指能发酵糖类的各种单细胞真菌1 特点 单细胞状态 出芽繁殖 发酵糖类产能 细胞壁含甘露聚糖 含糖量高、酸度较大的水生环境2
12、酵母的形态酵母细胞的形态与构造细胞大小：细菌的 10 倍细胞形态：球状、卵圆状、柱状、香肠状3 酵母菌与生产和生活的关系 酒类的生产 面包的制作 乙醇甘油发酵 石油及油品脱蜡 饲用药用 单细胞蛋白生产 SCP 活性物质提取 微生物学研究 真核表达系统 人类疾病霉菌: 菌丝体发达而又不产生大型肉质子实体的丝状真菌 。1 分布:只要有有机物就有霉菌的踪迹有机分解者：纤维素和木质素2 霉菌的细胞形态与构造 霉菌营养体的基本单位是菌丝，其直径通常为 310mm，与酵母菌相似菌丝的分类（菌丝中是否有隔膜）: 无隔菌丝：毛霉、根霉 有隔菌丝：曲霉、青霉3 霉菌与生产和生活的关系 工业产品：有机酸、酶制剂、
13、抗生素、维生素、生物碱、生物活性物质、药物 食品的生产制造：酱油、干酪 工农业产品的霉变 植物病原菌 疾病：真菌毒素、黄曲霉毒素蕈菌繁殖方式:无性繁殖芽殖、裂殖，产生分生孢子、粉孢子。有性繁殖 产生担孢子过程担子的类型同担子：无隔膜的担子异担子：有隔膜或不是典型的担子 藻类:藻类分布广，绝大多数生活于水中 。个体大小相差悬殊，小球藻 3-4m ，巨藻长 60m。具叶绿素 chlorophy11，能进行光合作用的自养型生物。没有真正的根、茎、叶的分化。繁殖器官简单，以单细胞的孢子或合子进行繁殖，无胚。原生动物 原生动物是可运动的真核单细胞原生生物。 原生动物是最简单、最原始、最低等的动物，由单个
14、细胞构成的，这个细胞既具有一般细胞的基本结构，又具有一般动物所表现的生活机能。原生动物门主要特征原生动物是最原始的、最低等的单细胞动物。结构简单功能齐全，由细胞起来完成。营养方式：光和营养（植物性营养或自养）动物性营养渗透营养呼吸和排泄主要靠体表的渗透作用来完成。都具激应性生殖方式：无性生殖：二分裂、出芽生殖、复分裂生殖（裂体和孢 子生殖）有性生殖：配子生殖（同配生殖和异配生殖） 接合生殖个体小，分布广。其它微生物资源: 极端微生物 未培养微生物微生物的分类地位三域：细菌域（真细菌域） 、古生菌域（古细菌域） 、真核生物域。数值分类法（统计分类法）分类原则是：分类时视每个性状为同等重要，以避免
15、分类者的主观偏见，使结果比较客观。根据尽可能多的性状分类，以揭示分类单位间的真实关系。按性状的相似度归为等同分类单元。步骤: 分类对象与性状的选择：为达到更客观和精确区分的目的，选择的性状应尽可能多，通常不应少于 50 个，多者可达上百个甚至几百个。性状编码将观察和测得的性状用计算机所能识别和运算的符号记录下来。相似度系数的计算：相似度系数是被比较的 OTU 对偶间整体相似程度的度量，它是根据每一对性状的相似程度计算出来的。最简单的方法是计算对偶间相似性状的数目。其计算公式如下：S=NS/（ NS+ND）上式中的 NS 表示比较的 OTU 对偶有相同性状的数目，ND 表示被比较的 OTU 对偶
16、有不同性状的数目。算出的相似度以百分数或比例表示。系统聚类（或等级聚类）：根据相似度系数对 OTU 进行系统（或等级）聚类归群，得到相似度矩阵，即 S 矩阵。然后再由此矩阵转换成能显示这 10 个菌株相互关系的树状谱。大约是 75%相似度的表观群可视为同一种，比值达 65%以上者可归入同一属。分类特征:细胞的形态和习性水平：观察细胞的形态特征、运动性、酶反应、营养要求和生长条件等。细胞组分水平：细胞组成成分例如细胞壁成分，细胞氨基酸库，脂类，醌类，光合色素等的分析。蛋白质水平：氨基酸序列分析、凝胶电泳和各种免疫标记技术。核酸水平：核酸分子杂交，G+Cmol值的测定，遗传信息的转化和转导， 16
