1、1实验神经学实习资料、常用试剂的配制和常用动物简介：一、常用缓冲液1. 0.1M 磷酸缓冲液0.1M Na2HPO412H2O 17.9g/500ml0.1M NaH2PO42H2O 7.8g/500mlPH 0.1M Na2HPO4 0.1M NaH2PO47.02 34ml 16ml7.14 37ml 13ml7.3 40ml 10ml7.4 47.5ml 2.5ml2. 0.2M 醋酸缓冲液0.2M 无水醋酸钠 8.2g/500ml0.2M 醋酸 6ml/500mlpH 0.2M HAC 0.2M NaAC3.3 48.0 2.05.0 14.8 35.23. 10%缓冲中性 forma
2、lin 固定液PH7.3 0.1M 磷酸缓冲液 900ml3740% 甲醛 100ml4. 4%多聚甲醛固定液0.1M Na2HPO4 800ml多聚甲醛(PFA) 40g 0.1M NaH2PO4 200ml5. 铬明胶粘片液明胶 5g (1g) 60水浴加热溶解加入硫酸铬钾 0.5g (0.1g) 硫酸铬钾过滤DW 1000ml (200ml) 60水浴粘片60烤干6. 玻璃器皿清洗液稀（一般实验用） 中（分子生物学实验用） 浓（细胞培养用）重铬酸钾 300g 100g 40g硫酸 300ml 250ml 200ml蒸馏水 300ml 750ml 200ml二、常用实验动物简介：1. 大鼠
3、：纯种 体长：尾长 头 耳间距SD 系(Sprague-Daurley) 3:2 短宽 大Wistar 系 1:1 细长 小大白鼠共 57-61 椎骨 脊 N34 对 C8 T13 L6 S4 Cy3椎式 C7 T13 L6 S4 Cy27-31剥离鼠脑时注意应从颈部椎骨开始，咬骨钳尖向上慢慢剥离椎骨、颅骨；大、小脑间的骨膜要剥离；小脑绒球、嗅球易损伤；硬脑膜不要碰破；取脑时先剪开硬脑膜，再剪断颅底三叉 N，视 N，嗅丝，慢慢取出鼠脑。应小心剥离。2. 家兔(Rabbit)(1) 中国本兔：嘴较尖，耳短厚，白色，红眼，抗病力较弱加热至 60完全溶解2(2) 青紫兰兔( 金基拉兔) ：毛色灰，抗
4、病力较强，毛从根到尖部分五种颜色为：石盘兰、乳白色、珠灰色、雪白色、黑色(3) 大耳白兔（日本大白兔）：毛色纯白、耳大、红眼兔脊神经 37 对，C8、T12(13)、L7(8)、S4、Cy6椎式：C7 T12 L7 S4 Cy11-153. 恒河猴(Rhesus Monkey)又称孟加拉国猴，广西猴 脊神经 31 对 C8、T12、L5、S5 、Cy1椎式：C7 T12 L5 S4 Cy5体重：1415kg 体长：5562cm 尾长：2224cm体重：910kg 体长：4045cm 尾长：1824cm、神经组织的一般制片技术一、石蜡切片的制片程序（分步程序）1. 组织处理(1) 组织取材；(2
5、) 组织修整；(3) 组织固定；(4) 组织冲洗2. 组织包埋(1) 组织脱水；(2) 组织透明；(3) 组织浸蜡；(4) 组织包埋3. 组织切片(1) 蜡块修整；(2) 蜡块固贴；(3) 蜡块切片；(4) 切片附贴；(5) 切片烤干；4. 组织染色(1)切片脱蜡到水；(2) 切片染色；(3) 切片脱水上行；(4)切片透明；(5)切片封固二、组织处理：1. 组织取材：(1) 动物处理： 药品物麻醉：小白鼠：乙醚大白鼠 、猫、兔、狗：1%戊巴比妥钠 6%水合氯醛 5ml/kg 体重20%乌拉坦大、小白鼠、猴等腹腔注射 兔：耳 空气栓塞法：(2) 材料的选择：神经系统取材，一般用猫：大脑：锥体细胞
6、小脑：梨形细胞壁虎肌肉：运动终板(3)取材：要求：组织越新鲜越好；注意取材的部位和方向；梨形细胞取猫小脑蚓体正中矢状切面；脊髓切片，应取其典型的代表部位，猫脊髓：颈、胸、腰、骶取材器械锋利、专用；取材动作轻柔，避免组织损伤，清除不必要及机械损伤的组织。2. 组织修整：3(1) 核对组织块，登记，编号，以免发生差错；(2) 组织切块不要太大，一般：110.5cm 最大：111cm(3) 置入适当的容器进行固定容器不要过大、过小，宜采用棕色广口瓶组织：固定液，一般为 1:20 (昂贵固定液亦需 1:4)瓶底放一些沙布或棉花，不让组织直接接触瓶底，使每个面都能充分固定。3. 组织固定(1) 固定：将
