1、5058现代生物医学进展wwwshengwuyixueeom Progress in Modem Biomedicine VoL14 NO26 SEP2014 doi：1013241jcnkipmb201426015 甲氨蝶呤对早期神经胚基因表达的影响术 季成 王秀伟 王建华 官臻 朱智强 谢秋 张霆 牛 勃1,2A (1山西医科大学基础医学院山西太原030001；2首都儿科研究所儿童发育营养组学北京市重点实验室北京北京100020) 摘要目的：利用甲氨蝶呤(methotrexate，MTX)干预孕鼠，探讨MTX对早期神经胚基因表达的影响。方法：用MTX(45mgkg体 重)干预孕鼠，通过Ni
2、mbleGene表达谱芯片、RealtimePCR及免疫组化等方法进行差异表达基因的筛选和验证。结果：MTX处理 后神经管畸形(NTDs)发生率为321。表达谱芯片筛选出166个差异表达基因，其中4个凋亡相关基因(Endog，Trp53，Casp3， Bax)均表现为上调(fold change15，P15)were upregulated but Ptchl，Pla2g4a，Foxgl(fold change067)were downregulated (P005)Expression of caspase一3 was significantly enhanced(P005)while ph
3、ospho-histone H3 expression was markedly decreased (P005)in neuroepithelium from NTD embryosConclusion：MTX altered the gene expression at early neumlation，especially the differential expression ofapoptosisand proliferation-related genes，which may be a critical mechanism in the occurrence ofNTDs caus
4、ed by folate deficiency Key words：Neural tube defects；Methotrexate；Apoptosis；Proliferation ChineseLibraryClassification：Q953，R722 Documentcode：A Article ID：16736273(2014)26505805 刖青 神经管畸形(neural tube defects，NTDs)是一类最常见的、 严重的中枢神经系统出生缺陷性疾病。在世界各地均有发生， 其发生率为O5o2dl， 。近20多年来，国内外学者对NTDs 的病因和预防措施进行了大量研究，均证
5、明孕妇体内的叶酸缺 乏是造成NTDs的重要危险因素，围孕期补充足够的叶酸能显 著的预防NTDs的发生，使其发生率降低70t3，41。但叶酸与 NTDs的直接关系及其机制尚未阐明【5】。 甲氨蝶呤(Methotrexate，MTX)的化学结构与叶酸形似，是 临床上常用的抗肿瘤、抗炎及免疫抑制及抗早孕药物之一网。其 主要的作用机制是抑制二氢叶酸还原酶(Dihydrofolate reduc tase，DHFR)，使二氢叶酸不能被还原成有活性的四氢叶酸，从 而阻断了叶酸代谢通路，进而影响体内的叶酸代谢7-9。本研究 利用MTX诱导引起小鼠叶酸代谢异常，从而观察其对小鼠早 期神经胚发育及其基因表达的影
6、响，为叶酸缺乏与NTDs关系 的进一步阐明提供理论依据。 1材料与方法 11实验动物样本 SPF级饲养C57BL6J小鼠(北京维通利华实验动物技术 有限公司，中国)，7-8周，18时1：1合笼过夜。第二天检测到阴 +基金项目：国家自然科学基金项目(81070491) 作者简介：季成(1987一)，男，硕士研究生，主要研究方向：分子生物学，Email：jinxjc163tom 通讯作者：牛勃，电话：01055695545，Email：niub2004126com (收稿日期：20131118接受日期：20131216) W。 。 。W。一W ProgressinModernBiomecine V
