1、仪器分析,陕西省兽药监测所 朱育红,仪器分析,是指采用比较复杂或特殊的仪器设备，通过测量物质某些物理或物理化学性质的参数及其变化来获取物质的化学组成、成分含量及化学结构等信息的一类方法。,第 一 章,旋 光 度 测 定 法,1.1 概述 1,可见光 自然光,1.1 概述 2,可见光波通过方解石制成的尼科尔棱镜时，只有振动方向与尼科尔棱镜晶轴平行的光才能通过，这样振动方向都相同的光就称为偏振光。,1.1 概述 3,偏振光的振动方向与光的传播方向所成的面称为振动面。与偏振光振动方向垂直的面称为偏振面,偏振光、偏振面,1.1 概述 4,含有不对称碳原子的固体物质的溶液和液体物质等都具有使偏振光的振动
2、方向发生旋转的性质（即旋光性），这种物质就叫做旋光性物质，例如葡萄糖、蔗糖等。,1.1 概述 5,通过一个棱镜所生成的偏振光，再遇到第二个棱镜，只有当两个棱镜的轴平行时，偏振光才能通过这个棱镜，否则就被挡住不能前进。,1.1 概述 6,如果在两个晶轴平行的尼科尔棱镜之间放入旋光性物质的溶液，偏振光几乎全部不能通过第二个棱镜（图3）。如果把其中一个尼科尔棱镜旋转一个角度，偏振光又能通过。 直线偏振光通过旋光性物质液体或溶液时，振动方向发生旋转的现象称为旋光现象。,1.1 概述 7,不同的旋光物质，引起的旋光现象不同。旋转的角度大小和旋转的方向与物质的结构以及物质的浓度有关。通常能使偏振面向右呈现
3、顺时针转动的称为右旋，反之称为左旋。旋转的角度称为旋光度。,1.1 概述 8,物质的旋光能力用比旋度表示。偏振光透过长 1dm并每lml中含有旋光性物质 1g的溶液，在一定波长与温度下测得的旋光度称为比旋度。比旋度,以表示。对于同一种物质，溶液的浓度和厚度与旋光度呈线性关系。测定比旋度(或旋光度)可以区别或检查某些药品的纯杂程度，亦可用以测定含量。,1.1 概述 9,除另有规定外，本法系用钠光谱的D线(589.3nm)测定旋光度，测定管长度为ldm(如使用其他管长，应进行换算)，测定温度为2O，使用读数至0.01，并经过检定的旋光仪。,1.2 旋光度测定的基本原理,当单色的钠光通过偏光棱镜1（
4、称起偏镜），产生偏振光后向前进行。在通过装有被测物质的玻璃管2时，如果物质没有旋光性，偏振光就通过玻璃管，不致改变它的偏振面，会无阻地通过分析棱镜3（检偏镜）。在观察镜里会看到明亮的视野。如果玻璃管里装的是旋光性物质，当偏振光通过时，偏振面就会向左或向右旋转一个角度，从玻璃管出来的偏振光就不能通过分析棱镜了。这时，在观察镜里就看不到明亮的视野了。,1.2 旋光度测定的基本原理,为了使旋转了一定角度的偏振光能通过分析棱镜，就必须把这个棱镜也旋转到相当的角度，这样偏振光才能完全通过，观察镜里又能看到均匀明亮的视野。,1.2 旋光度测定的基本原理,1.2 旋光度测定的基本原理,最早的圆盘旋光仪，就是
5、由钠光灯光源、起偏镜、检偏镜、测试管、半影板调零装置和支架六部分组成。,1.3 旋光仪的使用,旋光仪 又称旋光计，是较早出现的商品分析仪器。六十年代前我们使用的仪器大都是国外的圆盘旋光仪，规格为0.05或0.01。其后，我国上海等地仪器厂也生产一些圆盘旋光仪，但精度不高。七十年代后国外由于自动指示旋光仪的出现，圆盘旋光仪逐渐被淘汰，同时在我国也相继出现了不同型号的自动指示旋光仪。八十年代数显式自动指示旋光仪和投影式自动指示旋光仪相继出现。仪器的读数精度也有了很大提高，由原来的0.05提高到0.02、0.01和0.005。有些国外旋光仪尚可选用不同波长的光，读数可达0.001。中国兽药典规定使用
6、读数至0.01并经过检定的旋光计。,1.3.1 操 作 步 骤,接通电源，如使用的交流电压变化较大，可通过1kV电子稳压器使电压达到规定电压值，开启“电源”开关，预热5分钟。 开启“光源”开关；开启“测量”开关，数码管将出现数字，按“清零”钮。 除另有规定外，选用长度为1dm的测定管。 将空白溶液管置光路中，如有数值，按“清零”钮，使数码管显示零；重复3次。,1.3.1 操 作 步 骤,将测定管用供试液冲洗后缓缓加入供试液，勿使产生气泡，置光路中，数码管显示所测的旋光值，等到表示测数稳定的位于符号管上方的红点亮后再读取读数，读数读至0.01。 按下“复测”钮，取几次(通常3次）测量的平均值作为