7、各种组织材料浸入防腐液（固定液） ，使细胞内的物质成为不溶性，即称为固定。(2) 固定目的： 防止组织细胞自溶及腐败等死后变化； 保持细胞原有结构与生活时的形态相似； 固定液不仅能够沉淀、凝固细胞内的蛋白质、脂肪、醣、酶等物质，而且还能使组织硬化，利于切片，还利于组织产生不同的拆光率而便于观察； 某些固定剂具有媒染作用，利于切片染色。(3) 固定方法：浸润固定法：将新鲜组织直接投入固定液中，使固定液渗入组织中（但较大组织不适用，神经组织不用） 灌注固定法：神经组织常用a. 动物麻醉：腹腔注射 6%水合氯醛 5ml/kg；b. 动物仰卧位固定于蜡盘上；c. 灌注装置管道洗净，充液（生理盐水）排气
8、；d. 暴露胸腹腔，沿胸骨剑突水平向两侧剪至腋中线，然后向上剪至腋下，剪断膈肌，掀起整个胸廓，打开心包，暴露心脏， 。沿腹中线向下暴露整腹腔；e. 插管：在心尖（左心室）部位剪口，将灌注插管插入左心室升主动脉，固定插管，剪开右心耳；f. 灌注生理盐水，打开灌注泵，将电压开至 10V，用温生理盐水(35 -37)，将血管内血液全部冲净， （当肝及虹膜颜色全部变白时，终止灌注） ，时间约为 5-10分钟，灌注量为 200-300ml；g. 灌注 4冷固定液，当颜色变白时，即可开始灌注固定液，速度宜先快后慢，开始电压调为 10V，当四肢、尾部出现抽动时即可将电压调为 5V，慢速注入固定液，时间约为
9、30分钟，灌注量约为 200-300ml；h. 灌注完毕后，立即取材，然后将取出的脑、脊髓等神经组织放入固定液内进行后固定（4保存） 。i. 注意事项：管道系统在灌注前必须用水冲洗干净后再充满生理盐水，并排气，保证管道内绝对没有气泡；在开胸时，必须是沿胸管剑突水平向两侧剪至腋中线后再向上剪至腋下，剪断膈肌肋骨，掀起整个胸廓，绝对不能沿胸骨中线剪开胸部，暴露心脏，以防胸廓内动脉剪断，出血而影响手术视野；插管时一定要插入左心室（心尖部们）灌入生理盐水，当发现肝脏、眼睛虹膜变成白色时，即可灌注固定液，若发现双侧肺膨大，并鼻腔出水时，则说明是由于插管插入右心室所致，应从新插管至左心室的原则影响灌注效果
10、；出现四肢、尾部全身抽动则为灌注良好，若不出现，则为灌注不良。灌注固定液约 30 分钟至 1 小时，就及时调整、改进。(4) 固定注意事项：4a. 组织切块后，投入固定液前，一般不经水洗，取材后，立即放入固定液中。b. 固定时间：根据组织块的大小，固定液的性质，温度来决定。一般来说：数小时24 小时48 小时，大的神经组织需 37 天。c. 易变形的组织，如脊髓，应用绳扎住（如颈 I）悬挂于固定液中，神经，如生骨神经，两端都系上，悬挂于固定液中。d. 保持组织的完整性，等固定完全硬化后，再修整。e. 根据所固定组织的要求，选择不同的固定液。神经组织易选用 10%中性缓冲formalin.f.
11、固定的第二天更换一次固定液，对神经组织尤其重要。长期固定保存 36 月更换一次，因为固定液会氧化使液体呈酸性，对组织不利g. 固定液的量要充分 1:20h. 容器：棕色广口瓶，瓶底垫纱布，棉花(5) 常用的固定液： 甲醛(Formal dehyde)是一种蒸气，呈酸性，溶于水后，其饱和溶液浓度 3740%，俗称为福尔马林(formalin)，易挥发，强烈刺激性气味。易氧化成甲酸，酸性甲醛对一般组织固定无妨，但神经组织最好使用缓冲中性甲醛固定。温度低时，易产生白色沉淀，低于 10时，成三聚甲醛，所以置于阴暗处，室温下保存。甲醛是一种还原剂，不宜与氧化剂，如重铬酸钾等配合使用，如需要混合使用，如H
12、elly 氏液必须在临用前混合，24 小时后即失效，若配制应于 24h 内使用。优点：固定组织彻底，组织弹性好，是固定脂肪，类脂质等神经组织的最佳固定液。(2) 戊二醛(Glutaraldehyde)(3) 乙醇(Ethyl alcohol)(4) 升汞(Mercuric chloride)(5) 重铬酸钾(potassium bichromate)(6) 苦味酸(picric acid)(7) 锇酸(Osmic acid)常用固定液(1) 4%多聚甲醛固定液(2) 10%缓冲中性 formalin(3) AAF 液：常用的病理组织快速固定液酒精 85ml冰醋酸 5ml甲醛 10ml(4) Z
13、enker 开液（ ZA）重铬酸钾 2.5g 防止组织过度硬化升汞 5g硫酸钠（可略） 1g蒸馏水 100g冰醋酸（用前加入） 5ml 防止组织过度收缩，且保持 PH4.5 左右固定 1224h，然后水冲洗 1224h，放入 70%酒精保存5(5) Helly 开液（ZF 液）：酸钾 2.5g升泵 5g硫酸钠（可略） 1g蒸馏水 100ml甲醛（用前加入） 5ml甲醛代替冰醋酸，防止了其对组织的膨胀作用，更适应于细胞脂肪等，是神经组织的优良固定液，24 小时之内使用。固定时间：1224h，流水冲洗 1224h，然后入 70%酒精中保存(6) Bouin 氏液：组织学常用的固定液苦味酸饱和液 7
