1、ICS 65.150 B50备 案 号 : 51404-2016 DB32江 苏 省 地 方 标 准DB32/T 2957-2016鲤 疱 疹 病 毒 型 PCR 检测方法PCR inspection specification of cyprinid herpesvirus2016 - 09 - 20 发布 2016 - 11 - 20 实施江 苏 省 质 量 技 术 监 督 局 发 布DB32/T 2957-2016I 前 言本 标 准 按 GB/T1.12009 标 准 化 工 作 导 则 第 1部 分 : 标 准 的 结 构 和 编 写 规 则 要 求 进 行 编 写 。 本 标 准
2、由 江 苏 省 海 洋 与 渔 业 局 提 出 。 本 标 准 起 草 单 位 : 江 苏 省 水 生 动 物 疫 病 预 防 控 制 中 心 。 本 标 准 主 要 起 草 人 : 陈 辉 、 袁 锐 、 方 苹 、 倪 金 俤 、 刘 训 猛 、 陈 静 、 郭 立 新 、 吴 亚 锋 DB32/T 2957-20161 鲤疱疹病毒型 PCR 检测方法1 范围本 标 准 规 定 了 鲤 疱 疹 病 毒 型 ( cyprinid herpesvirus ) 检 测 方 法 的 试 剂 和 材 料 、 仪 器 和 设 备 、 采 样 、 检 测 步 骤 和 结 果 判 断 。 本 标 准 适
3、用 于 鲫 鱼 疱 疹 病 毒 病 病 原 的 检 测 。 2 规 范 性 引 用 文 件下列文 件对 于本 文件 的应 用是必 不可 少的 。 凡 是注 日 期的引 用文 件, 仅注 日期 的 版本适 用于 本文 件。 凡 是 不 注 日 期 的 引 用 文 件 , 其 最 新 版 本 ( 包 括 所 有 的 修 改 单 ) 适 用 于 本 文 件 。 GB/T 6682-2008分 析 实 验 室 用 水 规 格 和 试 验 方 法 SC/T 7014-2008 水 生 动 物 产 地 检 疫 采 样 技 术 规 范 3 试 剂 和 材 料3.1 水符合 GB/T 6682-2008 中
4、一 级 水 的 规 格 。 (该 水 用 来 配 置 规 范 性 附 录 A 中 所 列 试 剂 ) 3.2 无 水 乙 醇3.3 十 六 烷 基 三 甲 基 溴 化 铵 ( CTAB)3.4 Taq DNA 聚 合 酶 及 配 套 的 10PCR 缓 冲 液Taq DNA 聚 合 酶 或 Ex Taq DNA 聚 合 酶 , 生 化 试 剂 , -20 保 存 。 10PCR 缓 冲 液 为 该 酶 配 套 的 相 应 反 应 缓 冲 液 , 生 化 试 剂 , -20 保 存 。3.5 MgCl2(25m mol/L) :生化 试剂 , -20保 存。3.6 dNTPs 混 合 物含 dA
5、TP、d TTP、d CTP、d GTP 各 10mmol/L 的混合 物,- 20保 存。3.7 5TBE 电 泳 缓 冲 液 ( 按 附 录 A 的 规 定 ) 。3.8 6DNA 上 样 缓 冲 液 ( 按 附 录 A 的 规 定 ) 。3.9 引 物 及 扩 增 片 段鲤疱疹 病毒 型 DNA 聚 合酶基 因扩 增引 物 : P1: 5- CCCAGCAACATGTGCGACGG-3, P2: 5-CCGTARTGAGAGTTGGCGCA-3。 扩 增 片 段 大 小 为 362 bp。注 : 该 引 物 为 扩 增 鲤 疱 疹 病 毒 型 DNA 聚 合 酶 基 因 的 通 用 引
6、物 。3.10 DNA 分 子 量 标 准DB32/T 2957-20162 宜 使 用 DNA marker 2000, 各 片 段 大 小 依 次 为 : 2000 bp, 1000bp, 750bp, 500bp, 250bp, 100bp, 也 可 使 用 其 他 合 适 的 DNA 分 子 量 标 准 。3.11 阳 性 对 照阳 性 对 照 为 已 知 受 鲤 疱 疹 病 毒 型 感 染 , 且 PCR 检 测 结 果 为 鲤 疱 疹 病 毒 型 阳 性 并 经 测 序 验 证 的DNA 模 板 , -20 保 存 。3.12 阴 性 对 照 好阴 性 对 照 为 已 知 未 受