7、测量结果。 使用完毕后依次关闭“测量”、“光源”和“电源”按钮，最后切断电源，并将测定管立即用水冲洗，晾干。,1.3.2 注 意 事 项,未接通电源前检查样品室内应无异物，电源开关和示数开关应放在关的位置，为了便于钠光灯起辉，应将钠光灯置于交流电路处。钠光灯起辉后，不许再搬动仪器，以免损坏钠光灯。 如使用的交流电压变化较大，可通过电子稳压器使电压达到规定电压值，便于钠灯的起辉。 如测定对温度有严格要求的供试品，在测定前应将仪器及供试品置规定温度的恒温室内至少2小时，使温度恒定。,1.3.2 注 意 事 项, 每次测定前应用溶剂进行空白校正，测定后再校正一次，如零点有变动，则应重新测定旋光值；
8、配制溶液及测定时，均应调节温度至200.5（或各该药品项下规定的温度）； 供试液如显浑浊，或含有悬浮物，需预先过滤； 测定管、光学玻璃片和橡皮圈每次洗涤后，切不可置烘箱中干燥，以免变形，橡皮发粘；,1.3.2 注 意 事 项, 测定管两端的光学玻璃片，使用时必须特别小心；避免磕碰，并只能以擦镜纸揩拭，以免磨损； 钠光灯泡使用时间一般不得超过2小时，并不宜经常开关，开启后禁止震动； 每次使用完毕后，仪器各部应仔细检查，擦拭干净，填写使用记录。,1.4 旋 光 度 测 定 法 的 应 用,1、 比旋度的测定 各种物质的旋光度不但与该物质的化学结构有关，也和其他试验情况有关。例如，溶液的浓度越大、液
9、层越厚，则偏振面的旋转角度就越大。所以旋光度与浓度、液层的厚度成正比。通过测定旋光度，就可以计算出该物质的比旋度。,1.4 旋 光 度 测 定 法 的 应 用,1.4 旋 光 度 测 定 法 的 应 用,2.药品纯度的测定硫酸阿托品重莨菪碱的限量检查。硫酸阿托品是消旋体，如其中混有少量莨菪碱，就会测出左旋的旋光度。兽药典将硫酸阿托品按干燥品计算，配成1ml中含有50mg的溶液，置1dm的测定管中测定，旋光度不得超过-0.40。,1.4旋 光 度 测 定 法 的 应 用,3.溶液百分含量的测定 如已知某物质的比旋度，利用公式可推出c=100/l,即可求出该物质的百分浓度。 测定含量时，2份供试品
10、测定读数结果其相 差在0.02以内，否则应重做。,例 题,葡萄糖注射液的含量测定。标示量为250ml：12.5g，测定其旋光度为+2.338，+2.339（平行样 测定管长度为1dm），求其标示量的百分含量。 其百分含量C=2.0852/100，标示量的百分含量=C/标示量，得样1为97.50% 样2为97.54% 平均97.5%,第 二 章,分 光 光 度 法,2.1、 概述,分光光度法是通过测定被测物质在特定波长处或一定波长范围内的吸光度或发光强度，对该物质进行定性和定量分析的方法。,2.1、 概述,常用的波长范围为:(1)20040Onm的紫外光区;(2)400760nm的可见光区;(3
11、)2.525um(按波数计为4000400cm-1，)的红外光区。所用仪器为紫外分光光度计、可见分光光度计(或比色计)、红外分光光度计或原子吸收分光光度计。,2.1 概述,单色光通过一物质溶液时，透过光的强度I与入射光的强度Io之比称为透光率（T）即 I T=Io 透光率的负对数值称为吸光度（A） 1 也叫吸收度即 A=lg=- lgTT,2.1 概述,当溶液浓度不变时吸收度与溶液的液层的厚度(光路长度)成正比（郎伯定律） 当溶液的液层厚度不变时吸收度与溶液的浓度成正比（比耳定律） 吸收度（A）与溶液的浓度(c)和光路长度（L）是成正比的即郎伯比耳定律。,2.1、 概述,郎伯比耳定律:1 A=
12、lg =ECLT,2.1 概述,A 为吸光度 T 为透光率 E 为吸收系数，采用的表示方法是E1cm1%，其物理意义为当溶液浓度为1% (g/ml)、液层厚度为lcm时的吸光度数值; C 为l00ml溶液中所含被测物质的重量(按干燥品或无水物计算)，g L 为液层厚度，cm。,2.1 概述,物质对光的选择性吸收波长，以及相应的吸收系数是该物质的物理常数。当已知某纯物质在一定条件下的吸收系数后，可用同样条件将该供试品配成溶液，测定其吸光度，即可由上式计算出供试品中该物质的含量。,2.1 概述,在可见光区，除某些物质对光有吸收外，很多物质本身并没有吸收，但可在一定条件下加入显色试剂或经过处理便其显