14、5ml甲醛 25ml冰醋酸 5ml(7) Susa 氏液：组织学常用的固定液升汞 4.5g氯化钠 0.5g三氯醋酸 2ml蒸馏水 80ml冰醋酸 4ml (用前加入 )甲醛 20ml (用前加入)其中，固定神经组织最常用：（1） 、 （2） 、 （5）组织冲洗1. 组织洗涤：目的：将组织内部的固定液全部冲洗出去，终止固定，以免组织过度固定而过硬，而影响切片。洗涤剂的选择：(1) 流水：最常用。用酸或重铬酸钾的固定液固定的组织应充分水洗，冲洗时间应与固定时间相同；(2) 用含苦味酸或酒精固定的，组织不能用水，只能用 70%酒精洗涤(3) 用甲醛固定短时间，可不用冲洗，但长期用甲醛保存的，亦需用流
15、水冲洗。冲洗方法：(1) 流水冲洗 1224h蒸馏水（DW ）浸泡 6-12h，(2) 对神经镀银染色的组织，不能用流水冲洗，只能用 DW 多次更换，清洗组织；(3) 70%酒精洗，多次更换，初始时，相隔时间短些，以后可以相隔时间长些再更换；(4)通常冲洗时间与固定时间为 1:1，一般为 1224h，可根据需要缩短或延长。保存：水洗后一般放放 70-80%酒精保存长期保存，最好放入甘油酒精中甘油 15mlDW 15ml95%AlC 70ml用甲醛固定的组织，也可用甲醛长期保存，但 3-6 月须更换一次。三、组织脱水与包埋：6(一)组织脱水(dehydration)1. 指用脱水剂把组织内部的水
16、份彻底置换出来以利于透明，脱水使用的药品称税水剂，其过程称为脱水。2. 常用的脱水剂脱水剂，必须能在任何比例下，都能与水相混合，同时又能与透明剂相混合，并且对组织结构无损害或破坏作用。(1) 酒精：常用于石蜡包埋和火棉胶包埋时的组织脱水不产生，由于酒精穿透力强，所以用高浓度酒精急剧脱水可引起组织强烈收缩及过度硬化，故组织脱水，酒精浓度应从低至高逐级进行，一般为 70%-80%-95%-100%AlcI-100%Alc对于 110.3-0.5cm的组织块：70%-80%-95%-100%AlcI-100%Alc2-4h2-4h过夜1.5-2h1.5-2h(2) 丙酮：常用于制作电镜超薄切片，树脂
17、包埋时的组织脱水。(二)组织透明(Clearing)1. 指组织经脱水后，再用能与脱水剂及石蜡混合的试剂，将不能与石蜡混合的脱水剂置换出来，而使组织成透明状态，其过程称为透明。2. 目的：使石蜡均匀地渗入到组织内部，使组织硬度一致，起到包埋支持的作用。3. 常用的透明剂：(1) 二甲苯(Xylol)：为广泛应用的优良透明剂，即能溶于酒精又能溶解石蜡。组织脱水及直接投入二甲苯中，可使组织透明，但也能引到组织收缩硬化， ，故透明时间不宜过长，一般以透明为度。(2) 其它的透明剂还有：苯、甲苯、氯仿、石碳、香柏油等4. 透明方法：脱水后XylolIXylol1 1.5h 1 1.5h5. 注意：脱水
18、透明过程中，尽量少将上级溶液带入下一级中，一般从-时应将组织用滤纸吸干酒精、二甲苯必须是新的，不能重复使用。(三)组织浸蜡(Infiltrating)1. 材料：医用切片石蜡(paraftin)，熔点：4262，熔点越高石蜡越硬。一般4852 软蜡 冬天 疏松组织（脊髓等）5662 硬蜡 夏天 致密组织(骨、肌腱等)冬天，宜用软蜡，夏天，用硬蜡，制作 5微米以下切片应用硬蜡最后一次浸蜡和包埋用蜡应用同熔新购的石蜡中含有气体，不能直接使用应加热至 70使石蜡熔化然后再冷却，反复进点的石蜡。行三次以上，以去掉石蜡内的气体，增加密度，提高韧性，经过滤，去掉其中杂质，然后放容器保存（标明熔点）备用。2
19、. 浸蜡：浸蜡温度：一般高于熔点 2-5，使之呈完全溶解的状态过程：透明后组织软蜡软蜡硬蜡硬蜡 ?301h 301h 301h 301h(四)组织包埋(Embedeling)指将已浸蜡的组织块置于包埋剂中，使组织具有一定的硬度和韧性，以利于切出优良，菲薄的切片，此过程即称为组织包埋。7四、组织切片(Section)(一)石蜡切片(parattin secrion)1. 优点：切片薄、质量好，适合连续切片，便于长期保存2. 缺点：由于经过脱水、透明、浸蜡过程，使组织中的脂肪、类脂质、酶、抗原、抗体等受到破坏，另外，较大的，比较坚硬的组织也不宜。所以，一般免疫组化、神经组织等不宜用。3. 修块：梯