17、S 或 18S rRNA 寡核苷酸序列分析，重要基因序列分析和全基因组测序等。生产菌株的筛选1 样品采集和筛选条件设计土壤中的环境条件营养、水分、空气、酸碱度、渗透压和温度条件都适于微生物的生活，是微生物的大本营、也是人类最丰富的“菌种资源库” 。土壤中微生物的数量按种类递减细菌放线菌霉菌酵母菌藻类原生动物108 107 106 105 104 103 个/g菌株的分离和筛选一般可分为采样、富集、分离、产物鉴别、菌种鉴定、菌种保藏几个步骤。根据筛选的微生物类型及代谢特点设计筛选条件；主要包括培养基和培养条件。2 微生物分离纯化技术随机筛选法分离纯化微生物：平板划线；稀释涂布选择性分离纯化微生物
18、：选择性培养基；特殊的培养条件3 高通量筛选与自动化技术是指以分子水平和细胞水平的实验方法为基础，以微板形式作为实验工具载体，以自动化操作系统执行试验过程，以灵敏快速的检测仪器采集实验结果数据，以计算机对实验数据进行分析处理，同一时间对数以千万样品检测，并以相应的数据库支持整体系运转的技术体系。 高通量筛选技术体系的组成 样品库：样品主要有人工合成和从天然产物中分离纯化两个来源。自动化的操作系统：自动化操作系统利用计算机通过操作软件控制整个实验过程。高灵敏度的检测系统： 检测系统一般采用液闪计数器、化学发光检测计数器、宽谱带分光光度仪、荧光光度仪等。高通量筛选技术采用的先进检测方法光学测定技术
19、。放射性检测技术。荧光检测技术。多功能微板检测系统。高通量筛选模型：常用的筛选模型都在分子水平和细胞水平，观察的是药物与分子靶点的相互作用，能够直接认识药物的基本作用机制。 微生物育种：是以提高微生物菌株生产性能为目标，人为改造微生物菌株的遗传性能的过程。主要微生物育种技术：诱变育种代谢调控育种基因重组育种基因工程育种诱变育种的基本原理：利用一些物理和化学的因素处理微生物细胞，使其遗传性状发生随机的突变，得到大量性状各异的突变株，然后再从众多突变菌株中以一定的方法筛选出生产性能改善的个体。突变的类型1、狭义突变内在机理：碱基置换（转换和颠换） 、移码突变。突变的结果：同义突变、错义突变、无义突
20、变。2、广义突变基因突变和染色体畸变诱变剂：用于处理微生物以使其发生突变的物理或化学因素。可分为物理诱变剂和化学诱变剂两种。代谢调控育种代谢控制发酵大体过程如下：以生物化学和遗传学为基础，研究代谢产物的生物合成途径和代谢调节的机制，选择巧妙的技术路线，通过遗传育种技术获得解除或绕过了微生物正常代谢途径的突变株，从而人为地使有用产物选择性地大量合成和累积。代谢控制发酵的关键，取决于微生物代谢调控机制是否能够被解除，能否打破微生物正常的代谢调节，人为地控制微生物的代谢。初级代谢产物：微生物产生的对自身生长和繁殖必须的物质。而产生这些物质的代谢体系称为初级代谢。初级代谢体系具体可分为：分解代谢体系，