13、色后再测定，故又称比色分析。,第二节,紫外-可见光分光光度法,2.2.1 紫外-可见光分光光度计,主要部件 1）光源 钨等（白炽灯）350nm，可见光区氢灯或氘灯150-400nm，紫外光区 2）单色器 由三部分组成：色散元件（包括棱镜、光栅）、准直镜和狭缝。它的主要作用是将来自光源的连续光谱中按波长顺序色散并从中分离出一定宽度的谱带。,2.2.1 紫外-可见光分光光度计,3）吸收池 有两种一种是用普通光学玻璃制成的吸收池，只能用于可见光区；另一种是石英玻璃吸收池用于紫外光区，也可用于可见光区。用于盛空白溶液的吸收池和用于盛试样溶液的吸收池应相互匹配，即要有相同的厚度和相同的透光率。 4）检测
14、器 检测器是将接收到的辐射功率变成电流的转换器。 5）讯号处理与显示器 显示方式一般都有透光率与吸光度，有的还可换算成浓度、吸收系数等。,2.2.2 紫外-可见光分光光度计,光学性能 1） 波长范围 仪器能测量的波长范围是195820nm。 2）波长准确度 仪器显示的波常数值与单色光的实际波长数值之间的误差0.5nm。 3）重现性 重复使用同一波长，单色光实际波长的变动值0.5nm。 4）准确度 满量程误差0.5%。,2.2.3 仪器的校正和检定,1）波长 由于环境因素对机械部分的影响，仪器的波长经常会略有变动，因此除应定期对所用的仪器进行全面校正检定外，还应于测定前校正测定波长。常用汞灯中的
15、较强谱线 237.83nm,253.65nm，275.28nm,296.73nm,313.16nm,334.15nm,365.02nm, 404.66nm,435.83nm,546.07nm与576.96nm，或用仪器中氘灯的486.02nm与656.1Onm谱线进行校正，钬玻璃在波长279.4nm，2.87.5nm，333.7nm，360.9nm，418.5nm，460.Onm，484.5nm,536.2nm与637.5nm处有尖锐吸收峰，也可作波长校正用，但因来源不同或随着时间的推移会有微小的变化，使用时应注意。,2.2.3 仪器的校正和检定,2） 吸光度的准确度 可用重铬酸钾的硫酸溶液检
16、定。取在l20干燥至恒重的基准重铬酸钾约60mg，精密称定，用0.005mol/L硫酸溶液溶解并稀释至1000ml，在规定的波长处测定并计算其吸收系数，并与规定的吸收系数比较，应符合表中的规定。（见兽药典附录）,2.2.3 仪器的校正和检定,3） 杂散光的检查 可按下表所列的试剂和浓度，配制成水溶液，置lcm石英吸收池中，在规定的波长处测定透光率，应符合表中的规定。 （见兽药典附录）,2.2.4 对 溶 剂 的 要 求,含有杂原子的有机溶剂，通常均具有很强的末端吸收。因此，当作溶剂使用时，它们的使用范围均不能小于截止使用波长。例如甲醇、乙醇的截止使用波长为205nm。另外，当溶剂不纯时，也可能
17、增加干扰吸收。因此，在测定供试品前，应先检查所用的溶剂在供试品所用的波长附近是否符合要求，即将溶剂置lcm石英吸收池中，以空气为空白(即空白光路中不置任何物质)测定其吸光度。溶剂和吸收池的吸光度，在220240nm范围内不得超过0.40，在241250nm范围内不得超过0.20，在251300nm范围内不得超过0.10，在300nm以上时不得超过0.05。,第三节,紫外-可见光分光光度计的应用,2.3.1紫外-可见光分光光度计的应用,定性鉴别 多数有机化合物具有吸收光谱特征，如，吸收光谱的形状、吸收峰的数目、各吸收峰的波长位置、强度和相应的吸收系数等。结构完全相同的化合物应有完全相同的吸收光谱
18、，但吸收光谱完全相同的化合物却不一定是同一种化合物。,定性鉴别,鉴别有三种方法，一是与对照品的吸收图谱比较；二是与标准图谱比较，这种方法很少用；三是测吸收系数。,2.3.2紫外-可见光分光光度计的应用,纯度检查 （1）杂质检查（三种情况） 如果化合物在紫外-可见光区无明显吸收，而所含杂质有较强吸收，那么，含有少量杂质就可用吸收光谱测出来。,2.3.2紫外-可见光分光光度计的应用,如果化合物在紫外-可见光区有较强吸收，而所含杂质无吸收或吸收很弱，那么，存在的杂质就会使化合物的吸收系数降低。 如果杂质在化合物吸收峰处有比化合物更强的吸收，会使化合物的吸收系数增大。有的杂质也会使吸收光谱变形。,2.