20、形上小下大，组织周围留有蜡边 0.3-0.5cm4. 厚度：石蜡 5-10um5. 裱片水温：55左右6. 烤片：60 4h(二)冰冻切片(frozen section)1. 优点：简单、迅速、省时，脂肪组织、类脂质、酶、抗原、抗体都很少损害。所以是显示酶、脂肪和神经组织时最常用的切片方法。2. 厚度 40-60u，血管可达 80-100u3. 冰冻切片：室温下干燥(三)神经组织裱片一定要注意：(1) 方向：神经组织有背侧、腹侧之分，因为,镜下是倒像，所以裱时应背下、腹上(2) 注意顺序：连续切片：一般 1张/每 5-10张，关键部位：片片要留五、组织染色(Staining)1. 定义：指使不
21、同的组织和细胞成分着不同的颜色或颜色深浅不一，以利于观察和鉴别其形态结构和组织成份。2. 方法：(1) 普通染色法：HE法(苏目精伊红染色法，称常规染色法，用于显示一般组织或病理组织的形态结构，又称常规染色法。(2) 特殊染色法：用于显示组织特种结构或物质成分的染色法，N 组织染色法属于特殊染色法范畴。3. 染料(Dye)(一)常用染料表用 途 来 源 化 学 性 质胞核 胞浆 脂肪 天然 合成 碱性 酸性苏木精 胭脂红 焦油紫 甲苯胺兰 硫堇 中性红 (弱硷)伊红 藻红 桔黄 G 苏丹黑 苏丹 苏丹 (二)染色原理：81. 化学反应：从组织和染料都具有酸、硷化学性质来说，组织中的酸性物质与硷
22、性染料中的阳离子相结合，硷性物质与酸性染料中的阴离子相结合而发生染色作用。如 HE法中苏木精染胞核，伊红染胞浆。2. 物理反应：(1) 吸附作用：某些金属盐类的染料，如：硝酸银、氯化金等，渗入组织内部，由于还原剂的作用银离子可与蛋白质结合或吸附和沉淀在组织表面。(2) 溶解：吸收作用。即组织吸收染料而着色，这种染色是很牢固的。如脂肪的苏丹染色。(三)媒染剂，促染剂和分化剂1. 媒染剂：(Mordant)凡是具有有促进染色能力，可以和染料或组织发生结合，或者是对染料与组织都有亲和力，能将染料和组织结合在一起的试剂，称为媒染剂。在天然染料中表现得很明显，如：苏木精，只有在明矾的媒染作用下，才成为一
23、种广泛应用的细胞核染料。常用：钾明矾、铵明矾、铁明矾、三氯化铁2. 促染剂(Accentuator)促染剂不同于媒染剂，它能促进加强染料和组织细胞结合能力，但并不参与染色反应的试剂，如：染胞浆时在伊红液中滴加的冰醋酸，神经组织镀银时加入水合氯醛：可增强组织的嗜银性。3. 分化剂(differentiation)在退行性染色中，能够有选择性地除掉组织切片上的多余染色剂的过程称为分化，即使用的溶液称为分化剂，分化剂具有脱色作用，因此也就是脱色剂，所以在常规染色中，分化时间必须严格掌握，必须在镜下控制分色效果。常用分化剂：(1) 酸性分化剂：分化硷性染液染色的切片，盐酸酒精(2) 氧化分化剂：实际上
24、是简单的漂白作用，如草酸、高锰酸钾等氧化剂可使染色剂氧化而呈无色，首先脱支的染色较浅者，染色较深的组织细胞还可保留部分染色，从而达到了分化效果。如：Weigert 法或 Nauta 法染色时使用草酸或高锰酸钾进行漂白处理。(3) 媒染分化剂：媒染剂即能促使组织细胞和染色剂结合，又能使已经和组织相结合的染色剂脱去，所以又称媒染分化剂。如髓鞘染色 well法中：应用铁明矾媒染，又应用铁明矾分色。(四)染色常用术语：1. 脱蜡下行水洗：（下行）指石蜡切片在染色前，必须经二甲苯溶解切片上的石蜡，再由高至低各级浓度酒精置换二甲苯并逐渐加水，最后再用蒸馏水冲洗切片的常规全过程，简称下行。2. 脱水透明封固
25、：是指切片在染色后，由低至高各级浓度酒精脱掉切片上的水份，再用二甲苯置换酒精，使切片成透明状态后，用中性封胶将组织切片封固于载片与盖片之间的过程，简称上行。3. 退性性染色：是指用染液把切片过染，再用分化剂选择性地去掉不该盖色的部分，使该着色的部分更加清晰透度。HE 法中苏木精染核就是退行性染色，大多数染色法均属于退行性染色。4. 进行性染色：是指染料对某种组织结构或物质具有亲和力，具有选择性着色的特点，9即染色时，当染液将所染的组织成分染成适当的颜色后就终止染色，而不须分化剂进行分色的染色方法。如：染神经胶质和纤维 PATH法神经细胞全貌 高尔基(Golgi)镀银法尼氏小体 核酸菁兰法5.