21、包括糖、脂、蛋白质等物质的降解，获取能量，并产生 5-磷酸核糖、丙酮酸等物质，这类物质是分解代谢途径的终产物，也是整个代谢体系的中间产物；素材性生物合成体系，主要合成某些小分子材料，如氨基酸、核苷酸等等；结构性生物合成体系，用小分子合成产物装配大分子，如蛋白质、核酸、多糖、类脂等。次级代谢是指微生物在一定的生长时期，以初级代谢产物为前体，合成一些对微生物的生命活动无明确功能的物质的过程。这一过程的产物，即为次级代谢产物。次级代谢与初级代谢关系密切，初级代谢的关键性中间产物往往是次级代谢的前体，次级代谢一般在菌体对数生长后期或稳定期间进行，但会受到环境条件的影响；某些催化次级代谢的酶的专一性不高
22、；次级代谢产物的合成，因菌株不同而异，但与分类地位无关；质粒与次级代谢的关系密切，控制着多种抗生素的合成。包括两个方面，一是调节酶的合成量(反馈阻遏) ，二是调节现成酶分子的催化活力 (反馈抑制)。两者密切配合和协调，以达到最佳的调节效果。酶合成的调节是一种通过调节酶的合成量进而调节代谢速度的调节机制，这是一种在基因水平上(在原核生物中主要在转录水平上 )的代谢调节。凡能促进酶生物合成的调节，称为诱导。凡能阻碍酶生物合成的调节，则称为阻遏。根据酶的生成是否与环境中所存在的该酶底物或其有关物的关系，可把酶划分成组成酶和诱导酶两类。组成酶是细胞固有的酶类，其合成是在相应的基因控制下进行的。诱导酶则
23、是细胞为适应外来底物或其结构类似物而临时合成的一类酶。它是受到分解底物或其结构类似物诱导合成的。 酶的诱导合成又可分为两种:同时诱导:即当诱导物加入后，微生物能同时或几乎同时诱导几种酶的合成，它主要存在于短的代谢途径中。顺序诱导:即先合成能分解底物的酶，再依次合成分解各中间代谢物的酶，以达到对较复杂代谢途径的分段调节。阻遏作用有利于生物体节省有限的养料和能量，阻遏的类型主要有末端代谢产物阻遏和分解代谢产物阻遏两种。末端产物阻遏:由某代谢途径末端产物过量累积而引起的阻遏。对直线式反应途径来说，末端产物阻遏的情况较为简单，即产物作用于代谢途径中的各种酶，使之受阻遏。对分支代谢途径来说，情况就较复杂
24、。每种末端产物仅专一地阻遏合成它的那条分支途径的酶。代谢途径分支点以前的“公共酶”仅受所有分支途径末端产物的阻遏，此称多价阻遏作用。末端产物阻遏在代谢调节中有着重要的作用，保证细胞内各种物质维持适当的浓度。分解代谢物阻遏：指有两种碳源(或氮源)分解底物同时存在时，细胞利用快的那种分解底物会阻遏利用慢的底物的有关分解酶合成的现象。酶活性调节是以酶分子的结构为基础的，在酶分子水平上的一种代谢调节。它是通过改变现成的酶分子活性来调节新陈代谢的速率。酶活性的激活系指在分解代谢途径中，后面的反应可被较前面的中间产物所促进，称为前体激活。酶活性的抑制主要是反馈抑制反馈阻遏与反馈抑制的比较反馈抑制是通过调节
25、变构酶的活力得以实现，因为不涉及蛋白质的合成过程，调节的效果比较直接而快速。反馈阻遏是对酶合成的阻碍，是基因转录水平上的代谢调节，效果不如反馈抑制那样迅速，但可以节约原料和能量。次级代谢在调节过程中也有酶活性的激活和抑制及酶合成的诱导和阻遏。 由于次级代谢一般以初级代谢产物为前体，因此次级代谢必然会受到初级代谢的调节。磷酸盐不仅是菌体生长的主要限制性营养成分，还是调节抗生素生物合成的重要参数。磷酸盐浓度高低还能调节发酵合成期出现的早晚，磷酸盐接近耗尽后，才开始进入合成期。磷酸盐起始浓度高，耗尽时间长，合成期就向后拖延。磷酸盐调节抗生素的生物合成的机制：按效应来说，有直接作用(即磷酸盐自身影响抗