19、3.2紫外-可见光分光光度计的应用,（2）杂质的限量检测 药物中的杂质，常有一个允许存在的限量。如肾上腺素在其合成的过程中有一中间体肾上腺酮当他还原成肾上腺素不够完全时，带入产品中，成为杂质。在310nm，肾上腺素无吸收，而肾上腺酮有吸收。 我们检查酮体时，用0.05M的HCl将肾上腺素成品制成1ml中含2.0mg的溶液，测其吸光度A,不得过0.05。若以肾上腺酮的吸收系数435计算，相当于含肾上腺酮不得超过0.06%。,2.3.3紫外-可见光分光光度计的应用,含 量 测 定 (1)对照品比较法 用相同的溶剂将供试品和对照品配制成供试品溶液和对照品溶液，对照品溶液中所含被测成分的量应为供试品溶
20、液中被测成分规定量的100%士10%，在规定的波长处测定供试品溶液和对照品溶液的吸光度。,2.3.3紫外-可见光分光光度计的应用,(2)吸收系数法 依据郎伯比耳定律 A=ECL 若E、L已知，则可根据测得的A测出被测物质的浓度。用本法测定时，吸收系数通常应大于100，并注意仪器的校正和检定。,检 测 实 例 1,对照品比较法 甲磺酸培氟沙星可溶性粉的含量测定 已知：标示量50g：2g， 对照品的标示含量99.6% 操作步骤：取本品，精密称定0.3155、0.3026，（平行样）置50ml量瓶中，加盐酸液（0.1mol/L）适量振摇使溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取2ml，置100ml量瓶中，用
21、盐酸液（0.1mol/L）稀释至刻度，摇匀，测定吸收度为0.5515、0.5327,检 测 实 例 1,另取在105干燥至恒重的对照品0.05031g置200ml的量瓶中，加盐酸液（0.1mol/L）适量振摇使溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取2ml，置100ml量瓶中，用盐酸液（0.1mol/L）稀释至刻度，摇匀，测定吸收度为0.5522,检 测 实 例 1,依据公式CX=(AX/Ar)Cr推出 AxMr99.6%50 标示量的百分含量%=100%ArMx2/50200,检 测 实 例 2,吸收系数法 维生素B12注射液的含量测定 已知：标示量1ml：0.1g，E1%1cm为207 操作步骤：
22、精密量取样品5ml（2份，平行样），置1000ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀；精密量取5ml，置100ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，测定吸收度为0.5115、0.5113,检 测 实 例 2,计算：依据公式A=ECL推出 A稀释倍数 标示量的百分含量%=100% E取样量标示量,检 测 实 例 2,将测得数据代入公式0.51151000/5 样1标示量的百分含量%=100%=98.84%2075.000.10.51131000/5 样2标示量的百分含量%=100%=98.80%2075.000.1 平均：98.8% 相对偏差：0.02% 结果判定：符合规定（标准规定含维生素B12应为标示
23、量的90.0%110.0%）,第四节,注意事项,2.4 注意事项,1.空白溶液与供试品溶液必须澄清，不得有浑浊。如有浑浊，应预先过滤，并弃去初滤液。 2.测定时，除另有规定外，应以配制供试品溶液的同瓶溶剂为空白对照，采用1cm的石英吸收池。,2.4 注意事项,3.在规定的吸收峰波长2nm以内测试几个点的吸收度，以核对供试品的吸收峰波长位置是否正确，除另有规定外，吸收峰波长应在该品种项下规定的波长2nm以内；否则应考虑该试样的真伪、纯度以及仪器波长的准确度，并以吸收度最大的波长作为测定波长。,2.4 注意事项,4.一般供试品溶液的吸收度读数，以在0.30.7之间的误差较小。 5.吸收池应选择配对
24、，否则要引入测定误差。在规定波长下两个吸收池的透光率相差小于0.5的吸收池作配对，在必要的情况时，须在最终测量扣除吸收池间的误差修正值。,2.4 注意事项,6.由于吸收池和溶剂本身可能有空白吸收，因此测定供试品的吸收度后应减去空白读数，再计算含量。7.仪器的接地必须良好，一切裸露的零件对地电位不得超过24伏（测电笔的氖管不得发亮）。,2.4 注意事项,8.在使用过程中，如需开启试样室盖时或暂时停止测试时，必须及时推入光门钮杆（使光电管前光门关闭），保护光电管，以防止光电管受强光或长时间照射而损坏。,2.4 注意事项,9.在测定时或改测其它检品时，应用待测溶液冲洗吸收池34次，用干净绸布或擦镜纸
