分享
分享赚钱 收藏 举报 版权申诉 / 9

类型DB32T2957-2016 鲤疱疹病毒Ⅱ型PCR检测方法.docx

  • 上传人:oceanpvg
  • 文档编号:5259528
  • 上传时间:2019-02-15
  • 格式:DOCX
  • 页数:9
  • 大小:36.53KB
  • 配套讲稿:

    如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。

    特殊限制:

    部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。

    关 键  词:
    DB32T2957-2016 鲤疱疹病毒Ⅱ型PCR检测方法.docx
    资源描述:

    1、ICS 65.150 B50备 案 号 : 51404-2016 DB32江 苏 省 地 方 标 准DB32/T 2957-2016鲤 疱 疹 病 毒 型 PCR 检测方法PCR inspection specification of cyprinid herpesvirus2016 - 09 - 20 发布 2016 - 11 - 20 实施江 苏 省 质 量 技 术 监 督 局 发 布DB32/T 2957-2016I 前 言本 标 准 按 GB/T1.12009 标 准 化 工 作 导 则 第 1部 分 : 标 准 的 结 构 和 编 写 规 则 要 求 进 行 编 写 。 本 标 准

    2、由 江 苏 省 海 洋 与 渔 业 局 提 出 。 本 标 准 起 草 单 位 : 江 苏 省 水 生 动 物 疫 病 预 防 控 制 中 心 。 本 标 准 主 要 起 草 人 : 陈 辉 、 袁 锐 、 方 苹 、 倪 金 俤 、 刘 训 猛 、 陈 静 、 郭 立 新 、 吴 亚 锋 DB32/T 2957-20161 鲤疱疹病毒型 PCR 检测方法1 范围本 标 准 规 定 了 鲤 疱 疹 病 毒 型 ( cyprinid herpesvirus ) 检 测 方 法 的 试 剂 和 材 料 、 仪 器 和 设 备 、 采 样 、 检 测 步 骤 和 结 果 判 断 。 本 标 准 适

    3、用 于 鲫 鱼 疱 疹 病 毒 病 病 原 的 检 测 。 2 规 范 性 引 用 文 件下列文 件对 于本 文件 的应 用是必 不可 少的 。 凡 是注 日 期的引 用文 件, 仅注 日期 的 版本适 用于 本文 件。 凡 是 不 注 日 期 的 引 用 文 件 , 其 最 新 版 本 ( 包 括 所 有 的 修 改 单 ) 适 用 于 本 文 件 。 GB/T 6682-2008分 析 实 验 室 用 水 规 格 和 试 验 方 法 SC/T 7014-2008 水 生 动 物 产 地 检 疫 采 样 技 术 规 范 3 试 剂 和 材 料3.1 水符合 GB/T 6682-2008 中

    4、一 级 水 的 规 格 。 (该 水 用 来 配 置 规 范 性 附 录 A 中 所 列 试 剂 ) 3.2 无 水 乙 醇3.3 十 六 烷 基 三 甲 基 溴 化 铵 ( CTAB)3.4 Taq DNA 聚 合 酶 及 配 套 的 10PCR 缓 冲 液Taq DNA 聚 合 酶 或 Ex Taq DNA 聚 合 酶 , 生 化 试 剂 , -20 保 存 。 10PCR 缓 冲 液 为 该 酶 配 套 的 相 应 反 应 缓 冲 液 , 生 化 试 剂 , -20 保 存 。3.5 MgCl2(25m mol/L) :生化 试剂 , -20保 存。3.6 dNTPs 混 合 物含 dA

    5、TP、d TTP、d CTP、d GTP 各 10mmol/L 的混合 物,- 20保 存。3.7 5TBE 电 泳 缓 冲 液 ( 按 附 录 A 的 规 定 ) 。3.8 6DNA 上 样 缓 冲 液 ( 按 附 录 A 的 规 定 ) 。3.9 引 物 及 扩 增 片 段鲤疱疹 病毒 型 DNA 聚 合酶基 因扩 增引 物 : P1: 5- CCCAGCAACATGTGCGACGG-3, P2: 5-CCGTARTGAGAGTTGGCGCA-3。 扩 增 片 段 大 小 为 362 bp。注 : 该 引 物 为 扩 增 鲤 疱 疹 病 毒 型 DNA 聚 合 酶 基 因 的 通 用 引

