1、B 43ICS 65. 020. 30备案号 ： 21073-2007 DB32江 苏 省 地 方 标 准DB32/T 351-2007代 替 DB32月 351 1999羊冷冻精液Fr ozen semen of sam2007一 07-10 发布 2007-09- 10 实施江 苏 省质量 技 术 监 督局 发 布DB32 月 351-2007目 IJ I本标准 代 替 DB32月 351-19990本标准与 DB32/T351-1999 相比主要变化如 F:一 一 解冻后精子活力由 “大于或等于 0.35 改为 “不小于 30% （ 即 0. 3） ”一 一 将 冷码 i精液分为细管幸
2、u颗粒两种 “型式” 改为两种 “剂型” ： 将原标准中的 “大于或等于” 改为 “不小于” ， 将 “小 于或等于 ， 改为 “不大于”一 一 曾力 日了精子活力 、 精子顶体完格率等术语和定义 。本标准按 GB/Tl. 1- 2000 标准化工作导则 第 l 部 分 ：标准的结构和编写规则 和 GB/Tl. 2- 2000标准化工作导则 第 2 部分 标准中规范性技术要素内容的确定方法 进行编写 。 本标准的附录 A 、 附录 B 为规范性附录 ， 附录 C 为资料性附录 。 本标准的修订由 江苏省畜 牧兽医总站提出 。本标准修订单位 ：江苏 省 畜 牧兽医总站 、 江苏省农林厅 畜 牧兽
3、医局 、 江苏省农业科学院 、 徐州市 家畜 良种 站 、 深水县种羊场 、 江苏省肉羊 繁 育 中 心 。本标准主要修订者 戚胜 兵 、 姜加华 、 钱 勇 、 高洪 宝 、 减正柏 、 王 彬 、 方 肤 、 宗俊 贤 、 周国安 、 朱慈根 、 张 磊 、 陈玉 芳 。本标准于 1999 年 12 月首次发布 。DB32/T 351-2007羊冷冻精液1 范围本标准规定了羊冷冻精液的术语 、 剂型 、 要求 、 试验方法 、 检验规则及标志 、 包装 、 运输 、 贮存 。 本标准适用于山 羊 、 绵羊的冷冻精液产品 （以 下简称 “ 冻精勺 。2 规范性引用文件下 列文件中的条款通过本
4、标准的引 用而成为本标准的条款 。凡是注 明 日 期的 引 用文件 ， 其 随 后所 有的修改单 （不包括勘 误 的内容） 或修订版均不适用于本标准 ， 然 而 ，鼓励根据本标准达 成 协议的各 方研究 是 否可使用这 些 文件的最新版本 。凡是不注 日 期的 引 用文件 ，其最新版本适用于本标 准 。GB厅 5458一 1997 液氮生物容器3 术语和定义F列 术 语 和 定 义 适 用 本 标 准 。3. 1 .精子活力 sperm mot i I i ty37 环境下直线前进运动精子占总精子数的百分率 。3. 23. 33. 43. 5精子顶体完整率 i ntact r ate sper
5、m of acr osome顶体完整精子占总精子数的百分率 。精 子 畸 形 率 abnorma l sperm r ate 畸形精子占总精子数的百分率 。精子存活率 sperm su r v i va I r ate在 37“C 环境下保存 4h 时直线前进运动椅子数占总精子数的百分率 。细菌数 bacter i a count一剂 量 索精经培养后出现的细茵茵落数 。4 lflJ 型 根据制作方法的不同分为细管和颗粒两种 。5 要求5. 1 外观5. 1. 1 细管 ： 无裂痕 两端封口严密 ，印制的标志应消 晰 。5. 1. 2 颗 粒 大小均 匀 ， 表面光滑 。5. 2 剂量5. 2
