1、ICS65.020.99 B22备 案 号 ： 40447-2014 DB32江 苏 省 地 方 标 准DB32/T 2561-2013鹅坦布苏病毒的检测 RT-PCR 方法Method of RT-PCR detecting Goose Tembusu Virus2013-12-20 发布 2014-01-20 实施江 苏 省 质 量 技 术 监 督 局 发 布DB32/T 2561-2013前 言为 规 范 鹅 坦 布 苏 病 毒 分 子 生 物 学 检 测 技 术 ， 提 高 鹅 坦 布 苏 病 毒 检 测 的 灵 敏 度 、 稳 定 性 、 特 异 性 ， 特 制 定 本 标 准 。本
2、 标 准 按 GB/T 1.1-2009 标 准 化 工 作 导 则 第 1部 分 ： 标 准 的 结 构 和 编 写 编 写 。 本 标 准 的 附 录 A为 规 范 性 附 录 。本 标 准 的 附 录 B为 规 范 性 附 录 。 本 标 准 由 江 苏 省 农 业 科 学 院 提 出 。本 标 准 起 草 单 位 ： 江 苏 省 农 业 科 学 院 。 本 标 准 起 草 人 ： 黄 欣 梅 、 李 银 、 刘 宇 卓 、 赵 冬 敏 、 韩 凯 凯 。DB32/T 2561-20131鹅 坦 布 苏 病 毒 的 检 测 RT-PCR 方 法1 范围本标准规范 了鹅坦布 苏病毒分 子生
3、物学 检测技术 RT-PCR的所用引 物序列、 所 涉及的样 品范围、 操作 流 程 、 反 应 条 件 等 技 术 标 准 。本 标 准 适 用 于 检 测 鹅 脾 脏 和 病 毒 细 胞 培 养 液 中 鹅 坦 布 苏 病 毒 核 酸 。2 规 范 性 引 用 文 件下列文件对 于本文件 的应用是 必不可少 的。 凡是注 日 期的引用文 件 ， 仅注日 期的版本 适用于本 文件。 凡 是 不 注 日 期 的 引 用 文 件 ， 其 最 新 版 本 （ 包 括 所 有 的 修 订 单 ） 适 用 于 本 文 件 。GB 165482006 病 害 动 物 和 病 害 动 物 产 品 生 物
4、安 全 处 理 规 程NY/T 5412002 动 物 疫 病 实 验 室 检 验 采 样 方 法3 方法原理聚 合 酶 链 式 反 应 （ Polymerase Chain Reaction） ， 简 称 PCR， 是 一 种 分 子 生 物 学 技 术 ， 用 于 放 大 特 定 的 DNA片 段 ， 可 看 作 生 物 体 外 的 特 殊 DNA复 制 。 PCR技 术 以 其 快 速 、 敏 感 和 特 异 等 优 点 在 动 物 疫 病 检 测 中 得 到 广 泛 应 用 ， 而 且 随 着 PCR技 术 的 不 断 改 进 ， 这 种 针 对 病 原 核 酸 的 诊 断 方 法 表
5、 现 出 更 准 确 、 灵 敏 和 特 异 的 特 点 。 本 标 准 选 取 了 鹅 坦 布 苏 病 毒 非 结 构 蛋 白 NS5基 因 保 守 区 域 ， 设 计 了 一 对 特 异 性 引 物 ， 经 过 了 PCR条 件 的 优 化 、 特 异 性 试 验 、 敏 感 性 试 验 等 ， 对 鹅 坦 布 苏 病 毒 的 鉴 定 具 有 很 高 的 准 确 性 。4 仪 器 设 备 和 主 要 试 剂4.1 仪 器 设 备PCR仪 ， 离 心 机 ， 电 泳 槽 ， 微 量 移 液 器 ， 凝 胶 成 像 系 统 。4.2 主 要 试 剂TRIZOL， 氯 仿 ， 异 丙 醇 ， 无