25、擦净吸收池的透光面至不留斑痕（切忌把透光面磨损）。,2.4 注意事项,10.取吸收池时，应拿毛玻璃两面，切忌用手拿捏透光面，以免粘上油污。使用完后及时用测定溶剂冲净，再用纯化水冲净，用干净绸布或擦镜纸擦干，晾干后，放入吸收池盒中，防尘保存。,2.4 注意事项,11.若吸收池内外壁沾污，（1）可用绸布缠在扁竹条外或用脱脂棉缠在细玻璃棒上蘸上乙醇，轻轻摩擦，再用纯化水冲净。（2）如上述方法处理不好，必要时可用重铬酸钾-硫酸洗液泡洗12分钟，用自来水冲净，再用纯化水冲净。（3）不得用毛刷刷洗或硬物拭擦，以防止表面光洁度受损影响正常使用。,2.4 注意事项,12.请务必注意经常保持硅胶的干燥，目的是保
26、护光学元件和光电放大器系统不致受潮损坏而影响仪器的正常工作，如发现有的硅胶由蓝色变为粉红色，应立即更换。该仪器干燥剂筒有两个：一个是装在放大器暗盒上，另一个装在单色光器暗盒上。,2.4 注意事项,13.在更换硅胶干燥剂时，应关闭切断电源。 14.在停止工作期间，主机试样室内应放入袋装或筒装硅胶干燥剂。用防尘罩罩住整个仪器，并在防尘罩内放数袋防潮硅胶。,2.4 注意事项,15.仪器在操作中，狭缝的宽度应从小逐渐开大。若狭缝过大，由于进入光电管的光能量强度过大，将会使放大器输出信号达到饱和，以至数字显示出溢出（即数字闪烁或示1不变）。这不是仪器有故障。,2.4 注意事项,16.搬动仪器时应搬在主体
27、端，不要搬在试样室和光电管盒端以及光源灯室部位，以防止仪器狭缝或光路部件受力而发生变形。并在搬动或运输时，应将可动部分固定，如各旋钮可用胶布贴住，狭缝位置开大些，然后固定，不要关小狭缝，以免运输时振动使狭缝刀口受损坏。,2.4 注意事项,17.仪器的光栅、反射镜绝对不能擦拭，否则将损坏仪器光学表面，增加杂散光。 18.仪器经过搬动请及时检查并纠正波长精度，为保证测定的准确性请经常校准波长精度。如有异常，应立即报告质量保证部，但不得擅自调整，并及时做好记录。,第 三 章,高 效 液 相 色 谱 法,第一节,概 述,3.1.1 色谱法的原理,色谱法的原理是利用混合物中各组份在不同的两相中溶解，分配
28、，吸附等化学作用性能的差异，当两相做相对运动时，使各组份在两相中反复多次受到上述各作用力而达到相互分离。,3.1.1 色谱法的原理,相：物理化学术语，特指在某一系统中，具有相同成分及相同物理、化学性质的均匀物质部分。各相之间有明显可分的界面。,3.1.2 色谱法的分类,按流动相的物态分：气相色谱；液相色谱（包括柱色谱、纸色谱、薄层色谱、高效液相色谱） 按固定相的形态分：可分为平面色谱（包括纸色谱和薄层色谱）；柱色谱,3.1.2 色谱法的分类,按流动相和固定相的相对极性分：正相色谱；反相色谱 按分离过程的机理分：吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱、体积排除色谱,3.1.2 色谱法的分类,有机化合物
29、的极性 是分子间作用力（静电引力、偶极力、色散力，氢键力）综合表现的一种描述。 有机化合物的极性由极性 到非极性依次的顺序是：水 甲醇 异丙醇 乙腈 乙酸乙酯 二氯甲烷 三氯甲烷 己烷,第二节,高效液相色谱法,3.2 高效液相色谱法,以液体为流动相的色谱法称为液相色谱法。高效液相色谱法(high performance liquid chromatography；HPLC)是液相色谱法的一种，也叫高速液相色谱法或高压液相色谱法。,3.2 高效液相色谱法,高效液相色谱法系采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱进行分离测定的色谱方法。 注入的供试品，由流动相带入柱内，各成分在柱内被分离
30、，并依次进入检测器，由记录仪、积分仪或数据处理系统记录色谱信号。,液相色谱仪示意图,3.2.1 对仪器的一般要求,仪器应定期检定并符合有关规定。 色谱柱 ：最常用的色谱柱填充剂为化学键合硅胶。 以硅胶为载体的一般键合固定相填充剂适用pH28的流动相。,3.2.1 对仪器的一般要求,检测器 ：最常用的检测器为紫外检测器 流动相 ：十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的反相色谱系统，流动相中有机溶剂的比例应不低于5%，否则将导致组分保留值变化，造成色谱系统不稳定。,3.2.2 系统适用性试验,色谱柱的理论板数(n) ：n=5.54(tR / Wh/2)2,3.2.2 系统适用性试验,分离度(R) 2（tR