26、分化：是指切片经染色后，再用分化剂有选择地将不该着色部分的颜色脱掉，使该着色的部分颜色深浅适度。大多数染色法都需经分化处理才能制出优良的切片。6. 对比染色：利用染色方法将组织的不同结构成分，用二种或二种以上的颜色分别显示出来，称为对比染色，如：HE 染色就是胞核与胞浆的对比染色，对比染色要求不同色调应对比适度。深则都深，浅则都浅，不能深浅不一。7. 复染：通常是应用特殊染色法将组织的某一特殊结构用相应的染色方法染色后，再用另一种染色方法进行染色，以显示其它组织结构，此后一种染色称为复染。复染色调宜浅不宜深，以免妨碍主要染色调。故又称陪衬染色，复染通常应用于特殊染色。如：Luxolfast b
27、lue染髓鞘，再用焦油紫复染尼氏体等。如 HRP法，用兰色标记细胞后再用中性红复染其它组织结构。六、苏木精伊红染色(HE) Hemotoxylin-Eosin Stain MethodHE法染色程序：石蜡切片裱片烤干二甲苯2-5(脱蜡) 二甲苯2-5 (脱蜡) 100%Alc1-2(下行加水) 100%Alc1-2 (下行加水) 95%Alc1-2 (下行加水) 80%Alc1-2 (下行加水) 70%Alc1-2 (下行加水) DW1-2 (下行加水) Ehrilich苏木精 15-20(切片染色 ) 自来水洗 2-5 (切片染色) 1%盐酸 Alc分化 30” (切片染色) 自来水洗 30
28、 (切片染色) DW1-2 (切片染色) 0.5%伊红 5-10 (切片染色) DW速洗70%Alc 1-2(上行脱水) 80%Alc 1-2 (上行脱水) 95%Alc 1-2 (上行脱水) 100%Alc1-2 (上行脱水) 100%Alc1-2 (上行脱水) 二甲苯2-5(透明) 二甲苯2-5 (透明) 中性树胶封固(封固) 10染色结果：胞核 兰色胞浆 粉红色其它组织成分 粉红色附：Ehrlich 酸性苏木精配制法：（太阳光下自然氧化 6-8周成熟后方能使用，成熟时间越长，效果越好）苏木精 2g无水酒精 100ml甘油 100ml冰醋酸 10ml钾明矾 3gDW 100ml0.5%伊红
29、水溶液伊红水 0.5gDW 100ml冰醋酸 1滴、神经组织特殊染色法：一、神经组织的一般认识：1. 神经元(Neurones)胞体：胞核 胞浆：尼氏小体、N 原 f等突起：树突轴突：有髓无髓：脑干含少量无髓纤维神经末梢：运动终板、肌梭、肌腱、触觉小体、环层小体等2. 神经胶质(Neuroglia)神经组织特有的成分起对神经元支持、营养的作用（神经元包埋其中）(1) 星状细胞(Astrocytes)：原浆性：胞浆中有短而粗的突起，且分支呈辐射状分布，主要见于脑灰质部分。纤维性：长而细的突起分支少呈不均匀地辐射状分布，主要见于脑脊髓的白质，极少量见于灰质部分(2) 少突胶质细胞(Oligoden
30、droglia)：较少见突起很少，主要壳外周神经轴突的髓鞘的产生与维持，即是外周神经纤维的髓鞘细胞。(3) 小胶质细胞(Miorglia)是网状内皮细胞系统的特有成份，并非真正的神经胶质细胞，乃是在脑内定居的巨噬细胞。3. 固有结构组织：硬脑膜、蛛网膜、软脑膜、室管膜，都有丰富的血液供应。二、神经组织制片染色的注意事项：(一)固定时的注意事项：1. 取材要迅速，材料越新鲜越好。2. 固定一般宜选用灌注固定法。3. 固定液应选用 10%缓冲中性 formalin液114. 固定液要充足，固定时间要充足，一般 1周以上，长时间固定时，固定液最好 3-6月更换一份。(二)切片时的注意事项：1. 切片
31、通常宜选用冰冻切片或火棉胶切片；2. 切片厚度常规为 30-40um；3. 神经切片常须连续切片，一般每隔 5-10片留一片，但关键部位要每片都留；4. 神经切片必须按顺序裱片，且不可将顺序颠倒，在裱片时，要注意将切片方向摆正确，一般均是背侧在下，腹侧在上；(三)染色时的注意事项：1. 染色前，操作者应熟悉整个染色步骤，找出主次，做到心中有数，初学者优为重要；2. 神经组织染色多采用镀银染色，要求配液器材绝对干净，染色试剂，药品均选用“优级纯”(一级)。3. 神经染色所需要的化学试剂和染料均选用“分析纯” （二级）或“优级纯” （一级） ；4. 配制的试剂和药液一定要准确、仔细，不可马虎，如发