6、. 1 细管 ： 0.2 mL 土 O.OJ mL:5. 2. 1 颗粒 ： O. l mL 土 0.0l mL 。5. 3 剂量冻精解冻后精液质量5. 3. 1 精 子 活 力不小于 30% （即 0.30 ） 。5. 3. 2 呈直线前迸运动的精子数绵 羊 不小于 510 个 ： 山 羊 不小子 3 X 107 个 。5. 3. 3 精子顶体完整率 不小于 35%。5. 3. 4 精 子 畸 形 率 不大于 20% 。5. 3. 5 精子存活率 不小于 1%。5. 3. 6 细茵茵落数小于或等于 800 个 。6 试验方法0632/T 351 20076. 1 外观 目 测 法 。6. 2
7、 解 东后精液剂量 、 精子活力 、 呈直线前进运动精子数 、 精子顶体完整率 、 精子畸形率 、 精子存活率 、 细 菌 i 菌落数按照附录 A（ 标 准 的 附 录 ） 进 行 。7 检验规则7. 1 产 品 须 经 站 质 检 人 员 检 验 合 格 并 签 发 合 格 证 后 方 可 出 站 。7. 2 出站检验为外 观 、 剂量 、 精子活力 、 里直线前进运动的精子数 。7. 3 型式检验为标准要求中全部项目 ， 正常生产时 ，每三个月检验一 次 。7. 4 以每 头 羊一周制作的冻精产品为一批 ：每批 随 机抽取 3 份用于检验 。7. 5 结果以抽检三份样品 的 平 均 值 为
8、 准 。7. 6 经型式检验 ， 若有一项不符合本标准要求 ， 则判该批产品为不合格 。8 标 志 、 包装 、 贮 存 、 运输8. 1 标志8. 1. 1 细管冻精应征管壁 （ 成包装袋 上印制生产站名 、 公羊品种 、 公羊号 、 生产日期或批号 。8. 1 . 2 颗粒冻精应在标签 （ 或包装袋 上印制生产站名 、 公 羊品种 、 公羊号 、 生产日 期或批号 、 数 量 、 精子活力 。8. 2 包装8. 2. 1 细管冻精用专用的塑料管和灭菌纱布袋 。8. 2. 2 颗粒冻精用灭菌布袋 。8. 2. 3 每一批号一个包装 。8. 3 贮存8. 3. 1 贮存冻糊的低温容器应符合 G
9、B/T5458 标准规定 。8. 3. 2 专人负责及时补充液氮 ， 保证冻精浸在液氮中 。8. 3. 3 每头公羊的冻精单独贮存 。8. 3. 4 贮存冻精的容器每年至少 消 洗一次并更换新鲜液氮 。28. 3. 5 取放冻精时 ，冻精离开液氮的时间不得超 过 ！ Os.8. 4 运输8. 4. 1 冻精运输过程中要有专人负责 ，贮存容器不得横倒及碰撞和强烈振动 。8. 4. 2 保证冻精始终浸在液氮中 。DB32/T 351-20073饵DB32月 351-2007附录 A（规范性附录） 羊冷冻精液质量检验方法A. 1 剂量A. 1. 1 器材试管 C S.OmL) 、 吸管 （ 0.2m
10、L, l.OmL ） 。A. 1. 2 试验步骤A. 1. 2. 1 细 管 ：将细管投 入 37“C 水浴中解冻 ， 然后剪去两端 ，将精液倒 入 5.0mL 试管内 ， 用 l mL 吸 管吸取并检查其精液量 。A. 1 . 2. 2 颗粒 将颗粒放入试管内 ， 自然解冻后用 0.20mL 吸管吸取并检查其精液量 。A. 2 精子活力A. 2. 1 器材与溶液显微镜或显微电视装置 、 恒温水浴箱 、 5.0mL 试 管 、 载玻片或精液性状板 、 盖玻片 （ !8 X 18） 、 显 微镜保温或恒温装置 、 滴管 、 2.9%拧棱酸纳溶液 。A. 2. 2 试验步骤A. 2. 2. 1 解