    6、物 。3.10 DNA 分 子 量 标 准DB32/T 2957-20162 宜 使 用 DNA marker 2000, 各 片 段 大 小 依 次 为 : 2000 bp, 1000bp, 750bp, 500bp, 250bp, 100bp, 也 可 使 用 其 他 合 适 的 DNA 分 子 量 标 准 。3.11 阳 性 对 照阳 性 对 照 为 已 知 受 鲤 疱 疹 病 毒 型 感 染 , 且 PCR 检 测 结 果 为 鲤 疱 疹 病 毒 型 阳 性 并 经 测 序 验 证 的DNA 模 板 , -20 保 存 。3.12 阴 性 对 照 好阴 性 对 照 为 已 知 未 受

    7、鲤 疱 疹 病 毒 型 感 染 , 且 PCR 检 测 结 果 为 鲤 疱 疹 病 毒 型 阴 性 的 组 织 , 提 取DNA, -20 保 存 。 3.13 空 白 对 照灭菌双 蒸水 ( 无 DNA 酶) 。3.14 核 酸 染 色 剂Goldview TM 核 酸 染 料 或 其 他 宜 使 用 的 核 酸 染 料 。4 仪 器 和 设 备4.1 台 式 高 速 离 心 机 : 最 高 转 速 可 达 12000 rpm 以 上 。4.2 普 通 冰 箱 : 具 有 冷 藏 箱 , -20 以 下 冷 冻 箱 体 。4.3 PCR 仪 。4.4 电 泳 仪 : 输 出 直 流 电 压

    8、0-600V。4.5 水 平 电 泳 槽 。4.6 凝 胶 成 像 仪 。4.7 水 浴 锅 或 者 金 属 浴 。5 采样5.1 采 样 数 量按 SC/T 7014-2008 中 6.1 的 规 定 执 行 。5.2 个 体 要 求活 鱼 或 濒 死 的 鱼 。5.3 采 样 部 位有临床 症状 的鱼 ,如 体长 不超 过 4 cm,取鳃 ;体长 为 4 cm6 cm,取 鳃和 内 脏(包 括肾 ) ; 体长 大 于 6cm, 则 取 脑 、 肝 、 肾 、 脾 和 鳃 组 织 。无 症 状 的 鱼 取 肾 、 脾 、 鳃 和 脑 组 织 。 性 成 熟 雌 鱼 还 需 取 卵 巢 液 。

    9、DB32/T 2957-20163 5.4 操 作 要 求5.4.1 采 样 及 样 品 前 处 理 过 程 中 应 戴 一 次 性 手 套 , 样 本 间 不 得 交 叉 污 染 。5.4.2 镊 子 , 剪 刀 等 取 样 工 具 需 要 进 行 灭 菌 ( 湿 热 灭 菌 为 121 , 20 min; 干 燥 灭 菌 为 160 , 3 小 时 ) 。5.4.3 实 验 室 以 外 的 环 境 下 采 得 的 组 织 样 品 需 用 液 氮 及 时 保 存 。6 检 测 步 骤6.1 DNA 抽 提6.1.1 取 100 mg 左 右待 检新 鲜 组织 与 300 L CTAB 溶液研

    10、 磨匀 浆, 置 于 1.5 mL 离心管内。 加 入 450 uL CTAB 溶 液 并 混 匀 , 65 放 置 2 h。6.1.2 加 入 600 L 酚 -氯 仿 -异 戊 醇 ( 25:24:1) 至 样 品 离 心 管 中 , 持 续 上 下 颠 倒 用 力 混 合 至 少 1 min,12000 r/min 4 离 心 10min, 小 心 取 上 层 水 相 ( 约 700 L) 置 于 新 的 1.5 mL 离 心 管 中 。6.1.3 加入 700 L 氯 仿 -异 戊 醇 ( 24:1) , 用 力 混 合 至 少 30 s, 12000 r/min 4 离 心 5 mi

    11、n, 小 心 取 上层 水 相 ( 约 600 L)置于新的 1.5 mL 离 心 管 中 。6.1.4 加 入 -20 预 冷 的 1.5 倍 体 积 无 水 乙 醇 ( 约 900 L) , 倒 转 数 次 混 匀 后 , 置 -20 沉 淀 1 h 以 上 。6.1.5 12000 r/min 4 离 心 30 min, 小 心 去 上 清 , 倒 置 于 吸 水 纸 上 吸 干 水 分 ; 室 温 干 燥 或 真 空 干 燥 。6.1.6 加 10 L 双 蒸 水 溶 解 , 作 为 DNA 模 板 。DNA 抽 提 也 可 选 用 商 品 化 病 毒 DNA 抽 提 试 剂 盒 ,

