1、ICS65.020.30 B22备 案 号 ： 40494-2014 DB32江 苏 省 地 方 标 准DB32/T 2608-2013猪 流 行 性 乙 型 脑 炎 诊 断 技 术Diagnostic Techniques for Japanese Encephalitis of Swine2013-12-20 发布 2014-01-20 实施江 苏 省 质 量 技 术 监 督 局 发 布DB32/T 2608-2013前 言为 规 范 猪 乙 型 脑 炎 诊 断 技 术 ， 特 制 定 本 标 准 。本 标 准 按 GB/T 1.12009 标 准 化 工 作 导 则 第 1部 分 ： 标
2、 准 的 结 构 和 编 写 进 行 编 制 。 本 标 准 由 江 苏 省 农 业 科 学 院 提 出 。本 标 准 起 草 单 位 ： 江 苏 省 农 业 科 学 院 。 本 标 准 起 草 人 ： 张 雪 寒 、 何 孔 旺 、 王 小 敏 、 郭 容 利 、 倪 艳 秀 、 李 彬 、 温 立 斌 、 周 俊 明 、 俞 正 玉 。DB32/T 2608-20131猪 乙 型 脑 炎 诊 断 技 术1 范围本 标 准 规 定 了 猪 乙 型 脑 炎 的 诊 断 技 术 。本标准规定 的分离鉴 定， 间接免 疫荧光 技术和RT- LAMP法适用于本 病的确诊， RT-LAMP适用于大 批
3、量 样 品 的 普 查 。2 规 范 性 引 用 文 件下列文件对 于本文件 的应用是 必不可少 的。 凡是注 日 期的引用文 件 ， 仅注日 期的版本 适用于本 文件。 凡 是 不 注 日 期 的 引 用 文 件 ， 其 最 新 版 本 （ 包 括 所 有 的 修 订 单 ） 适 用 于 本 文 件 。GB 16548 病 害 动 物 和 病 害 动 物 产 品 生 物 安 全 处 理 规 程GB/T 6682-2008 分 析 实 验 室 用 水 规 格 和 试 验 方 法GB/T 18638 流 行 性 乙 型 脑 炎 诊 断 技 术NY/T 541 动 物 疫 病 实 验 室 检 验
4、采 样 方 法3 流 行 病 学 诊 断3.1 易 感 动 物多 种 动 物 可 感 染 乙 型 脑 炎 病 毒 ， 多 呈 隐 性 感 染 ， 但 可 成 为 传 染 源 。 猪 是 乙 型 脑 炎 的 重 要 传 染 源 ， 不 同 年 龄 段 的 猪 均 能 够 感 染 ， 但 临 床 症 状 有 所 不 同 。 成 年 猪 感 染 后 可 造 成 严 重 的 生 殖 障 碍 。3.2 易 感 季 节本 病 的 发 生 有 明 显 的 季 节 性 ， 每 年 7-9月 份 发 病 率 最 高 。3.3 传 播 媒 介蚊 虫 叮 咬 是 乙 型 脑 炎 病 毒 传 播 的 主 要 媒 介
5、。 消 灭 传 播 媒 介 蚊 虫 是 本 病 的 主 要 预 防 措 施 。4 临床诊断猪 流 行 性 乙 型 脑 炎 是 一 种 发 病 率 高 死 亡 率 低 的 繁 殖 障 碍 性 传 染 病 ， 临 床 症 状 为 高 热 、 沉 郁 或 狂 暴 、 意 识 障 碍 、 抽 搐 、 呼 吸 衰 竭 和 脑 膜 刺 激 症 。 感 染 乙 脑 病 毒 病 猪 症 状 主 要 表 现 为 繁 殖 障 碍 :母 猪 表 现 为 流 产 、 死 胎 、 木 乃 伊 胎 ； 公 猪 多 表 现 为 单 侧 睾 丸 炎 ， 精 液 品 质 不 良 ， 失 去 配 种 能力 。5 病 理 学 诊