7、鲤 疱 疹 病 毒 型 感 染 , 且 PCR 检 测 结 果 为 鲤 疱 疹 病 毒 型 阴 性 的 组 织 , 提 取DNA, -20 保 存 。 3.13 空 白 对 照灭菌双 蒸水 ( 无 DNA 酶) 。3.14 核 酸 染 色 剂Goldview TM 核 酸 染 料 或 其 他 宜 使 用 的 核 酸 染 料 。4 仪 器 和 设 备4.1 台 式 高 速 离 心 机 : 最 高 转 速 可 达 12000 rpm 以 上 。4.2 普 通 冰 箱 : 具 有 冷 藏 箱 , -20 以 下 冷 冻 箱 体 。4.3 PCR 仪 。4.4 电 泳 仪 : 输 出 直 流 电 压
8、0-600V。4.5 水 平 电 泳 槽 。4.6 凝 胶 成 像 仪 。4.7 水 浴 锅 或 者 金 属 浴 。5 采样5.1 采 样 数 量按 SC/T 7014-2008 中 6.1 的 规 定 执 行 。5.2 个 体 要 求活 鱼 或 濒 死 的 鱼 。5.3 采 样 部 位有临床 症状 的鱼 ,如 体长 不超 过 4 cm,取鳃 ;体长 为 4 cm6 cm,取 鳃和 内 脏(包 括肾 ) ; 体长 大 于 6cm, 则 取 脑 、 肝 、 肾 、 脾 和 鳃 组 织 。无 症 状 的 鱼 取 肾 、 脾 、 鳃 和 脑 组 织 。 性 成 熟 雌 鱼 还 需 取 卵 巢 液 。
9、DB32/T 2957-20163 5.4 操 作 要 求5.4.1 采 样 及 样 品 前 处 理 过 程 中 应 戴 一 次 性 手 套 , 样 本 间 不 得 交 叉 污 染 。5.4.2 镊 子 , 剪 刀 等 取 样 工 具 需 要 进 行 灭 菌 ( 湿 热 灭 菌 为 121 , 20 min; 干 燥 灭 菌 为 160 , 3 小 时 ) 。5.4.3 实 验 室 以 外 的 环 境 下 采 得 的 组 织 样 品 需 用 液 氮 及 时 保 存 。6 检 测 步 骤6.1 DNA 抽 提6.1.1 取 100 mg 左 右待 检新 鲜 组织 与 300 L CTAB 溶液研
10、 磨匀 浆, 置 于 1.5 mL 离心管内。 加 入 450 uL CTAB 溶 液 并 混 匀 , 65 放 置 2 h。6.1.2 加 入 600 L 酚 -氯 仿 -异 戊 醇 ( 25:24:1) 至 样 品 离 心 管 中 , 持 续 上 下 颠 倒 用 力 混 合 至 少 1 min,12000 r/min 4 离 心 10min, 小 心 取 上 层 水 相 ( 约 700 L) 置 于 新 的 1.5 mL 离 心 管 中 。6.1.3 加入 700 L 氯 仿 -异 戊 醇 ( 24:1) , 用 力 混 合 至 少 30 s, 12000 r/min 4 离 心 5 mi
11、n, 小 心 取 上层 水 相 ( 约 600 L)置于新的 1.5 mL 离 心 管 中 。6.1.4 加 入 -20 预 冷 的 1.5 倍 体 积 无 水 乙 醇 ( 约 900 L) , 倒 转 数 次 混 匀 后 , 置 -20 沉 淀 1 h 以 上 。6.1.5 12000 r/min 4 离 心 30 min, 小 心 去 上 清 , 倒 置 于 吸 水 纸 上 吸 干 水 分 ; 室 温 干 燥 或 真 空 干 燥 。6.1.6 加 10 L 双 蒸 水 溶 解 , 作 为 DNA 模 板 。DNA 抽 提 也 可 选 用 商 品 化 病 毒 DNA 抽 提 试 剂 盒 ,