26、生素合成)和间接效应(即磷酸盐调节胞内其他效应剂，如 ATP、腺苷酸、能荷和 cAMP)，进而影响抗生素合成。细胞膜透性的调节 微生物的细胞膜对于细胞内外物质的运输具有高度选择性。如果细胞膜对某种物质不能运输或者运输功能发生了障碍，结果：一方面，细胞内合成代谢的产物不能分泌到胞外，必然会产生反馈调节作用，影响发酵产物的生产量，另一方面可能细胞外的营养物质不能进入细胞内，从而影响产物的合成，造成产量下降。组成型突变株的选育组成型突变株是指操纵基因或调节基因突变引起酶合成诱导机制失灵，菌株不经诱导也能合成酶、或不受终产物阻遏的调节突变型，称为组成型突变株。组成型突变株在没有诱导物存在的情况下就能正
27、常地合成诱导酶。1限量诱导物恒化培养：将野生型的菌种经诱变后移接到低浓度诱导物的恒化器中连续培养。2循环培养：要解除诱导的菌株，移接到含有诱导物和不含诱导物的培养基上交替连续循环培养。3鉴别性培养基的利用4筛选：经诱变剂处理后的菌体移接到含有诱导能力低，但能作为良好碳源的诱导物的培养基中培养，突变体能良好生长，野生型不能生长。抗分解调节突变株的选育抗分解调节突变就是指抗分解阻遏和抗分解抑制的突变。在实际生产中，最常见的是碳源分解调节、氮源分解调节和磷酸盐分解调节(尤其在次级代谢) 。(一)解除碳源调节突变株的选育由于葡萄糖分解产物的积累，阻遏了抗生素合成的关键酶，从而抑制了抗生素的合成。1循环
28、培养法：将诱变剂处理后的微生物移接到快速利用的碳源和慢速利用的碳源培养基上进行交替培养，然后筛选需要的突变株。2鉴别性培养基3特殊氮源：用葡萄糖为碳源，受阻遏酶的底物作为惟一氮源配制成培养基，连续移接诱变后的产气杆菌，可以选出不受葡萄糖阻遏的组氨酸酶突变株。4葡萄糖结构类似物：用于筛选抗分解阻遏突变体的葡萄糖结构类似物有 2-脱氧葡萄糖(以下称 2-dG)和 3-O-甲基葡萄糖( 以下称 3mG)2-dG 和 3-mG 具有以下特性：结构与葡萄糖类似，既不被微生物同化，也不能作为微生物生长的碳源；它们不被微生物代谢，也不阻抑微生物生长，在葡萄糖培养基中添加低浓度 2-dG 或 3-mG，微生物
29、可以正常地生长；由于它们的结构类似葡萄糖，和葡萄糖一样会阻遏诱导酶的合成，其阻遏作用甚至比葡萄糖还要强。(二) 解除氮源分解调节突变株的选育氮源分解调节主要指含氮底物的酶受快速利用的氮源阻遏。细菌、酵母、霉菌等微生物对初级代谢产物的氮降解物具有调节作用。次级代谢的氮降解物的阻遏主要指铵盐和其他快速利用的氮源对抗生素生物合成具有分解调节作用。(三) 解除磷酸盐调节突变株的选育：磷酸盐在许多抗生素、有机酸、核苷酸的发酵中，是初级代谢中菌体生长的主要制约因子又是不可缺少的营养成分，但磷酸盐过量存在对合成某些产物是不利的，特别是抗生素。1磷酸盐对次生产物的调节机制(1)通过初级代谢的变化影响次级代谢：
30、加强初级代谢，推迟抗生素合成的起始。磷酸盐是许多初级代谢反应酶的效应物。它控制初级代谢，对 DNA、RNA 和蛋白质的合成、对糖的代谢、细胞呼吸、ATP 浓度等均有影响，有利于菌体的生长，结果是 DNA 合成速度的增高及延续时间的推后，导致抗生素合成时间也相应推后；改变糖类分解代谢途径，磷酸盐有利于糖酵解，从而降低了戊糖途径的活力，导致某些以戊糖途径为先导的抗生素合成受抑制，限制抗生素合成的诱导物。(2)磷酸盐对 ATP 调节：磷酸盐可能通过调节细胞内的效应物 cAMP、ATP 等来控制抗生素的基因表达。营养缺陷型在代谢调节育种中的应用营养缺陷型是属代谢障碍突变株，常由结构基因突变引起合成代谢