31、2-tR1）R=- W1W2,3.2.2 系统适用性试验,重复性 拖尾因子(T) W0.05h T=2d1,3.2.3 测 定 法,(1)内标法 加校正因子测定供试品中某个杂质或主成分含量 按各品种项下的规定，精密量取对照品和内标物质，分别配成溶液，精密量取各溶液，配成校正因子测定用的对照溶液。取一定量注人仪器，记录色谱图。测量对照品和内标物质的峰面积或峰高，按下式计算校正因子As/Cs 校正因子(f)=AR/CR,3.2.3 测 定 法,式中 As为内标物质的峰面积或峰高；AR为对照品的峰面积或峰高；Cs为内标物质的浓度；CR为对照品的浓度。 再取各品种项下含有内标物质的供试品溶液注人仪器，
32、记录色谱图。测量供试品中待测成分（或其它杂质）和内标物质的峰面积或峰高，按下式计算含量:,3.2.3 测 定 法,Ax 含量（Cx）=fAs/Cs Ax为供试品(或其杂质)峰面积或峰高; Cx为供试品(或其杂质)的浓度; As为内标物质的峰面积或峰高; Cs为内标物质的浓度; f为校正因子。,3.2.3 测 定 法,当配制校正因子测定用的对照溶液和含有内标物质的供试品溶液，使用等量同一浓度的内标物质溶液时，Cs= Cs，则配制内标物质溶液不必精密称(量)取。,3.2.3 测 定 法,(2)、外标法 测定供试品中某个杂质或主成分含量 按各品种项下的规定，精密称(量)取对照品和供试品，配制成溶液，
33、分别精密取一定量，注人仪器，记录色谱图，测量对照品溶液和供试品溶液中待测成分的峰面积(或峰高)，按下式计算含量:Ax 含量(Cx)= CRAR 式中各符号意义同上。,3.2.3 测 定 法,（3）、加校正因子的主成分自身对照法 测定杂质含量时，可采用加校正因子的主成分自身对照法。在建立方法时，按各品种项下的规定，精密称(量)取杂质对照品和待测成分对照品适量，配制测定杂质校正因子的溶液，进样，记录色谱图，按上述(1)法计算杂质的校正因子。此校正因子可直接载入各品种项下，用于校正杂质的实测峰面积。这些需作校正计算的杂质，通常以主成分为参照，采用相对保留时间定位，其数值一并载入各品种项下。,3.2.
34、3 测 定 法,测定杂质含量时，按各品种项下规定的杂质限度，将供试品溶液稀释成与杂质限度相当的溶液作为对照溶液，进样，调节检测灵敏度(以噪音水平可接受为限)或进样量(以柱子不过载为限)，使对照溶液的主成分色谱峰的峰高达满量程的10%25%或其峰面积能准确积分。通常含量低于0.5%的杂质，峰面积的相对标准偏差(RSD)应小于10%；含量在0.52%的杂质，峰面积的RSD应小于5%；含量大于2%的杂质，峰面积的RSD应小于2%,3.2.3 测 定 法,然后，取供试品溶液和对照品溶液适量，分别进样，供试品溶液的记录时间，除另有规定外，应为主成分色谱峰保留时间的2倍，测量供试品溶液色谱图上各杂质的峰面
35、积，分别乘以相应的校正因子后与对照溶液主成分的峰面积比较，依法计算各杂质含量。,3.2.3 测 定 法,（4）、不加校正因子的主成分自身对照法 在没有杂质对照品时，也可采用不加校正因子的主成分自身对照法。同上述(3)法配制对照溶液并调节检测灵敏度后，取供试品溶液和对照溶液适量，分别进样，前者的记录时间，除另有规定外，应为主成分色谱峰保留时间的2倍，测量供试品溶液色谱图上各杂质的峰面积并与对照溶液主成分的峰面积比较，计算各杂质含量。,3.2.3 测 定 法,若供试品所含的部分杂质未与溶剂峰完全分离，则按规定先记录供试品溶液的色谱图1，再记录等体积纯溶剂的色谱图2。色谱图1上杂质峰的总面积(包括溶
36、剂峰)，减去色谱图2上的溶剂峰面积，即为总杂质峰的校正面积，然后依法计算。,3.2.3 测 定 法,（5）、面积归一化法 由于峰面积归一化法测定误差大，因此，本法通常只能用于粗略考察供试品中的杂质含量。除另有规定外，一般不宜用于微量杂质的检查。方法是测量各杂质峰的面积和色谱图上除溶剂峰以外的总色谱峰面积，计算各峰面积及其之和占总峰面积的百分率。,第三节,高效液相色谱仪的操作及维护,3.3.1 高效液相色谱仪的操作,1、仪器的启动： 先打开电源，然后打开泵，注意，在打开泵以前先检查试剂瓶里试剂是否够用，加够足够的试剂并将水全部换成新的。,3.3.1 高效液相色谱仪的操作,泵自检通过后排气。排气采