12、按 相 应 说 明 书 提 供 的 方 法 予 以 抽 提 。6.2 基 因 扩 增6.2.1 按 表 加 入 除 了 Taq DNA 聚 合 酶 和 待 检 DNA 模 板 或 对 照 以 外 的 各 项 试 剂 , 配 成 无 酶 反 应 预 混 物 。PCR 反 应 体 系 表试剂 50L 体 系 100L 体 系 试剂终浓度10PCR 缓 冲 液 ( 无 Mg2+) 5 10 1MgCl2( 25mmol/L) 5 10 2.5mmol/LdNTP(10mmol/L) 1 2 0.2mmol/L100pmol/L 引 物 F1 0.5 1 1pmol/L100pmol/L 引 物 R1
13、 0.5 1 1pmol/L灭 菌 双 蒸 水 32.75 65.5Taq DNA 聚 合 酶 ( 5U/L) 0.25 0.5 0.025U/L待 检 DNA 模 板 或 对 照 5 106.2.2 将 无 酶 反 应 预 混 物 按 44.75 L( 50 L 体 系 ) 或 89.5 L (100 L 体 系 )预 混 液 分 装 , 保 存 于 -20(最多 保存 六个 月) 。 在 临 用前 , 根 据所 需的 反应 份 数, 取出 无酶 反应 预混 物, 加入相 应体 积 的 Taq DNA4 DB32/T 2957-2016聚 合 酶 , 混 匀 , 即 成 完 全 反 应 预
14、混 物 。6.2.3 将 完 全 反 应 预 混 物 按 1 份 /支 分 装 到 无 DNA 聚 合 酶 的 0.2mL PCR 待 检 管 、 阳 性 对 照 管 、 阴 性 对 照 管 、 空 白 对 照 管 中 , 分 别 在 待 检 管 、 阳 性 对 照 管 、 阴 性 对 照 管 、 空 白 对 照 管 中 加 入 相 应 体 积 的 样 品 待 检 DNA 模板、 阳性 对照 DNA、 阴 性对 照 DNA、 空白 对照 (5 0 L 体系加 5L, 100 L 体系加 10 L) 。 6.2.4 将上述 PCR 管 置于 PCR 扩 增仪 中 。 94 预 变 性 5 min
15、; 95 变性 1 min、 55 退火 1 min、 72 延伸 1 min, 40 次 循 环 ; 72 延 伸 10 min; 4 保 温 。6.3 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳6.3.1 用 电 泳 缓 冲 液 TBE 配制 1.5% 的 琼 脂 糖 ( 加 入 相 应 量 的 核 酸 染 料 , 加 入 量 参 见 该 核 酸 染 料 说 明 书 ) 凝 胶 , 厚 0.5 cm 左 右 。6.3.2 将 平 板 放 入 水 平 电 泳 槽 , 电 泳 缓 冲 液 刚 好 淹 没 胶 面 。6.3.3 加 样 : 10 L 样 品 加 入 2 L 样 品 缓 冲 液 , 混 匀 后 加
16、 入 样 品 孔 。6.3.4 电 泳 : 5V/cm 电 泳 约 30 min 停 止 。6.3.5 紫 外 灯 下 观 察 核 酸 带 , 并 记 录 结 果 。7 结 果 判 断7.1 PCR 产 物 经 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 后 , 当 阳 性 对 照 出 现 一 条 362 bp 的 DNA 条 带 , 阴 性 对 照 和 空 白 对 照 没 有 扩 增 条 带 , 待 检 样 品 出 现 一 条 与 阳 性 对 照 一 致 的 DNA 条 带 ( 同 样 为 362 bp) 则 判 定 为 鲤 疱 疹 病 毒 型 阳 性 。7.2 当 PCR 扩 增 产 物 经 琼 脂 糖
17、凝 胶 电 泳 检 测 出 现 可 疑 条 带 时 , 应 将 待 检 样 品 的 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 检 测 条 带 回 收 后 进 一 步 进 行 DNA 测 序 。 将 所 测 序 列 与 已 知 的 鲤 疱 疹 病 毒 型 DNA 聚 合 酶 基 因 序 列 ( 参 考 附 录 B) 比 较 , 同 源 性 达 95% 以 上 判 定 为 鲤 疱 疹 病 毒 型 阳 性 。5 DB32/T 2957-2016附 录 A( 规 范 性 附 录 ) 试 剂 及 其 配 制A.1 CTAB溶 液按 2% CTAB、 1.4 mol/L NaCl、 20.0 mmol/L, EDTA、