31、中一个酶失活直接使某个生化反应发生遗传性障碍，使菌株丧失合成某种物质的能力，导致该菌株在培养基中不添加这种物质，就无法生长。在营养缺陷型菌株中，由于生物合成途径中某一步发生障碍，合成反应不能完成，从而解除了终产物反馈阻抑。外加限量需要的营养物质，克服生长的障碍，使终产物不致于积累到引起反馈调节的浓度，从而有利于中间产物或另一途径的某种终产物的积累。(一)在初级代谢调节育种中的应用氨基酸、核苷酸等是初级代谢中的主要产物、它们生物合成是由反馈抑制和反馈阻遏的调节机制所控制。1在直线式生物合成途径中 营养缺陷型突变株不能积累终产物，只能累积中间产物。2在分支式生物合成途径中营养缺陷型突变导致协同反馈
32、调节某一分支途径的代谢阻断，使这一分支途径的终产物不能合成。若控制供应适量的这一终产物，满足微生物生长，将使合成代谢流向另一分支途径，有利于另一终产物的大量积累。 (二)在次级代谢调节育种中的应用由于营养缺陷型导致初级或次级代谢途径阻断，所以抗生素产生菌的营养缺陷多数生产能力是下降的。然而在初级代谢产物和次级代谢产物的分支代谢途径中，营养缺陷型切断初级代谢支路有可能使抗生素增产。渗漏缺陷型在代谢调节育种中的应用渗漏缺陷型是一种特殊的营养缺陷型，是遗传性代谢障碍不完全的突变型。其特点是酶活力下降而不完全丧失，并能在基本培养基上少量生长。利用渗漏缺陷型既能少量地合成代谢终产物，又不造成反馈抑制的特
33、点，筛选抗反馈调节突变株，其原理类似于营养缺陷型，只是不必添加限量的缺陷营养物。抗反馈调节突变株的选育抗反馈调节突变株是一种解除合成代谢反馈调节机制的突变型菌株。特点是所需产物不断积累，不会因其浓度超量而终止生产。如果由于结构基因突变而使变构酶成为不能和代谢终产物相结合，失去了反馈抑制的突变，称为“抗反馈突变型”由于调节基因突变引起调节蛋白不能和代谢终产物相结合而失去阻遏作用的，称为“抗阻遏突变型”。（一）回复突变引起的抗反馈调节突变株的筛选1初级代谢途径障碍性回复突变型2次级代谢途径障碍性的回复突变“零变株”的回复突变株的筛选：将“零变株”进行诱变处理后的菌悬液和完全培养基混均，倒入平板底层
34、，上层覆盖含有敏感的检验菌。或者用琼脂块法，培养到适当时候将琼脂块移到含有敏感检验菌的琼脂板上，培养后，根据菌落周围形成的透明圈的情况，挑选菌落中恢复产抗的回复突变株，挑取的菌落进一步摇瓶筛选。共同趋向，即发生障碍性突变的营养缺陷型，抗生素产量大多数都比亲株低，而回复突变株往往比原养型亲株高。产生这种现象的原因：主要是以上缺陷型菌株中几种不能合成的氨基酸都是参与相应抗生素生物合成的。比如甲硫氨酸是金霉素合成的甲基供体，亮氨酸和缬氨酸是合成放线菌素的原料。基因突变结果，使菌体丧失参与合成这些氨基酸的某种酶的活力，导致有关抗生素合成过程因缺乏这些氨基酸而产量下降(二)耐自身产物突变株选育(三)抗终
35、产物结构类似物突变株的选育结构类似物(亦称代谢缬抗物 )是指那些在结构上和代谢终产物 (氨基酸、嘌呤、维生素等)相似的物质 较之营养缺陷型的方法，优点是：（1）抗结构类似物变株的代谢调节根本上被解除，（2）抗生突变株易于保存，而且不发生回复突变，只要在保存培养基中加适量结构类似物，就可防止回复突变。 (四)累积前体和耐前体突变株的选育1耐“毒性”前体突变株的选育2耐前体结构类似物突变株的选育3耐前体的有关代谢物突变株的筛选细胞膜透性突变株的选育1营养缺陷型突变株的选育可改变细胞膜透性生物素缺陷型的突变株：生物素作为催化脂肪酸生物合成最初反应的关键酶乙酰 CoA羧化酶的辅酶，参与脂肪酸的合成，进