11、冻细管 直接置于 37“C水 浴中解冻 ： 颗粒 置预先预热至 38 的内有 1. OmL 拧橡酸饷解冻液的试管 中 ， 水浴解冻 ， 适当搞动 ， 使冻精溶化 。 ”A. 2. 2. 2 检查 取解冻后精液 50ul 置于载玻片上加盖玻片即在 200 400 倍显微镜下观察活力 ， 环境混度或载物 台 温度保持 38C ： 也可通过电视显微装置在荧光屏上观察活力 。 每样品观察 3 个视野 ， 注意不同液层 内 的精子运动状 态 ，进行全面评 定 。A. 3 呈 直 线 前 进 运 动 的 精 子 数A. 3. 1 器材与溶液血球计数板 、 血色索 管 、 2mL 吸 管 、 小试 管 、
12、计数 器 、 显微镜或电视显微装置 、 滴 管 、 3. 0%氯化 纳溶液 。A. 3. 2 试验步骤A. 3. 2. 1 细 管 ：用血色素管准确吸 取 10 微升干解冻精液 ，注入盛 有 0. 99m L 的 3. 0%氯化纳溶液的试 管 内 ， 混 匀 ，使之成 为 100 倍稀释的稀释精液 。将备好的血球计数板用血盖片将计数室盖 好 ， 用小吸 管吸取一滴稀释精液 于血盖片边缘 ， 使精液自行流入计数室 ， 均匀充满不能有气泡或厚度过大 ，然后 在显微镜下或 电 视 荧 光 上 观 察 计 数 ：A. 3. 2. 2 颗 粒 ：用血色素管准确吸 取 10 微升干解冻的精液 ， 注入盛有
13、 1. 99mL 的 3. 0%氯化纳溶液的 试管内 ， 混匀 ， 使之成为 200 倍稀释的释精液 。A. 3. 3 计算公式A. 3. 3. 1 每剂量中精子数 5 个中方格中的精子数 （即计数室 5 个中方格的总精子数 10 (1 立方毫米内 的精子数 1000 （ 每毫升精液的精子数） 200 （ 颗粒稀释倍数 或 100 （ 细乐稀释倍数） x剂 量 值 。上式可简化为 ：每剂量中精子数 5 个中方格精子数 1000 万 颗粒 或 500 万 细管 剂量 值 。A. 3. 3. 2 每样品观察上下两个计数室 ， 取平均值 ， 如二个计数室计数结果误差超过 5%， 贝 lj应重检 。A
14、. 3. 3. 3 剂量中呈直线前进运动精子数 每剂量中精子数 活力 （ %）4DB32/T 351-2007A. 4 箱子存活率A. 4. 1 器材显微镜 、 恒温箱 、 吸 管 、 载玻片 、 盖玻 片 A. 4. 2 解冻按照 A2.1 。A. 4. 3 精子活力按照 A2.2.A. 4. 4 存活率的评定东精 解 lff,后置 31c 恒温箱中保存 4h 检查活力 。A. 5 精子顶体完整率A. 5. 1 器材与试剂显微 镜 、 载玻片 、 血球分类计数器 、 小吸 管 、 蒸 f田 水 、 姬姆萨染料 、 磷酸二氢纳 、 磷酸氢二纳 、 甲 醇 、 甲 醇 、 甘 油 、 所用试剂为
15、 AR.A. 5. 2 试剂配制A. 5. 2. 1 磷酸盐缓冲液磷酸二氢纳 （ NaH2P012H20 ) 0. 55g 磷酸氢二纳 C Na2HP0,! 2H,Q ) 2. 25g 双蒸馆水定 溶 至 lOOmLA. 5. 2. 2 中性福尔马林固定液40% 甲酸 HCHO（使用前每 I OOmL 甲 醒用 10 克碳酸续饱和后过 滤 ） 8.0mL磷 酸 二 氢 纳 C NaH2P0,2H20l 0. 55g磷酸氢二例 C Na2HPQ, !2H,Q ) 2. 25g用 0. 89%氯化纳约 50. 0mL 溶解后加入 8. 0mL 中和后的 甲 酶 ， 再加 0. 89%氯化纳溶液定