18、 20.0 mol/L Tris-HCl pH 7.5 配 制 。 用 前 加 巯 基 乙 醇 至 终 浓 度 为 0.25%( 配 制 时 在 60 ml 水 中 顺 序 加 入 : 8.19g NaCl, 0.744g EDTA, 1.21g Tris, 约 0.25-0.3mL 浓 HCl, 使 pH=7.5-8.0,再 加入 2g CTAB,完全 溶解 后加 水 至 100mL) 。A.2 酚 三 氯 甲 烷 异 戊 醇用 1.0 mol/L pH 7.90.2 Tris 过 饱 和 的 重 蒸 酚 、 三 氯 甲 烷 和 异 戊 醇 按 25:24:1 的 比 例 混 合 , 密 闭
19、 避 光 保存。A.3 三 氯 甲 烷 异 戊 醇将 三 氯 甲 烷 和 异 戊 醇 按 24:1 的 比 例 混 合 , 密 闭 避 光 保 存 。A.4 TBE电 泳 缓 冲 液 ( 5浓 缩 液 )Tris 54.0 g硼酸 27.5 g乙 二 胺 四 乙 酸 2.922g加 水 到 1000.0 mL用 5.0 mol/L 的盐酸调至 pH 8.0。A.5 6DNA上 样 缓 冲 液溴 酚 蓝 100 mg, 加 双 蒸 水 5mL, 在 室 温 下 过 夜 。 待 溶 解 后 再 称 取 蔗 糖 25 g, 加 双 蒸 水 溶 解 后 移 入 溴 酚蓝 溶 液 中 , 摇 匀 后 定
20、 容 至 50 mL。 加 入 氢 氧 化 钠 ( NaOH) 溶 液 1 滴 , 调 至 蓝 色 。6 DB32/T 2957-2016附 录 B( 资 料 性 附 录 )鲤 科 疱 疹 病 毒 型 DNA 聚 合 酶 基 因 参 考 序 列 ( GenBank 登 录 号 : AY939863.1)1 CCCAGCAACA TGTGCGACGG AGGCATCAGC CCAGAGTCCA TAGTGTCTAG GAGCGACCCG 61 TTCTGTCTCG AGTATGTCAG AAACTGCGTG CTGCTCGATT GGAAAAAGAT ACCGGCCGCC 121 AGTAACA
21、TGG AAGAGATCAA GGAATACCCG CACAGCGAAG ACCTGTACAC GATCCTGTGC 181 TACAAGAACC GAGAGGTCGG TTGGACTCGG TTTGTGACCT ACACCGCTTC CAGTCTGGGC 241 CACTACCTCT CTATGAGATC TCAGTACAAG AAACGCATCA AGACCGAGAA AGACGCGAGT 301 CTCAAGGCGT ACTATGATCA GATGCAGGGT GAGATGAAAG TATGCGCCAA CTCTCACTAC 361 GGCGTGAGCC AGAGTCTCTG TCAGC
22、ATCTG ACTACTTGGT CCGGACGCCA AAAGATTCTG 421 CTGGTCGAGA ACGCTGTAAA ACACACTCCG GGTATGACCG TCGTGTA 注 : 下 划 线 表 示 相 应 的 上 、 下 游 引 物 结 合 序 列7 DB32/T 2957-2016附 录 C( 资 料 性 附 录 ) 鲤 疱 疹 病 毒 , 型 特 异 性 PCR 电 泳 图100bp 250bp500bp 750bp 1000bp2000bp1 2 3 4 5从 左 至 右 依 次 为 : 1: DNA Mark; 2: 阳 性 对 照 ; 3: 阴 性 对 照 ; 4: 空 白 对 照 ; 5: 阳 性 结 果 。