7、o!14 NO26 SEP2014 5059- 栓者，为孕05天。孕75天，实验组腹腔注射45 mgkg体重 MTX(Merck，USA)，对照组腹腔注射生理盐水O孕115天脱颈 处死，取胚胎，观察胚胎畸形情况。部分标本利用10的中性福 尔马林固定做脑部连续切片，HE染色。分别选取3窝对照组胎 鼠和3窝MTX(45 mgkg体重)组NTDs胎鼠的神经管组织用 于芯片实验。 12胚胎组织总RNA的提取 利用Trizol reagent(Invitrogen，USA)提取胚胎组织中的总 RNA， 并用NucleoSpin RNA clean-up试剂盒 (MACHEREY-NAGEL，German
8、y)对总RNA进行过柱纯化，最 后用分光光度计定量，甲醛变性凝胶电泳质检。 13芯片准备与杂交 本实验使用NibleGen 12135K小鼠表达谱芯片，按照 NimbleGen表达谱芯片使用说明(http：wwwnimblegen cornproductslitexpressionindexhtr)进行实验操作。 14表达谱数据分析 用RMA对信号值进行归一化等数据校正后，用SAM软件 进行分析，FDR控制在5以内。再以15倍标准筛选差异表达 基因。将筛选出的差异表达基因利用MAS30进行GO分析。 15定量RTPCR 为了进一步验证表达谱结果，利用RTPCR对部分基因进 行验证，用Prime
9、r 30(http：frodowimiteduprimer3)计引物。 表1 RT-PCR上下游引物 Table 1 Primer pairs used for RTPCR 应用嵌入荧光染料SYBRGreen I进行荧光实时定量PCR 扩增，反应在25 L体系中进行。反应条件为：95预变性1O 秒，95变性5秒，60退火、延伸4O秒，循环40次。反应结 束后，溶解曲线分析和琼脂糖电泳证实产物的特异性。每对引 物的反应均包括一个无模板对照，并且每份模板的每个基因都 设置3个重复孔。反应完成后，系统软件将自动计算出每个样 本扩增的Threshold cycle(Ct值)，再根据目的基因和管家基因
10、的ct平均值，计算出目的基因的相对表达量，以2一 Q表示。 在计算各样本目的基因的差异表达时，以N1的表达量设定为 1，则其它样本表达量以相对倍数表示。 16免疫组化染色 切片常规脱蜡人水；001 M枸橼酸盐缓冲液(pH60)微波 抗原修复；冷却后用PBS冲洗3次；3H：O 孵育室温10 min； 滴加正常山羊血清，37孵育30 min；滴加兔抗phosphohis tone H3(PH3)(1：400)，Caspase3(1：250)(阴性对照滴加等体 积PBS)，4冰箱过夜；滴加PV9001试剂1(Polymer Heer) 室温孵育10 min；PBS漂洗3次；滴加试剂2(poly-HR
11、P an tiRabbit IgG)室温孵育30 min；PBS漂洗3次；DAB显色(显微 镜下观察，显色即可)；自来水充分冲洗；苏木素复染；封片；光 学显微镜下观察。 17统计学分析 采用SPSS160统计软件对对照组与NTDs组数据进行双 侧t检验分析，数据以均数-I-标准差 s)表示，P005为差异 具有统计学意义。 2结果 21 MTX诱导胚胎发育异常 对照组小鼠胚胎未见NTDs，偶见吸收胎及发育迟缓(表 2)；对照组胎鼠外观较为饱满圆滑，头部前、中、后脑泡均已形 成且完好(图1)；HE染色显示神经管发育良好且均闭合，管腔 规则，神经上皮的内、外界膜平整，细胞排列整齐密集(图2)。 45 mgkg体重MTX实验组，吸收胎的比例明显增高，其NTDs 的发生率为321，主要表现为露脑畸形(308)，少数颅脊柱 裂，此外，可见发育迟缓、颅面部畸形，畸形胚胎身长及体重均 明显低于对照组(P005)(表2)。HE染色显示露脑畸形小鼠端 脑泡虽然已经分化发育，但是神经腔面不平整，管壁厚薄不一 致，且有细胞脱落现象；后脑顶板未融合，仅被一层羊膜和间质 所包裹(图2)。 表2 MTX对每窝胚胎发育的影响 Table2 EffectsofMTXon embryosperlitter Note：*P005 NTDs VS对照组。 P005 NTDs versus contro1