    12、按 相 应 说 明 书 提 供 的 方 法 予 以 抽 提 。6.2 基 因 扩 增6.2.1 按 表 加 入 除 了 Taq DNA 聚 合 酶 和 待 检 DNA 模 板 或 对 照 以 外 的 各 项 试 剂 , 配 成 无 酶 反 应 预 混 物 。PCR 反 应 体 系 表试剂 50L 体 系 100L 体 系 试剂终浓度10PCR 缓 冲 液 ( 无 Mg2+) 5 10 1MgCl2( 25mmol/L) 5 10 2.5mmol/LdNTP(10mmol/L) 1 2 0.2mmol/L100pmol/L 引 物 F1 0.5 1 1pmol/L100pmol/L 引 物 R1

    13、 0.5 1 1pmol/L灭 菌 双 蒸 水 32.75 65.5Taq DNA 聚 合 酶 ( 5U/L) 0.25 0.5 0.025U/L待 检 DNA 模 板 或 对 照 5 106.2.2 将 无 酶 反 应 预 混 物 按 44.75 L( 50 L 体 系 ) 或 89.5 L (100 L 体 系 )预 混 液 分 装 , 保 存 于 -20(最多 保存 六个 月) 。 在 临 用前 , 根 据所 需的 反应 份 数, 取出 无酶 反应 预混 物, 加入相 应体 积 的 Taq DNA4 DB32/T 2957-2016聚 合 酶 , 混 匀 , 即 成 完 全 反 应 预

    14、混 物 。6.2.3 将 完 全 反 应 预 混 物 按 1 份 /支 分 装 到 无 DNA 聚 合 酶 的 0.2mL PCR 待 检 管 、 阳 性 对 照 管 、 阴 性 对 照 管 、 空 白 对 照 管 中 , 分 别 在 待 检 管 、 阳 性 对 照 管 、 阴 性 对 照 管 、 空 白 对 照 管 中 加 入 相 应 体 积 的 样 品 待 检 DNA 模板、 阳性 对照 DNA、 阴 性对 照 DNA、 空白 对照 (5 0 L 体系加 5L, 100 L 体系加 10 L) 。 6.2.4 将上述 PCR 管 置于 PCR 扩 增仪 中 。 94 预 变 性 5 min

    15、; 95 变性 1 min、 55 退火 1 min、 72 延伸 1 min, 40 次 循 环 ; 72 延 伸 10 min; 4 保 温 。6.3 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳6.3.1 用 电 泳 缓 冲 液 TBE 配制 1.5% 的 琼 脂 糖 ( 加 入 相 应 量 的 核 酸 染 料 , 加 入 量 参 见 该 核 酸 染 料 说 明 书 ) 凝 胶 , 厚 0.5 cm 左 右 。6.3.2 将 平 板 放 入 水 平 电 泳 槽 , 电 泳 缓 冲 液 刚 好 淹 没 胶 面 。6.3.3 加 样 : 10 L 样 品 加 入 2 L 样 品 缓 冲 液 , 混 匀 后 加

    16、 入 样 品 孔 。6.3.4 电 泳 : 5V/cm 电 泳 约 30 min 停 止 。6.3.5 紫 外 灯 下 观 察 核 酸 带 , 并 记 录 结 果 。7 结 果 判 断7.1 PCR 产 物 经 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 后 , 当 阳 性 对 照 出 现 一 条 362 bp 的 DNA 条 带 , 阴 性 对 照 和 空 白 对 照 没 有 扩 增 条 带 , 待 检 样 品 出 现 一 条 与 阳 性 对 照 一 致 的 DNA 条 带 ( 同 样 为 362 bp) 则 判 定 为 鲤 疱 疹 病 毒 型 阳 性 。7.2 当 PCR 扩 增 产 物 经 琼 脂 糖

    17、凝 胶 电 泳 检 测 出 现 可 疑 条 带 时 , 应 将 待 检 样 品 的 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 检 测 条 带 回 收 后 进 一 步 进 行 DNA 测 序 。 将 所 测 序 列 与 已 知 的 鲤 疱 疹 病 毒 型 DNA 聚 合 酶 基 因 序 列 ( 参 考 附 录 B) 比 较 , 同 源 性 达 95% 以 上 判 定 为 鲤 疱 疹 病 毒 型 阳 性 。5 DB32/T 2957-2016附 录 A( 规 范 性 附 录 ) 试 剂 及 其 配 制A.1 CTAB溶 液按 2% CTAB、 1.4 mol/L NaCl、 20.0 mmol/L, EDTA、