37、用大流速操作。有两种方法，一是干抽（Dry Prime）,二是湿抽（Wet Prime），通常，在新仪器、长时间不用或者有大气泡进去的时候，用干抽，其他用湿抽。一般情况下，我们都是干抽一次，再湿抽一次，这样就保证了气体的排出。 打开检测器，自检通过后， 打开计算机，启动色谱管理软件。,3.3.1 高效液相色谱仪的操作,2、编制方法组 仪器方法 处理方法 报告方法 输出方法,3.3.1 高效液相色谱仪的操作,仪器方法的编制主要是三项内容， 一是检测器的波长； 二是流动相的比例。一般情况下，流动相的组成是不能改变的。特殊情况，也是个别的，可以稍加改动。没有经验，最好不要改，以免影响结果。流动相的比
38、例可以根据具体情况进行适当调节，以使实验效果达到理想； 三是柱温。一般情况下，柱温越高，保留时间就越短。有时，出峰时间太长，在不影响分离度的情况下，我们可采取提高柱温的方法缩短出峰时间，有时两个峰分不开我们则可采取降低柱温的方法使其分开 其余可采用默认值。,3.3.1 高效液相色谱仪的操作,处理方法的编制可采用处理方法的编制向导操作。一般情况下，阈值可使用默认值，但特殊情况下，默认值则需改变，以适应试验需求，这就要增大或减小阈值直到合适为止。积分时要选择一个合适的最小面积或最小峰高，以排除特别小的杂峰，当然也要选择适当的积分时间等满做实验需求。,3.3.1高效液相色谱仪的操作,3、运行样品（采
39、集数据） 4、处理数据 5、打印结果 6、清洗色谱柱（后面专门讲色谱柱的清洗） 7、关机,3.3.2 高效液相色谱仪的维护,1.液相色谱对流动相的要求： （1）过滤除去微粒； （2）纯度要求：水要用超纯水，有机溶剂要用色谱纯。 （3）缓冲液的pH值一般在2-8内。 （4）缓冲液的浓度不要太高（100mM） （5）样品最好用流动相溶解。,3.3.2 高效液相色谱仪的维护,（6）、流动相要脱气：、流动相脱气的目的：一是使色谱泵的输液准确；二是提高检测的性能；三是保护色谱柱。、流动相脱气的方法：常用的有超声波震荡和在线脱气机。超声波脱气时注意时间不要太长一般1分钟左右即可。,3.3.2 高效液相色谱
40、仪的维护,（7）流动相的保存：有机溶剂流动相：室温下密闭，避光保存。缓冲盐流动相：当日现配现用，也可低温下密封保存，当一般不超过3天。防止微生物生长。有机溶剂与水（缓冲盐）混配的流动相：低温密封保存，防止有机溶剂的挥发。,3.3.2 高效液相色谱仪的维护,2.色谱柱的清洗：反相色谱柱清洗一般程序见下表。用水冲的时间不宜过长，一般3040分钟。,3.3.2 高效液相色谱仪的维护,3、色谱柱的存放 一般反相色谱柱保存在纯甲醇或纯乙腈中。,3.3.2 高效液相色谱仪的维护,4、在线过滤器和预柱的清洗：取下来，放在甲醇（色谱纯）中，超声清洗。 5、检测器的灯样品运行完毕要及时关闭，以延长其使用寿命。
41、6、进样前溶液必须经微孔滤膜滤过。,3.4 注意事项,1.虽然泵能耐压6000PSI的压力，但不要使泵处于4000PSI以上的压力为宜。 2.安装及拆卸色谱柱时应注意柱的连接方向，千万不能接反。否则可能导致柱效降低，甚至损坏色谱柱。 3.严禁开空泵。在无流动相通过时不要扳动进样阀的操作杆，使用时要注意尽可能少扳动，以免磨损内部的密封垫圈。（指手动进样）,3.4 注意事项,4.为了延长检测器灯源的使用寿命，在色谱泵稳定后再打开检测器电源开关，分析结束后立即关闭检测器。 5.应使用高纯度、高质量的溶剂和试剂。 6.避免pH值超限，pH值应控制在2.27.5之间。pH值偏低或偏高都会腐蚀液相系统的不
42、锈钢材料；破坏色谱柱填料的结构，使填料失活。,3.4 注意事项,7.色谱柱温不能超过规定要求，柱温过高会加速色谱柱填料老化，破坏其结构。 8.使用所有溶剂必须是互溶的。这对于缓冲流动相来说是非常重要的，盐类的析出会很快损坏要维护的部件。 9.流动相首选甲醇-水系统，如经试用不适合时，再选用其他溶剂。为保护仪器，应尽可能少用含有缓冲液的流动相。如果流动相中含有缓冲剂，每日使用后应用不含缓冲剂的流动相或新鲜纯化水将仪器管路、泵、进样阀、色谱柱及检测池等充分冲洗干净。,3.4 注意事项,10.如果液相系统使用未过滤的洗脱液、注入未过滤的样品、系统中滞留缓冲洗脱液都能堵塞系统或划伤泵柱塞。所以流动相、