16、容 至 100. 0mL 。A. 5. 2. 3 姬姆萨原液她姆萨染料 1. Og甘泊 （ B,Hs （ 口 的 ， ） 66. 0 mL甲 醇 （ BH30H ) 66. 0 mL姬姆萨染料放入研钵中加少量甘泊充分研磨至无颗粒为止 ， 然后将甘泊全部倒入并放入恒温箱中 保温继续溶解 4h ， 再加 甲 醇充分溶解混匀 ， 过 滤 后贮于棕色瓶中待用 ， 贮存时 间 越久染色效果越好 。 A. 5. 2. 4 姬姆萨染液姬姆萨原液 2.0mL 磷酸盐缓冲液 3.0mL 蒸饱水 5.0mL 现配现朋A. 5. 3 靠 I 片染色A. 5. 3. 1 抹片 ： 驭解冻后精液一滴于载玻片一 端 ，
17、用另一边缘光滑的载玻片与有样品 的载玻片里 350 夹角 ， 将样品均匀地抱布于载玻片上 ， 自然风干 （约 5m i n ） 。A. 5. 3. 2 固 定 ： 在己风干的抹片上滴上 1-2mL 中性福尔马林 ， 固定 15min 后用清水缓缓冲去固定液 ， 吹干或自然风干，A. 5. 3. 3 染色 ： 将固定好后的抹片反扣在带有平槽的有机玻璃面上 ， 把姬姆萨染液滴于槽和抹片之 间 ， 让其充满平槽并使抹片接触染液 ， 染色 I.Sh 后用消 水缓缓冲去染液 ， 凉干待检 。A. 5. 3. 4 镜 检 ： 将 制 备 好 的 抹 片 在 显 微 镜 （ 1000 f音 泊 镜 ） 下
18、观 察 。A. 5. 3. 5 每样品制作二个抹片 ， 每个抹片观察 200 个以上的精子 （分左 、 右二个区） ， 取二片的平均5值 ， 二片的变异系数不得大于 20% ， 若超过应重新制片 。A. 5. 4 精子顶体完整率计算 精子顶体完整率的计算见公式 （ l） 。顶体完整精子数0832/T 351-2007顶体完整率 （ %） 100% (l )精子总数A. 6 精子畸形率的检查A. 6. 1 制片染色按照 AS.3A. 6. 2 畸形精子率的计算 畸形精子率的计算见公式 （ 2 ):畸形精子数畸形精子率 （ %） 100% . （ 2 )精子总数A. 7 冻精中细菌数的检查A. 7
19、. 1 器材与溶液培养 箱 、 超净化工作台 、 三角烧瓶 、 烧杯 、 量 筒 、 玻 棒 、 夭 平 、 羊角 匙 、 高压蒸汽灭菌锅 （或微 波护 ） 、 培养皿 、 水浴箱 、 pH 试纸 （ pHS.5 9.0 ） 、 棉 花 、 羊皮 纸 、 记 号 笔 、 麻 绳 、 纱 布 、 放大镜 、 羊 肉浸 膏 、 蛋 白 陈 、 磷酸氢二仰 、 氯化锅 、 琼脂粉 、 l mol/LnaOH 、 l mol/L HCI 、 蒸馆 水 。A. 7. 2 培养基的配制普通琼脂的制作 牛肉浸营 蛋臼胀Sg!Og 叹 ，磷酸氢二何 （ K2HP04 3H,O ) lg氯化铀 （ NaCll
20、5g用蒸馆水 lOOOmL 溶解后加琼脂粉 20g 加温融解 。矫正 pH 至 7. 6 并用脱脂棉过滤 ， 分装于三角烧瓶中经高压灭菌 (15 磅 20 分钟）囚A. 7. 3 检查方法A. 7. 3. 1 细 管 解冻后用酒精棉球消毒后以无菌操作直注于灭菌平皿 内 ；A. 7. 3. 1 颗 粒 ： 以 无菌操作直接放入平皿内 。把己凉 至 50 左右的普通琼脂 以 无 菌 操作倾倒入平皿 内 ， 每皿约 15mL ， 并转动平皿使混合均匀 ， 同时作空 白 对照平皿 。待琼脂凝固后翻转平 皿 ， 置 37 恒 温箱 内 培养 24 小时取 出 ， 计数平皿内菌落数 。每个样品作两个平 皿