36、而影响磷脂的合成，最终改变细胞膜的结构。油酸缺陷型的突变株：由于油酸缺陷型突变株切断了油酸的后期合成，丧失了自身合成油酸的能力，即丧失脂肪酸合成能力，必须由外界供给油酸才能生长，故油酸含量的多少，直接影响到磷脂合成量的多少和细胞膜的渗透性。甘油缺陷型的突变株：甘油缺陷型的遗传障碍是丧失 磷酸甘油脱氢酶，即丧失 L-甘油-3-磷酸 NADP 氧化还原酶。所以不能合成 磷酸甘油和磷脂，必须由外界供给甘油才能生长。通过选育以上营养缺陷剩的变株，而获得渗透性的细胞。这也是多年来谷氨酸生产常用的三种缺陷型菌株。2.温度敏感突变株的选育 3.溶菌酶敏感突变株的选育 基因重组育种工业微生物原核与真核的遗传系
37、统在无性细胞中所有的非减数分裂导致 DNA 重组的过程叫准性杂交，这在原核生物和真核生物中均有存在。原核系统：在细菌中准性杂交分为接合 (细胞融合之后重组) ，转导 (通过噬菌体载体 DNA从一个细胞转移到另一个细胞之后进行重组)和转化( 分离得到的 DNA 进入细菌细胞中以后的重组)三种类型。真核系统：在真菌中，菌丝融合或胞质融合形成一个双核体之后，单倍体的核进行核配。DNA 的重组一般发生在减数分裂期，在这之后形成单倍体。在高等植物或动物的细胞融合之后进行组织培养时也会发生这种重组。酵母菌分无性繁殖和有性繁殖两大类，主要是无性繁殖。 无性繁殖：包括芽殖 、裂殖 、芽裂繁殖和产生无性孢子 有
38、性繁殖：主要是产生子囊孢子。芽殖：酵母菌最常见的无性繁殖方式是芽殖。芽殖发生在细胞壁的预定点上，此点被称为芽痕，每个酵母细胞有一至多个芽痕。成熟的酵母细胞长出芽体，母细胞的细胞核分裂成两个子核，一个随母细胞的细胞质进入芽体内，当芽体接近母细胞大小时，自母细胞脱落成为新个体，如此继续出芽。如果酵母菌生长旺盛，在芽体尚未自母细胞脱落前，即可在芽体上又长出新的芽体，最后形成假菌丝状。 裂殖：是少数酵母菌进行的无性繁殖方式，类似于细菌的裂殖。其过程是细胞延长，核分裂为二，细胞中央出现隔膜，将细胞横分为两个具有单核的子细胞。 有性繁殖：酵母菌是以形成子囊和子囊孢子的方式进行有性繁殖的。两个临近的酵母细胞
39、各自伸出一根管状的原生质突起，随即相互接触、融合，并形成一个通道，两个细胞核在此通道内结合，形成双倍体细胞核，然后进行减数分裂，形成 4 个或 8 个细胞核。每一子核与其周围的原生质形成孢子，即为子囊孢子，形成子囊孢子的细胞称为子囊。酵母菌的生活史单倍体型：以八孢裂殖酵母为代表特点:营养细胞是单倍体；无性繁殖以裂殖方式进行；双倍体细胞不能独立生活，故双倍体阶段短，一经生成立即减数分裂。双倍体型：以路德类酵母为代表特点：营养体为双倍体，不断进行芽殖，双倍体营养阶段长，单倍体的子囊孢子在子囊内发生接合。单倍体阶段仅以子囊孢子形式存在，故不能独立生活。单双倍体型：以啤酒酵母为代表特点：单倍体营养细胞
40、和双倍体营养细胞均可进行芽殖。营养体既可以单倍体形式也可以双倍体形式存在；在特定条件下进行有性生殖。单倍体和双倍体世代交替霉菌霉菌的繁殖方式有营养繁殖、无性繁殖和有性繁殖三种。 营养繁殖：由菌丝中间个别细胞膨大形成的休眠孢子，其原生质浓缩，细胞壁加厚，可抵抗高温与干燥等不良环境条件。待环境条件适宜时，萌发成菌丝体，无性繁殖：主要产生节孢子、分生孢子和孢囊孢子。有性繁殖：主要产生卵孢子、接合孢子和子囊孢子。杂交育种的步骤和方法 杂交育种的步骤 细菌的杂交 酵母菌的杂交 霉菌的细胞杂交原生质体融合育种 原生质体融合育种的特点 原生质体融合育种步骤 原生质体转化 原生质体再生率和融合率的计算微生物发