6、断公 猪 睾 丸 不 同 程 度 肿 大 ， 切 面 可 见 睾 丸 实 质 充 血 、 出 血 ， 并 有 许 多 颗 粒 状 的 突 起 ， 有 明 显的 黄 色 坏 死 灶 。 慢 性 病 例 睾 丸 内 萎 缩 硬 化 ， 缩 到 如 鸡 蛋 大 ， 与 阴 囊 粘 连 ， 睾 丸 实 质 大 部 分 结 缔组 织 化 。 流 产 母 猪 子 宫 内 膜 显 著 充 血 ， 粘 膜 上 覆 有 粘 稠 的 分 泌 物 ， 膜 面 有 少 数 小 点 状 出 血 。 子宫 粘 膜 下 组 织 水 肿 ， 胎 盘 呈 炎 性 浸 润 。 本 死 胎 很 少 发 生 腐 败 。 一 般 在
7、体 躯 后 部 皮 下 有 弥 漫 性 水 肿 ， 全 身 肌 肉 退 色 ， 好 像 水 煮 肉 。 胸 腔 和 心 包 常 有 积 液 ， 实 质 器 官 浊 肿 及 散 发 小 出 血 点 。 脑膜 和 脊 髓 硬 膜 有 出 血 。DB32/T 2608-201326 病 原 学 诊 断6.1 病 毒 分 离6.1.1 材 料 准 备除 另 有 规 定 ， 所 用 试 剂 均 为 分 析 纯 ， 水 为 符 合 GB/T 66822008的 灭 菌 二 级 水 。 PBS， DMEM， 兔 抗 猪 乙 型 脑 炎 病 毒 高 免 血 清 和 健 康 兔 血 清 。6.1.2 病 料 采
8、 集按NY/T 541规定的方法采样。疑 似 JE病 例 ， 流 产 胎 儿 、 死 胎 、 木 乃 伊 胎 等 的 脑 组 织 ， 以 及 公 猪 精 液 和 猪 舍 蚊 子 等 靶 组 织 样 品 。 将猪脑组织或蚊子（50-100只/次）分别置于研钵中，加入PBS反 复 研 磨 ， 直 至 样 品 研 磨 成 匀 浆 、 组 织 碎 片 基 本 消 失 为 止 。 将 研 磨 液 分 装 于 1.5 mL EP管 中 ， - 70 冰箱 反 复 冻 融 3次 ， 4 12000 r/min离 心 5 min， 取 上 清 液 ， 经 一 次 性 滤 器 （ 孔 径 0.22 m） 过 滤
9、 后 ， - 70 保 存 备 用 。 公 猪 精 液 的 预 处 理 仅 是 省 去 研 磨 过 程 ， 其 他 步 骤 与 猪 脑 组 织 或 蚊 子 的 预 处 理 一 致 。6.1.3 细 胞 培 养取 培 养 至 单 层 的 BHK- 21细 胞 ， 用 PBS洗 3次 后 ， 加 入 过 滤 的 病 料 上 清 液 1.0 1.2 mL， 37 细 胞 培 养 箱中吸附1.5 h， 期 间 每 隔 20 min轻 摇 细 胞 瓶 1次 。 弃 上 清 液 ， 用 PBS洗 1次 后 加 入 2 %维 持 液 ， 置 5 %CO2、 37 细 胞 培 养 箱 中 培 养 3 5 d，
10、 每 天 观 察 细 胞 病 变 （ CPE） 。 如 无 CPE则 于 接 毒 后 5 d收 毒 ， 盲 传 3 5代 。6.1.4 乳 鼠 接 种每只乳鼠脑 内接种30. 0 L或 脑内兼腹 腔各注射3 0.0 L过滤的病 料上清， 对 照组脑 内注射生 理盐 水30.0 L。 每 天 观 察 小 鼠 精 神 状 态 2 3次 ， 连 续 2 3周 。 待 小 鼠 出 现 神 经 症 状 后 （ 若 无 症 状 者 则 于 接 毒 3周 后 ） 无 菌 剖 取 鼠 脑 ， 加 入 适 量 PBS研 磨 成 乳 液 ， 反 复 冻 融 离 心 后 ， 取 上 清 液 用 0.22 m滤 器