6、 水 乙 醇 ， 焦 炭 酸 二 乙 酯 （ DEPC） 处 理 的 灭 菌 双 蒸 水 ， AMV反 转 录 酶 ， 5AMV Buffer，10 mmol/L dNTPs，随机引物，RNA酶抑制剂，25 mmol/L MgCl2， 10EX Taq DNA聚合 酶 Buffer， EX Taq DNA聚 合 酶 ， 2.5 mmol/L dNTP， DNA Marker DL-2000， 琼 脂 糖 。5 引物上 游 引 物 ： 5 - GCGGCTCAAGTGGGA - 3 ； 下 游 引 物 ： 5 - CCTCGGTTGTTTGTTTCT -3 。6 样品采集按照NY/T 541-2
7、002动 物 疫 病 实 验 室 检 验 采 样 方 法 ， 病 死 或 扑 杀 发 病 鹅 ， 无 菌 采 集 脾 脏 、 肝 脏 、 脑 、 肺 脏 、 肾 脏 等 组 织 置 于 20 保 存 ， 最 好 用 脾 脏 进 行 检 测 。按照GB 1 6548-2006病 害 动 物 和 病 害 动 物 产 品 生 物 安 全 处 理 规 程 ， 无 害 化 处 理 病 死 鹅 。DB32/T 2561-201327 方法步骤7.1 样 品 处 理取病料 0.5 g1 g 按 1:10 加入 DEPC（ diethypyrocarbonate 焦 碳 酸 二 乙 酯 ） 水 ， 置 研 钵
8、 中 剪 碎 并 研 磨 ， 反 复 冻 融 研 磨 3 次 ， 将 研 磨 好 的 组 织 以 4 1 2000 r/min 离心 10 min， 取 上 清 200 L 备用。阴 性 对 照 ： 没 有 发 病 的 正 常 鹅 脾 脏 。 阳 性 对 照 ： 鹅 坦 布 苏 病 毒 细 胞 培 养 物 （ 见 附 录 ） 。7.2 GTMUV RNA的 提 取取 已 处 理 的 待 检 样 品 ， 以 GTMUV病 毒 细 胞 培 养 物 为 阳 性 对 照 ， 以 正 常 脾 脏 作 为 阴 性 对 照 ， 无 菌 水 为 空 白 对 照 ， 每 管 依 次 加 入 Trizol600
9、L， 振 荡 混 匀 后 ， 室 温 放 置 10 min， 加 入 氯 仿 200 L， 剧 烈 振 荡 后 ， 室温放置1 min， 4 1 2000 r/min， 离 心 15 min， 取 上 层 水 相 750 L， 加 入 500 L异 丙 醇 ， 混 匀 ， -20 放置15 min，4 12000 r/min， 离 心 10 min， 去 上 清 ， 缓 缓 加 入 75 %乙醇1 mL洗 涤 ， 4 8 000 r/min离 心5 min， 去 上 清 ， 室 温 干 燥 20 min， 加 入 DEPC水 10 L， 使 之 充 分 溶 解 。7.3 RT-PCR7.3.1
10、 反 转 录 反 应5AMV Buffer 4 L， 10 mmol/L dNTPs 2 L， 随 机 引 物 1 L， RNA酶 抑 制 剂 0.5 L， RNA模 板 10 L ， AMV反 转录酶 1 L， H2O（DE PC处理） 1.5 L ， 总体积为 20 L， 瞬 间 离心混 匀， 65 反应15 min， 42 孵育 1 h， 95 5 min， 同 时 设 立 阴 性 、 阳 性 对 照 ， 产 物 于 -20 保 存 备 用 。7.3.2 PCR的 反 应按 25 L 体 系 进 行 ， 含 25 mmol/L MgCl2 1.5 L， 灭 菌 水 15.75 L， 反
11、转 录 产 物 2.5 L， 10EX Taq DNA 聚合酶 Buffer 2.5 L， 2.5 mmol/L dNTP 1.5 L， 上 、 下 游 引 物 50 pmol/L 各 0.5 L， EX Taq DNA 聚合酶 0.25 L。 94 3 min， 然 后 进 入 循 环 94 30 s， 52 30 s， 72 40 s， 30 个 循 环 ， 于 72 延伸 10 min， 4 保 存 。7.4 电泳将 PCR反 应 产 物 于 1.2 %琼 脂 糖 凝 胶 进 行 电 泳 ， 电 压 为 120 V，时间30 min， 紫 外 灯 下 观 察 结 果 ， 并 进 行拍照。