    18、 20.0 mol/L Tris-HCl pH 7.5 配 制 。 用 前 加 巯 基 乙 醇 至 终 浓 度 为 0.25%( 配 制 时 在 60 ml 水 中 顺 序 加 入 : 8.19g NaCl, 0.744g EDTA, 1.21g Tris, 约 0.25-0.3mL 浓 HCl, 使 pH=7.5-8.0,再 加入 2g CTAB,完全 溶解 后加 水 至 100mL) 。A.2 酚 三 氯 甲 烷 异 戊 醇用 1.0 mol/L pH 7.90.2 Tris 过 饱 和 的 重 蒸 酚 、 三 氯 甲 烷 和 异 戊 醇 按 25:24:1 的 比 例 混 合 , 密 闭

    19、 避 光 保存。A.3 三 氯 甲 烷 异 戊 醇将 三 氯 甲 烷 和 异 戊 醇 按 24:1 的 比 例 混 合 , 密 闭 避 光 保 存 。A.4 TBE电 泳 缓 冲 液 ( 5浓 缩 液 )Tris 54.0 g硼酸 27.5 g乙 二 胺 四 乙 酸 2.922g加 水 到 1000.0 mL用 5.0 mol/L 的盐酸调至 pH 8.0。A.5 6DNA上 样 缓 冲 液溴 酚 蓝 100 mg, 加 双 蒸 水 5mL, 在 室 温 下 过 夜 。 待 溶 解 后 再 称 取 蔗 糖 25 g, 加 双 蒸 水 溶 解 后 移 入 溴 酚蓝 溶 液 中 , 摇 匀 后 定

    20、 容 至 50 mL。 加 入 氢 氧 化 钠 ( NaOH) 溶 液 1 滴 , 调 至 蓝 色 。6 DB32/T 2957-2016附 录 B( 资 料 性 附 录 )鲤 科 疱 疹 病 毒 型 DNA 聚 合 酶 基 因 参 考 序 列 ( GenBank 登 录 号 : AY939863.1)1 CCCAGCAACA TGTGCGACGG AGGCATCAGC CCAGAGTCCA TAGTGTCTAG GAGCGACCCG 61 TTCTGTCTCG AGTATGTCAG AAACTGCGTG CTGCTCGATT GGAAAAAGAT ACCGGCCGCC 121 AGTAACA

    21、TGG AAGAGATCAA GGAATACCCG CACAGCGAAG ACCTGTACAC GATCCTGTGC 181 TACAAGAACC GAGAGGTCGG TTGGACTCGG TTTGTGACCT ACACCGCTTC CAGTCTGGGC 241 CACTACCTCT CTATGAGATC TCAGTACAAG AAACGCATCA AGACCGAGAA AGACGCGAGT 301 CTCAAGGCGT ACTATGATCA GATGCAGGGT GAGATGAAAG TATGCGCCAA CTCTCACTAC 361 GGCGTGAGCC AGAGTCTCTG TCAGC

    22、ATCTG ACTACTTGGT CCGGACGCCA AAAGATTCTG 421 CTGGTCGAGA ACGCTGTAAA ACACACTCCG GGTATGACCG TCGTGTA 注 : 下 划 线 表 示 相 应 的 上 、 下 游 引 物 结 合 序 列7 DB32/T 2957-2016附 录 C( 资 料 性 附 录 ) 鲤 疱 疹 病 毒 , 型 特 异 性 PCR 电 泳 图100bp 250bp500bp 750bp 1000bp2000bp1 2 3 4 5从 左 至 右 依 次 为 : 1: DNA Mark; 2: 阳 性 对 照 ; 3: 阴 性 对 照 ; 4: 空 白 对 照 ; 5: 阳 性 结 果 。

    展开阅读全文
    提示  道客多多所有资源均是用户自行上传分享,仅供网友学习交流,未经上传用户书面授权,请勿作他用。
    关于本文
    本文标题:DB32T2957-2016 鲤疱疹病毒Ⅱ型PCR检测方法.docx
    链接地址:https://www.docduoduo.com/p-5259528.html
    关于我们 - 网站声明 - 网站地图 - 资源地图 - 友情链接 - 网站客服 - 联系我们

    道客多多用户QQ群:832276834  微博官方号:道客多多官方   知乎号:道客多多

    Copyright© 2025 道客多多 docduoduo.com 网站版权所有世界地图

    经营许可证编号:粤ICP备2021046453号    营业执照商标

    1.png 2.png 3.png 4.png 5.png 6.png 7.png 8.png 9.png 10.png



    收起
    展开