32、现药液异常应查出原因，重新配制，除少量试剂，染液需提前配制外，一般均需新鲜少量配制，配好的染液，试剂，用棕色磨口瓶盛装。试剂要用蒸馏水配制，镀银试剂需用双蒸馏水配制；5. 在染色中，最好于常温下(18-22)进行，当室温高/低时，可适当缩短/延长染色时间，进行大批染色前，可先少染以摸索适宜条件。6. 在染色中常需进行避光进行，尤其是镀银染色应在暗箱中进行。7. 神经组织切片在染色后，多有感光性，易褪色，必须避光保存，切不可置于阳光下，有特殊要求的，还需在 4冰箱内保存或其它条件下保存；8. 神经组织染色有其严格性和特殊性，又有很大的灵活性故染色中应随时记录，如染色时间、温度、试剂浓度、PH 值
33、及水洗次数，一般不要随意改变染色步骤。三、中枢 NS标准染色法染 色 方 法 显 子 结 构 切 片 类 型Niss法 尼氏颗粒 任何一种：石蜡、冰冻、火棉胶Golgi法、Cox 法 神经细胞全貌、胞体、树突、轴突 任何一种：石蜡、冰冻、火棉胶Weigert Pal法、Yveil法、Mahon 法 正常髓鞘 任何一种：石蜡、冰冻、火棉胶March法、Nauta 法Fink-heimer法 变性髓鞘 冰冻Bielschowsky法 N末梢 石蜡、冰冻PATH法 N胶质细胞和纤维 石蜡Cajal法 显状细胞和小胶质细胞 冰冻Glees法、Holmes 法Bodian法 N原纤维、神经纤维 石蜡、冰
34、冻Kluer-Barrern法 正常髓鞘，尼氏颗粒 任何一种Mulligan厚片法 灰白质 须手切片四、脑厚片染色法：(一)Malligan（马利根氏）脑厚片染色法：肉眼观察不同切面脑内核团的分布情况12主要区分灰、白质：灰质染成翠兰色，白质白色1.固定：10%缓冲中性 fomalin液，灌注固定脑组织，材料越新鲜越好。2.剥去脑膜和血管3.将脑切片：人脑 1-2cm、动物脑 0.5-1cm，可切成不同的切面脑刀必须用开水清洗干净，每次切完均须清洗脑片用滤纸将水吸干，照后用中国墨汁标号4.流水冲洗脑厚片（根据固定时间的长短决定冲洗时间）5.DW中浸泡如：新鲜固定的 4、5 二步合计半小时即可而
35、长期固定的陈旧人脑组织经流水冲 24-48h，DW 泡 12以上。6.将脑厚片浸入 Malligan氏液(65-70)3-5，随时翻动，当脑片至青白色时，即可取出。石炭酸 40g硫酸铜 5g浓盐酸 2mlDW 1000ml7.立即将脑片投入大量冰水中 1-28.移脑片入 1%二氯化铁溶液中 1-2三氯化铁 1gDW 100ml冰醋酸 0.5ml9.流水冲洗脑厚片 110. 移脑厚片入 1%亚铁氧化钾溶液中显色 15”-1，灰质呈浅兰色，白质无色11. 流水冲洗 5-1012. 脑厚片入含 2%盐酸的 10%fommalin中保存结果：灰质：鲜艳的深翠兰色白质：洁白无色无髓鞘区或变性区域，颅内肿
36、瘤均染成兰色注：三种液体须用不同的持夹工具，不能混淆，持夹应用竹筷或玻璃棒等，不能用铁制工具。(二)简易脑厚片染色法：1. 脑厚片入 10%三氯化铁溶液（滴盐酸至浅黄色） 1-22. 流水洗 1-23. 脑厚片入 1%亚铁氧化钾溶液 15”-14. 流水冲洗 5-105. 脑厚片入含 2%盐酸的 10%fommalin中保存结果：灰质：鲜艳的深翠兰色白质：洁白无色无髓鞘区或变性区域，颅内肿瘤均染成兰色五、尼氏小体染色法(Nissl body Stain Methed)1892年，Nissl 首次用美兰(Methylene blue)显示可以他自己名字命名的尼体小体。随后又不断出现许多应用碱性染
37、料，如：甲苯胺兰(Toluidine blue)、焦油紫(Cyesyl 13violet)、硫堇(Thionin)、酸菁兰 (Galloeyanin)、焦油固紫(Cressyl fast violet)目前最常用等来显示尼氏小体，统称尼氏染色法。尼氏体形态：光镜下分布于神经细胞胞浆内，易被硷性染料所着色，不规则的粗细大小不等的颗粒、斑块。近来，由组化方法证明其中含有大量的核糖核酸，尼氏小体的分布和形态随神经细胞的不同而不同。如脊髓前角神经细胞中的尼氏小体称“虎斑” 。而皮层，脊神经节中神经细胞中的尼氏小体呈小颗粒状。电镜下：尼氏小体是由 NC胞体特殊形式的糙面内质网和游离的核蛋白体构成的，广泛