11、过 滤 ， 再 次 接 种 乳 鼠 连 续 传 代 。6.2 病 毒 鉴 定6.2.1 免 疫 荧 光 鉴 定在 24 孔 细 胞 培 养 板 中 接 毒 ， 培 养 48 72 h 后 ， 弃 原 液 ， 用 PBS 冲 洗 后 加 入 - 20 预 冷 的 丙 酮 ， 室温下固定 10 min； PBS 冲 洗 ， 加 入 稀 释 好 的 猪 JEV 阳 性 血 清 ， 置 37 湿 盒 中 孵 育 1 h； PBS 冲 洗 ， 加 入已稀释的 荧光素标 记的兔抗 猪抗体， 37 湿盒中 作 用 1h； PBS 冲洗 后加入甘 油缓冲液， 于倒置荧 光显 微 镜 下 观 察 。 同 时 设
12、 阴 性 对 照 。6.2.2 反 转 录 -环 介 导 等 温 扩 增 法 （ RT-LAMP） 鉴 定上 述 制 备 的 病 料 ， 用 商 品 化 试 剂 盒 提 取 RNA， 作 为 RT-LAMP模 板 。 根 据 JEV囊 膜 糖 蛋 白 E基 因 6 个 特 异 性 区 域 设 计 4条 引 物 ： F3和 B3为 外 引 物 ； FIP和 BIP为 内 引 物 。F3：5- C AACATTGCACGTCCGCAT -3； B3：5- A AGTCCACATCCGATGCC-3；FIP： 5 -CCACCGTCGAGTTGTCAGTGACTTTTCGAAGCTAGCGAACTT
13、GCT -3 ； BIP： 5 -CACGACTGGAGATGCGCACAATTTTCCCACGGTCACTGAAGCCTT -3 。外 引 物 扩 增 产 物 为 245bp。LAMP扩 增 产 物 在 电 泳 图 谱 上 表 现 为 大 小 不 一 的 梯 状 条 带 。 RT-LAMP的 扩 增 条 件 ： 65 水 浴 锅 中 放 置 70min。优化后的反 应体系中： 含有0.2 M F3、 B3， 2M FIP、 BIP， 0.8M dNTPs， 20mM Tris-HCl（p H8.8） ，2+10mM KCl， 10mM (NH4)2SO4， 6mM Mg ，0.1% T ri
14、ton X-100， 1.1mM甜 菜 碱 ， 8U BST 聚 合 酶 ， 1U AMV反转 录 酶 ， 再 加 入 5 L的 模 板 RNA。 加 入 钙 黄 绿 素 荧 光 染 料 ， 肉 眼 观 察 结 果 ， 绿 色 ， 判 为 阳 性 ， 橙 色 ， 判 为阴性。 以1.5琼 脂糖凝 胶电泳 ， 出现梯 状条带 ， 判 为阳性， 无条带 ， 判为阴 性。 并 用建立 的 RT-LAMP 方法扩增猪 瘟 （CSFV） ， 蓝耳 病毒 （PRRSV） ， 圆 环病 毒 （PCV2） 、 伪狂犬 病毒 （PRV） 、 细小 病毒 （PPV） 、 传 染 性 胃 肠 炎 病 毒 （ TGE
15、V） 、 传 染 性 腹 泻 病 毒 （ PEDV） 和 轮 状 病 毒 （ RV） 以 检 验 其 特 异 性 。3DB32/T 2608-20136.3 结 果 判 定以 上 实 验 为 阳 性 ， 判 为 猪 乙 型 脑 炎 病 毒 。7 最 终 结 论 判 定下 列 任 何 情 况 之 一 ， 均 可 判 为 猪 乙 型 脑 炎 ：7.1 发 病 有 明 显 季 节 性 ， 并 主 要 发 生 在 夏 季 ， 以 7-9月 份 为 主 、 个 体 临 床 表 现 明 显 ， 病 例 解 剖 病 变 典 型 ， 用 第 6章 中 任 何 一 种 试 验 确 诊 为 猪 乙 型 脑 炎 病 毒 阳 性 者 。7.2 临 床 症 状 和 发 病 情 况 不 详 ， 群 体 解 剖 检 查 病 变 典 型 ， 用 第 6章 中 任 何 一 种 实 验 确 诊 为 猪 乙 型 脑 炎 病 毒 阳 性 者 。7.3 发 病 情 况 、 临 床 症 状 、 病 理 变 化 不 详 ， 如 用 第 6章 中 任 何 一 种 实 验 确 诊 为 猪 乙 型 脑 炎 病 毒 阳 性 者 。