41、酵工艺的特点： 应先因素众多 缺乏理论模型 试验误差较大 影响因素间存在相互作用因素：试验中考察的对试验指标可能有影响的因素简称因素。水平：每个因素在试验中要比较的具体条件称为水平。工艺优化研究的主要步骤：筛选：因素多，不精确的知识，找出重要的影响因素；优化：因素少，在较适范围内，建立预言性模型确证：使用预言的最优成套条件，验证结果常用的优化方法单因子法：实验室最常用的优化方法是单次单因子法，这种方法是在假设因素间不存在交互作用的前提下，通过一次改变一个因素的水平而其他因素保持恒定水平，然后逐个因素进行考察的优化方法。多因子试验：多因子试验需要解决的两个问题:(1)哪些因子对响应具有最大(或最
42、小) 的效应，哪些因子间具有交互作用。(2)感兴趣区域的因子组合情况，并对独立变量进行优化正交实验设计是安排多因子的一种常用方法，通过合理的实验设计，可用少量的具有代表性的试验来代替全面试验，较快地取得实验结果。正交实验的实质就是选择适当的正交表，合理安排实验的分析实验结果的一种实验方法。具体可以分为下面四步：（1）根据问题的要求和客观的条件确定因子和水平，列出因子水平表；（2）根据因子和水平数选用合适的正交表，设计正交表头，并安排实验；（3）根据正交表给出的实验方案，进行实验；（4）对实验结果进行分析，选出较优的“试验”条件以及对结果有显著影响的因子。如果仅考虑“均匀分散” ，而不考虑“ 整
43、齐可比”，完全从“均匀分散”的角度出发的实验设计，叫做均匀设计。Plackett-Bunnan 设计法是一种两水平的实验优化方法，它试图用最少的实验次数达到使因子的主效果得到尽可能精确的估计，适用于从众多的考察因子中快速有效地筛选出最为重要的几个因子，供进一步优化研究用。该法不能考察各因子的相互交互作用。部分因子设计法与 Plackett-Burman 设计法一样是一种两水平的实验优化方法，能够用比全因子实验次数少得多的实验，从大量影响因子中筛选出重要的因子。响应面分析：方法是数学与统计学相结合的产物，和其他统计方法一样，由于采用了合理的实验设计，能以最经济的方式，用很少的实验数量和时间对实验
44、进行全面研究，科学地提供局部与整体的关系，从而取得明确的、有目的的结论。发酵过程动力学的基本概念发酵过程反应的描述：XS（底物） X（菌体） P（产物）单位时间内单位菌体消耗基质或形成产物（菌体）的量称为比速，是生物反应中用于描述反应速度的常用概念。微生物生长动力学的基本概念微生物在一个密闭系统中的生长情况：微生物的生长动力学、Monod 方程产物形成动力学的基本概念初级代谢产物：微生物合成的主要供给细胞生长的一类物质。次级代谢产物：还有一类产物，对细胞的代谢功能没有明显的影响，一般是在稳定期形成，如抗生素等，这一类化合物称为次级代谢产物。反应动力学的应用连续培养的操作特性连续反应器：流入速度
45、=流出速度=F发酵过程的代谢控制 发酵过程控制是发酵的重要部分 控制难点：过程的不确定性和参数的非线性发酵过程工艺控制的目的、研究的方法和层次发酵过程的种类分批培养：简单的过程，培养基中接入菌种以后，没有物料的加入和取出，除了空气的通入和排气。整个过程中菌的浓度、营养成分的浓度和产物浓度等参数都随时间变化。优点：操作简单，周期短，染菌机会少，生产过程和产品质量容易掌握缺点：产率低，不适于测定动力学数据补料分批培养：在分批培养过程中补入新鲜的料液，以克服营养不足而导致的发酵过早结束的缺点。优点：在这样一种系统中可以维持低的基质浓度，避免快速利用碳源的阻遏效应；可以通过补料控制达到最佳的生长和产物