38、分布于较大的运动神经元中。而在感觉神经元里则比较少，树突中有糙面内质网，在轴突中则不存在。形态：成堆的或分散的大小不同的扁平的短池状，管状及小泡状,膜外表面附着许多核蛋白体。糙面内质网是神经细胞内合成蛋白质的主要细胞器。尼氏体在正常生理状态下，大而多，故应新鲜取材。病变或受损时，尼氏体减少甚至消失，死后取材，尼氏体分散，不易着色。固定液：10%缓冲中性 formalin固定切片：石蜡、冰冻、火棉胶均可，但不宜太薄染色：不同的染色液须不同的 PH值（一般 3.5-4.5）(一) 焦油固紫染色法：1. 溶液配制：(1)溶液 A：焦油固紫 0.2g DW 150ml(2)溶液 B：0.1M 冰醋酸
39、冰醋酸 3ml DW 500ml(3)溶液 C：0.1M 无水醋酸钠 无水醋酸钠 4.1g DW 500ml(4)溶液 D：PH3.5-4.5 醋酸缓冲液 B 液 94ml+C液 6ml(5)工作液：A 液 10ml+D液 90ml 过滤的使用2. 染色程序：(1) 切片脱蜡下行水；(2) 切片入焦油固紫工作液 15-30(3) 切片入 DW洗去浮色(4) 切片入 70-80-95%Alc分色，各级 1-2至镜下观察尼氏颗粒清晰；(5) 切片入特殊分色液退背地100%Alc 100ml 乙醚 100ml 氯仿 100ml(6) 切片入 100%Alc，二甲苯脱水透明封固(7) 尼氏小体深兰紫色
40、，核、核仁，浅紫色 背地：洁白无色(二)尼氏法的用途：1. 尼氏体是中枢 NS显示一般神经元结构的常规染色法，尼氏小体是 N元胞浆内一种特有的正常成份，含有大量核糖核酸，可被硷性染料着色，染成兰紫色的颗粒或斑块。2. 用尼氏法可研究 N元在生理、病理状态下的形态及其变化3. 用尼氏法可观察，研究中枢 NS内神经元的分布情况，确定神经元的类型4. 尼氏小体是观察研究神经元受到损害时的一种很灵敏的指标，当神经元在病变或损伤时，尼氏体常发生移位、变性、崩解、散开、数量减少或消失。(三)尼氏染色法注意事项：1. 取材必须新鲜，死后过久尼氏小体崩解、散开，不易着色。2. 组织宜选用 10%中性缓冲 fo
41、rmalin液固定。3. 尼氏体的着色与 PH值有关，应选用适宜的 PH值，一般以 3.5-4.5为佳。144. 染色关键是掌握分色时间，应在镜下控制，不宜过浅或过深。5. 应在特殊分色液中退背地。6. 染色液使用前必须过滤。7. 染色后切片必须避光保存，因为染料有感光性。六、正常髓鞘染色法(Myelin Sheath Stain Method)主要用于显示中枢 NS中髓鞘的配布，特别是纤维束的位置和进程，Weigert 氏在 1884年，首先应用苏木精，染出正常髓鞘。随后出现许多改良方法。(一)搔洛铬花青髓鞘染色法(Solochrome Cyamine)1. 固定：10%缓冲中性 forma
42、lin或钙一甲醛液2. 切片：冰冻：30-40u 石蜡：5-10u 3. 染液配剂：搔洛铬花青 0.2g DW 96ml10%铁明矾 4ml 硫酸 0.5ml先将染色剂于 DW彻底溶解再加入铁明矾摇匀，最后加入硫酸，摇匀，切不可先加硫酸。4. 切片脱蜡到水5. 切片入染液 10-20室温6. 流水洗切片呈兰色7. 切片用 10%铁明矾分色，镜下控制到 C核及其它组织几乎无色8. 流水洗 109. 根据需要可用 1%中性红复染10.脱水透明封固结果：正常髓鞘，兰色病变脱髓区：髓鞘不着色背地：洁白无色复染：C 核、红色(二)Weil 髓鞘染色法1. 切片脱蜡到水；2. 切片入下液 30分钟，室温1
43、0%纯酒苏木精 5mlDW 45ml4%铁明矾 50ml3. 自来水洗切片 5分钟；4. 用 4%铁明矾分化，镜下控制，区分正常髓鞘与灰质或变性区域；5. 自来水洗，然后 DW浸洗；6. 可入稀氨水(氢氧化胺 6滴加 DW100ml)返兰 5分钟；7. 充分水洗；8. 上行脱水、透明、封固；9. 结果：髓鞘：呈兰黑色背底：洁白无色10. 注意事项：(1) 此法简便，快速，对冰冻切片最适宜，但分化要适度；(2) 苏木精液一定要经 6个月成熟期，未成熟不易着色，此染液只用一次，应考虑用量；15(3) 此法亦可用盐酸酒精分化切片。(三)关于髓鞘染色机理的探讨：髓鞘化学组成成分：主要是脂蛋白：30%蛋