12、8 结果判定阳 性 对 照 出 现 515 bp扩 增 条 带 ， 同 时 阴 性 对 照 无 此 扩 增 条 带 时 ， 试 验 成 立 。 在 试 验 结 果 成 立 的 前 提 下 ， 如 果 检 测 样 品 出 现 与 阳 性 对 照 相 同 的 515bp的 扩 增 片 段 时 ， 判 定 为 该 样品 为 鹅 坦 布 苏 病 毒 核 酸 阳 性 ； 否 则 判 定 为 阴 性 。 如果阳性对 照无相应 的目的条 带， 可能是存 在操作 失 误 ， 该试验需要 做重复试 验； 如果阴 性对照有相 应 的 目 的 条 带 ， 可 能 是 阴 性 对 照 存 在 污 染 或 是 操 作
13、失 误 ， 该 试 验 需 要 做 重 复 试 验 。DB32/T 2561-20131附 录 A (规 范 性 附 录 ) 阳 性 样 品 的 制 备为 确 保 本 标 准 的 阳 性 样 品 能 检 测 到 特 异 性 的 目 的 条 带 ， 阳 性 样 品 按 如 下 方 法 制 备 ： 首先， 无菌采 集新鲜GT MUV感染 阳性鹅脾 脏， 用无 菌的 剪刀剪碎并 称量， 然后 以质量比 1:10加 入 DEPC（ diethypyrocarbonate 焦 碳 酸 二 乙 酯 ） 水 ， 研 磨 成 悬 液 ， 装 入 用 DEPC处 理 过 的 离 心 管 中 ， 于 20 反复冻
14、融3次 ， 以1 2000 r/min， 4 离 心 10 min， 取 上 清接种于 BHK-21细胞 （仓鼠 肾传代细 胞） ， 置37 ， 5% CO2培 养 箱 中 培 养 ， 接 种 5天 后 将 细 胞 及 培 养 液 反 复 冻 融 3次 ， 收 集 细 胞 冻 融 液 ， 连 续 盲 传 5代 ， 收 集 细 胞 冻 融 液 ， 4 12000 r/min 离心10 min， 收 集 上 清 液 ， 无 菌 分 装 ， 并 进 行 病 毒 效 价 测 定 ， 病 毒 含 量 （ TCID50） 达 到 10-5/0.1 mL以 上 ， 即 可 作 为 阳 性 对 照 ， 70
15、保 存 备 用 。1附 录 B (规 范 性 附 录 )RT-PCR 扩 增 产 物 参 考 序 列DB32/T 2561-2013本 标 准 参 照 的 序 列 为 GenBank上 公 布 的 GTMUV NS5基 因 保 守 区 域 序 列 (8322 8836bp) GCGGCTCAAGTGGGAATGTGACAAATAGTATCAATACAGTAAGCCAAATGCTGATCAACAGGATGCACAAAACCAACCGCAATGGACCCAGGTATGAAGAAGATGTGGACTTGGGTTCAGGGACCAGAGCTGTGAGCTGCACAAGACAGAGGACTGACTGGG
16、GAATGGTCGCTG ATAGGGTGAAGAATTTGGCCAGAGAATATGCTCCGTCTTGGCATTATGACCAAGACAATCCTTACAAGACTTGGAACTATCATGGAAGC TACGAAGTGAAAGCCACAGGCTCAGCCAGCTCAATGGTTAATGGGGTAGTTAGGATACTGTCAAAACCTTGGGACACCTTGCAAAACGT GGTAAATATGGCCATGACGGACACCACTCCTTTTGGGCAACAGCGCGTTTTTAAAGAAAAGGTTGATACCAAAGCCCCAGAACCACCTG CAGGAACAGCTAGGGTCATGAACATCGTGGCAAGATGGATGTGGAACTTTGTTGGCAGAAACAAACAACCGAGG