46、合成条件；还可以利用计算机控制合理的补料速率，稳定最佳生产工艺。缺点：由于没有物料取出，产物的积累最终导致比生产速率的下降。由于有物料的加入增加了染菌机会半连续培养：在补料分批培养的基础上间歇放掉部分发酵液（带放）称为半连续培养。优点：放掉部分发酵液，再补入部分料液，使代谢有害物得以稀释有利于产物合成，提高了总产量。缺点：代谢产生的前体物被稀释，提取的总体积增大连续培养：发酵过程中一边补入新鲜料液一边放出等量的发酵液，使发酵罐内的体积维持恒定。达到稳态后，整个过程中菌的浓度，产物浓度，限制性基质浓度都是恒定的。优点：控制稀释速率可以使发酵过程最优化。发酵周期长，得到高的产量。由于 D，通过改变
47、稀释速率可以比较容易的研究菌生长的动力学缺点：菌种不稳定的话，长期连续培养会引起菌种退化，降低产量。长时间补料染菌机会大大增加。发酵过程工艺控制的目的：有一个好的菌种以后要有一个配合菌种生长的最佳条件，使菌种的潜能发挥出来。目标是得到最大的比生产速率和最大的生产率发酵过程研究的方法和层次1、研究方法单因子实验：对实验中要考察的因子逐个进行试验，寻找每个因子的最佳条件。一般用摇瓶做实验优点：一次可以进行多种条件的实验，可以在较快时间内得到的结果。缺点：如果考察的条件多，实验时间会比较长。各因子之间可能会产生交互作用，影响的结果准确性数理统计学方法：运用统计学方法设计实验和分析实验结果，得到最佳的
48、实验条件。如正交设计、均匀设计、响应面设计。优点：同时进行多因子试验。用少量的实验，经过数理分析得到单因子实验同样的结果，甚至更准确，大大提高了实验效率。但对于生物学实验要求准确性高，因为实验的最佳条件是经过统计学方法算出来的，如果实验中存在较大的误差就会得出错误的结果。2、研究的层次初级层次的研究：一般在摇瓶规模进行试验。主要考察目的菌株生长和代谢的一般条件。代谢及工程参数层次研究：一般在小型反应器规模进行试验。生产规模放大：在大型发酵罐规模进行试验。发酵过程的中间分析：是生产控制的眼睛，它显示了发酵过程中微生物的主要代谢变化。因为微生物个体极微小，肉眼无法看见，要了解它的代谢状况，只能从分
49、析一些参数来判断，所以说中间分析是生产控制的眼睛。这些代谢参数又称为状态参数，因为它们反映发酵过程中菌的生理代谢状况。代谢参数按性质分可分三类：物理参数：温度、搅拌转速、空气压力、空气流量、溶解氧、表观粘度、排气氧（二氧化碳）浓度等化学参数：基质浓度（包括糖、氮、磷） 、pH 、产物浓度、 、核酸量等生物参数：菌丝形态、菌浓度、菌体比生长速率、呼吸强度、基质消耗速率、关键酶活力等从检测手段分可分为：直接参数、间接参数直接参数：通过仪器或其它分析手段可以测得的参数，如温度、pH、残糖等间接参数：将直接参数经过计算得到的参数，如摄氧率、KLa 等直接参数又可分为: 在线检测参数和离线检测参数发酵过程主要分析的项目1、pH：pH 与微生物的生命活动密切相关 酶催化活性2、排气氧、排气 CO2 和呼吸熵3、糖含量：糖的消耗 反映产生菌的生长繁殖情况反映产物合成的活力。总糖指发酵液中残留的各种糖的总量。还原