44、白质、70%类脂质机理：髓鞘的脂质+媒染剂：2.5%重铬酸铜 4%铁明矾 10%三氯化铁结合物+氧化苏木精(10%纯酒精苏木精)“色淀” （兰黑色）沉淀于髓鞘上属退行性染色，再用媒染分化剂分色七、镀银染色技术(一)高尔基技术简介Camillo Golgi(1843-1926)在 1873年创立高尔基法，即用硝酸银镀染整个神经元的方法，当时称为“黑的染色”(Yeazione Nera)发现了高尔基器，高尔基小体，高尔基型、型 CM均是其发现并命名的。特点：只有 1-3%的神经元能被镀染1970年，Romon-moliner 指出 Golgi法是高尔基在对软脑膜内层做镀银染色时偶然发现的，且当时用
45、重铬酸盐作固定剂必然会导致这种染色方法被发现。1901年，Cox，用升汞镀染，即 Golgi-Cox法1903年，Cajal 设计出了快速 Golgi法1906年，Golgi 和 Cajal共同获得第六届诺贝尔医学奖20世纪 50年代，神经解剖学家 Scheibel夫妇，研究网状结构神经元。主要是用 Golgi法完成的，故 50年代又称“Golgi 法复活期” 。唯一缺点：极不稳定，不易掌握，且机理不清。(二)高尔基技术操作注意事项：1. 神经组织要绝对新鲜2. 玻璃器皿要绝对洁净3. 重铬酸钾，硝酸银等试剂要绝对纯（一级试剂）4. 溶液要充足，一般 5-10倍于组织块5. 配制溶液最好使用双
46、蒸水6. 溶剂要选用棕色瓶7. 整个镀染过程要去室温，暗处，避光进行8. 宜采用冰冻切片。因为用蜡切片等给经酒精脱水，加热等程序，会影响镀染9. 宜采用厚片，50-80u 甚至 100u(三)Golgi 法镀染程序：1. 固定：灌注固定，10%缓冲中性 formalin 1日至数年2. 媒染：一般将组织切成 3-5mm厚的小块，投入染液中 16-30h，室温避光37%甲醛 10ml25%戊二醛 6ml冰醋酸 5ml2%重铬酸钾 80ml16取材应取大小脑的纵切面（即矢状切面）瓶底放纱布，勿使组织块直接触瓶底，否则组织与瓶底接触面媒染不良3. 镀银：将组织块移入 1.5%的 AgNO3中，24-
47、48h，室温避光，棕色瓶，瓶底放纱布，使银溶液能够各方面渗入。组织块从媒染液中拿出，至 AgNO3中，老方法绝对其间不能用水冲洗，但媒染液一与 AgNO3接触，会产生红色沉淀。改良方法，可用双蒸水冲洗后，再放入 AgNO3或用少量 AgNO3洗三次，再放入大量 AgNO3溶液中镀染时间不能少于媒染时间。4. 组织块入 DW洗 2-55. 冰冻切片 50-80-100um6. 切片，裱片，自然干燥7. 透明封固：结果：1. NC 全貌及突起，棕黑色2. 其它胶质细胞，棕黑色3. 背地：洁白，浅棕黄色C. 有关 Golgi法镀染机理的探讨：1. Roman-Moliner认为 Golgi法主要是重
48、铬酸钾对脂蛋白膜系统发挥了稳定的媒介作用，无论是 AgNO3还是氯化金都是在脂蛋白膜系统间隙内形成微小结晶，电镜下观察到镀染呈点状，位置不定，大多发生胞体，树突，轴突的胞质膜内，他们认为镀染物质属于脂蛋白铬银复合物，连接比较分散，其中金属盐(AgC 2O4)中的金属离子(Ag +, Hg+)是黑色的主要成份。2. 关于媒染分化时间神经元胞体，神经胶质细胞 3-5 天轴突 7 天或稍长Seheibel 用 6 天4 个月Hardesty:建议各种神经组织分化时间无髓鞘的 Nf： 7 天小脑梨形细胞、大脑锥体细胞、脊髓、周围神经节细胞：5 天神经胶质细胞：3 天3. 关于镀染时间：一般为 24-4
49、8 小时出现被镀染细胞的时间：4-8h固定铬化的时间越长，镀染开始时间就越晚从开始镀染剂完全镀染，30min-1h，若延续镀染 24h，则可能过染超过 48h，不但不会有助于镀染，改善图象，还会造成银盐散，从而损害图像，影响镀染效果。6. 关于切片的问题一般采用冰冻切片 50-100um，较薄切片，不利于显示 N 元的全貌。7. 关于镀染处理过程：(1) 室温，避光进行镀染适合，即应迅速全部切完(2) 封固：建议用合成树脂封固，最好用 Dpx及时拍照，保存，放入切片盒内避光保存切片上若有好多血管或银颗粒很多，可能由于媒染/镀染时间过长，可适当缩短。建议春末夏初时做1718脑立体定向技术一、 简史：1. 1870 年，