21、 ，取平均 值 ， 该值就是所检样品的 细茵茵落数。6DB32/T 351-2007附录 B（规范性附录） 种公羊及新鲜精液质量B. 1 种公苹质量B. 1 . 1 使用公草应符合本品种的 特征 ， 具有种用价值 ， 其评价为特级 、 一级标准 。B. 1 . 2 种公羊体 质 健壮 ，无传染 病 。凡 引 进的 公 羊要先隔离检疫 ， 经正式兽医检疫机构证明无下列传 染病才能使用 ：口 蹄 疫 、 绵羊 和 l山羊症 病 、 兰舌病 、 裂谷热 、 布氏杆菌病 、 羊结 核 病 、 羊副结核病 、 放线菌病 、 龟头包皮炎 、 钩端旋 体 、 弓型 体 、 沙 门氏的 病 、 衣原体病等 。
22、检疫方法应按照中华人民共和国农业部颁布的有关规定执行 。B. 1. 3 公羊无遗传病 。B. 2 公草鲜精质量色泽里乳 白 色或淡黄色 ，精子活力不小 于 0.75 (75% ） ； 精子密度不小于 15108/mL： 精子畸 形率不大于 15%。圭7 飞 ，DB32/T 351-2007附 录 C（资料性附录 羊冷冻精液制作程序和使用c. 1 采精C. 2 稀释液配制C. 2. 1 所 有 器 具 应 洁 净 并 消 毒 灭 菌 。C. 2. 2 器材与试剂C. 2. 2. 1 所用化学试剂 ： 竹橡酸三纳 、 果 糖 、 M糖 、 乳 糖 、 甘泊均为分析 纯 。C. 2. 2. 2 鸡蛋
23、用健康鸡场的新鲜鸡蛋 。c. 2. 2. 3 双蒸水 。c. 2. 3 稀释液c. 2. 3. 1 绵羊用稀释液细管 一 液 拧橡酸销 3g 、 葡萄糖 3g 加蒸馆水至 IOOmL ， 卵黄 25mL 。 二 液 取一液 88mL， 甘汹 12.mL。颗粒 11%乳糖液 75mL ， 卵黄 20.0mL ， 甘油 5.0mL ，c. 2. 3. 2 山 羊用稀释液基础 液 ：拧棱酸 纳 l 挝 、 葡萄糖 3g、 乳糖 Sg 加蒸馆水至 I OOmL ，消毒待 用 。 取消毒后的基础液 75mL ，卵 黄 20.0mL ， 甘油 5.0mL 。所有稀释液每 100.0mL 中添加 青 、 链
24、霉毒各 10 万单位 ， 现配现用 。c. 3 精液稀释与分装c. 3. 1 一次稀释法 将需加的稀释液一次加完 。c. 3. 2 二次稀释法 将所加稀释液分为二次添加 ，首先加入不含甘泊的一 液 ， 加至稀释总量一半 ，降 温 、 平衡后再加足含有甘泊的 二 液 。c. 3. 3 添加与精液等温的稀释液时 应缓缓加入 。c. 3. 4 细管精液的分装 。a）细管为无毒 、 耐低温的专用塑料管 。b）平衡前在室温下成平衡后在 3 sc环境 F均可分装 ， 管内需留一定的空隙 。C. ） 分装后两端封口应严密 。d） 分装的精液最应符合本标准中 4. 2. 1 规 定 。c. 4 降 温 、 平
25、衡C. 4. 1 精液稀释后经 lh 左 右 逐 步 降 温 至 3 5 。C. 4. 2 降 泊 、 平衡时间为 2h 3h。 C. 5 精液冷冻c. 5. 1 冷 吕 京用具需洁净后消毒 。c. 5. 2 细管冻精用铜网或细管架熏燕 。C. 5. 3 颗粒冻将用铜网或氟板滴冻 。C. 5. 4 液氮为冷源 ， 热平衡温度为 80 110 ， 细管熏蒸 Sm in 、 颗粒黑蒸 2m i n 后浸入液氮 C. 6 精液解冻解冻液及解冻方法按本标准附录 A2 规定进行 。c. 7 输精c. 7. 1 用开膛器输精法 ， 要求慢插 、 适深 、 轻注 、 缓出 。C. 7. 2 注意输精过程中的卫生要求 8