43、样品使用前必须用0.45m微孔滤膜过滤；流动相并先经脱气处理后使用。停泵后决不允许缓冲洗脱液滞留在系统中，须用经过滤后的新鲜纯化水进行清洗，并保证将缓冲剂冲洗干净。,3.4 注意事项,11.如果泵闭置在2天以上，应将甲醇注满液相系统，以避免水溶剂系统中可能存在微生物的繁殖。 12.色谱柱保存时应使填充剂处在润湿状态，两端密塞。反相柱（如十八烷基硅烷键合硅胶柱）可在甲醇中保存；正相柱（如硅胶柱）可在正己烷中保存等。,3.4 注意事项,13.绝不能使用盐酸溶液。一般来说，任何浓度的卤化物都会腐蚀未经钝化的不锈钢材料。 14.尽量避免使用在电化学过程中引起腐蚀的金属离子。应避免的典型金属离子有锰、铬
44、、锌、铜、镍、钼、铁。,第四章,pH值 测 定 法,第一节 原理,原理 pHS-2型酸度计是用玻璃电极作为测量电极，甘汞电极作为参考电极，当氢离子浓度发生变化时，玻璃电极和甘汞电极之间的电动势也随着引起变化，而电势变化符合能斯特方程式：RTE=Eo-2.3026pHF,4.1 原理,式中 E产生的电极电位 T绝对温度Eo零电位 F法拉第常数R-气体常数 pH表示被测溶液pH值和内溶液pH值的差值pHS-2型酸度计是利用玻璃电极和甘汞电极对被测溶液中不同酸度产生的直流电势，输入到一台用参量振荡深度负反馈的直流放大器，以达到pH值指示的目的。,4.1 原理,式中 E产生的电极电位 T绝对温度Eo零
45、电位 F法拉第常数R-气体常数 pH表示被测溶液pH值 和内溶液pH值的差值pHS-2型酸度计是利用玻璃电极和甘汞电极对被测溶液中不同酸度产生的直流电势，输入到一台用参量振荡深度负反馈的直流放大器，以达到pH值指示的目的。,第二节 pHS-3C酸度计的操作,1、插上电源，预热20分钟。2、将电极用纯化水清洗干净，并用吸水纸擦干。3、定位：将电极插入与待测溶液pH值相近的缓冲液中，定位。,4.2 pHS-3C酸度计的操作,4、校正：将电极用纯化水清洗干净，并用吸水纸擦干后再将电极插入与待测溶液pH值次相近的缓冲液中，校正。测得值与规定值之差应小于0.1。5、测量：将电极用纯化水清洗干净，并用吸水
46、纸擦干后再将电极插入待测溶液，待读数稳定后，读取测得值。重复试验，取其平均值为测定结果。,4.2 pHS-3C酸度计的操作,6、测量完毕，将电极用纯化水洗净，玻璃电极浸泡于纯化水中，甘汞电极塞上橡胶塞、套上橡胶帽。关机，拔掉电源。清理现场，填写使用记录。,第三节、注意事项,1.应注意玻璃电极装到电极夹中时应略高于甘汞电极，以免球膜与试杯相碰。 2.新使用或久放未用的玻璃电极在使用前应放在纯化水内浸泡活化48小时，平时也最好浸泡在水中，以便下次使用时能迅速地工作。,4.3 注意事项,3.将甘汞电极的颈端橡皮塞取下，检查饱和氯化钾溶液情况，溶液中应有氯化钾结晶析出，以确保溶液饱和，太少应予以添加。
47、使用前应把电极弯管下端橡皮套除去。,4.3 注意事项,4.按下电源按键，接通电源，按下pH按键，指示灯亮后，一般短时间测量，只需预热数分钟即可，但要保持仪表零点稳定，必须预热半小时或一小时以上。5.本仪器应置于干燥环境中，无显著振动和强电磁场干扰，并防止灰尘及腐蚀性气体侵入。,4.3 注意事项,6.每次使用，在校正及测定前后均应用纯化水将电极充分洗净。 7.测定前校正仪器时，应选择与待测溶液pH值接近的标准pH缓冲液，pH值相差不应超过3个单位。,4.3 注意事项,8.为了使测定结果可靠，在测定时用标准pH缓冲液校正仪器后，应再用另一种相差约3个单位pH的标准缓冲液复校之。9.待测溶液，校正液
48、与电极的温度应相同或相近，差异最好不超过2。,4.3 注意事项,10.仪器的电表应避免震动与打击，不用或移动时，将pH-mV分档开关置于“0”处，以减少摆动。 11.温度补偿器转动时勿用力过大，以防止移动紧固螺丝的位置，影响pH准确度。,4.3 注意事项,12.对于pH大于9的溶液的测定，应使用231型锂玻璃电极测定；使用有碱误的电极测定时，应校正碱误。 13.玻璃电极在测定碱性溶液时，应尽量快速，测定强碱溶液后，电极性能常不能立即复原，可在1mol/L盐酸溶液中浸泡，再使用纯化水冲洗，有时甚至需在酸液内浸泡几小时，才能复原。,4.3 注意事项,14.玻璃电极球泡很薄，因此在使用时勿与玻璃杯及硬物相碰，防止球泡破碎。 15.玻璃电极球泡勿接触污物，勿用手去摸电极球泡，以免玻璃膜沾上油脂，影响电极测量精度。如发现沾污可用医用棉花轻擦球泡部分，或用0.1mol/L稀盐酸清洗之，再用纯化水冲洗干净。,4.3 注意事项,16.玻璃电极插头必须防止沾上水，保证插头绝缘阻抗。 17.玻璃电极和甘汞电极在使用时，必须注意内电极与球泡之间及内电极和陶瓷芯之间是否有气泡停留，如有则必须排除。,
