1、ICS 67.050X04DB 45广 西 壮 族 自 治 区 地 方 标 准DB 45/T XXXXX2017陆川猪及其肉制品的分子定量鉴定方法Molecular quantitative identification method of Luchuan pig and its meat products（征求意见稿）2017 - XX - XX 发布 2017 - XX - XX 实施广 西 壮 族 自 治 区 质 量 技 术 监 督 局 发 布DB 45/T XXXXX2017I目 次前言 .II1 范围 .12 规范性引用文件 .13 术语和定义 .14 原理 .25 仪器与试剂 .2
2、6 鉴定步骤 .27 结果判定与表述 .38 实验室防污染措施 .4附录 A（资料性附录） 陆川猪特异性条带的核苷酸序列信息 .5附录 B（规范性附录） PCR 所用引物信息 .6附录 C（资料性附录） 样品 DNA 提取方法 .7DB 45/T XXXXX2017II前 言本标准按照GB/T 1.12009给出的规则起草。本标准由广西大学提出。本标准起草单位：广西大学、广西陆川县质量技术监督局、广西分析测试研究中心、广西经贸职业技术学院。本标准主要起草人：黄丽、黄磊、杨磊、黄岛平、庞理松、夏宁、林葵、韦保耀、滕建文、庞丽。DB 45/T XXXXX20171陆川猪及其肉制品的分子定量鉴定方法
3、1 范围本标准规定了陆川猪及其肉制品的分子定量鉴定的术语和定义、原理、仪器与试剂、鉴定步骤、结果判定与表述和实验室防污染措施的要求。本标准适用于广西壮族自治区境内陆川猪及其肉制品的分子定量鉴定。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验用水规格和试验方法GB/T 27403 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测3 术语和定义以下术语和定义适用于本文件。3.1 陆川猪 Luchuan pig因原产与广西东南部的陆川县而得名，现主要分布
4、于玉林、钦州、梧州等地，体型特点为体躯矮，短，肥，宽。头较短小，耳小而薄向外平伸，额有横行皱纹。3.2 实时荧光QPCR real-time quantitative PCR Ddetecting聚合酶链反应（聚合酶链反应）是一种在体外快速扩增特定基因或DNA片段的方法。由“热变性复性延伸”三步反应组成一个PCR循环，经过多次循环反应，使目标DNA得以大量扩增。3.3 Ct值 threshold value指每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数，每个模板的Ct值与该模板的起始目地基因数量的对数存在线性关系，即起始目地基因数量越多，Ct值越小。3.4 特异性引物 specific
5、 primer针对特定模板DNA片段设计的两段与模板两端分别互补的一对寡核苷酸序列，在PCR反应中与模板 DNA 两端分别特异性结合。DB 45/T XXXXX201724 原理提取样品中基因组DNA，利用陆川猪特异性引物b和SYBR染料进行实时荧光QPCR扩增检测，同时设置阴性对照及空白对照。根据扩增的Ct值，判定样品中是否含有陆川猪的特异性基因。陆川猪特异性片段序列信息见附录A。5 仪器与试剂5.1 主要仪器5.1.1 实时荧光 QPCR 仪。5.1.2 高速冷冻离心机。5.1.3 冷藏冷冻冰箱。5.1.4 漩涡振荡器。5.1.5 微量移液器（1 l、10 l、100 l、1 000 l）
6、。5.1.6 0.2 mL 光化学 QPCR 管。5.2 主要试剂5.2.1 除另有规定外，所有试剂均为分析纯或者生化试剂。5.2.2 实验用水：应符合 GB/T 6682 中一级水的规格。5.2.3 DNA 提取试剂盒（Genomic DNA Isolation Kit Instruction Manual）。5.2.4 2X SYBR QPCR Master Mix。5.2.5 一次性 PE 手套。5.2.6 1.5 mL 离心管。5.3 特异性引物根据陆川猪线粒体细胞色素b基因的核苷酸序列设计引物b，引物序列见附录B，使用前先对其进行预处理，使用小型离心机对引物进行2s左右离心，后加入说
7、明书上各引物的稀释所需体积的TE溶液，使引物浓度达到100 M，完成后将引物放入-20 冰箱中保存备用。6 鉴定步骤6.1 样品 DNA 提取依照通用型基因组DNA提取试剂盒（Genomic DNA Isolation Kit Instruction Manual）中动物组织基因组DNA提取操作进行提取，方法参见附录C。6.2 DNA 纯度的测定取5 LDNA溶液加灭菌水稀释至1mL，用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计分别检测260 nm和280 nm处的吸光值A260和A280。DNA的浓度按照式（1）计算：.(1)105NAc式中：c DNA 浓度，单位为微克每微升（g/l）；DB 45/T
8、 XXXXX20173A 260 nm处的吸光值；N 核酸稀释倍数。注：当 A260/A280比值在1.72.0之间时，适宜于PCR扩增。6.3 实时荧光 QPCR 反应体系符合表1的要求。配置时在每个QPCR管内按照表1从上至下的顺序依次加入试剂和模板，注意在加样时应使样品DNA模板溶液完全落入反应液中，不应粘附于管壁上，如若管壁上存在粘附残留，必须先进行离心使其全部落入管底，再将PCR管放入QPCR仪内准备扩增。表 1 QPCR 反应体系 试剂名称 剂 量引物（上游） 0.4 l引物（下游） 0.4 lDNA Buffer 2.0 l2SYBR qPCR Master Mix 10.0 l
9、DNA 模板 1.0 l补 ddH2O 至 20.0 l6.4 实时荧光 QPCR 反应程序设定好QPCR仪的扩增程序后，检查QPCR反应管是否摆放正确，开始运行仪器进行QPCR反应。QPCR反应结束后，可在程序QPCR仪的“数据获取”界面获得被测样品的Ct值。6.5 实验对照6.5.1 鉴定过程设阴性对照、空白对照。6.5.2 阴性对照：将地方土猪或地方黑猪或白条猪或其他非陆川猪按 6.1 提取 DNA，按 6.3 配置 QPCR反应体系，按 6.4 程序进行 QPCR 扩增；6.5.3 空白对照：以灭菌水代替 DNA 模板，按 6.3 配置 PCR 反应体系，按 6.4 程序进行 QPCR
10、 扩增。6.6 实时荧光 QPCR 反应运行设定好QPCR仪的扩增程序后，检查QPCR反应管是否摆放正确，盖紧反应管的盖子，开始运行仪器进行QPCR反应。QPCR反应结束后，可在程序QPCR仪的“数据获取”界面获得被测样品的Ct值。7 结果判定与表述7.1 质量控制以下条件有一条不满足时，结果视为无效：a) 空白对照：目标基因检测无荧光增幅现象。b) 阴性对照：目标基因检测无荧光增幅现象。7.2 结果判定按照以下方法进行判定：如 Ct 值20.0，则判定为被检样品阳性；DB 45/T XXXXX20174如 Ct 值30.0，则判定为被检样品阴性；如 20.0Ct 值30.0，则重复试验一次。
11、如再次扩增后 Ct 值为 20.0Ct 值25.0，则判定被检样品含二元猪源性成分者。如再次扩增后 Ct 值为 25.0Ct 值30.0，则判定被检样品含三元猪源性成分者。7.3 结果表述应按照以下要求表述：结果为阳性者，表述为“被检样品为纯种陆川猪”；结果为阴性者，表述为“被检样品为非陆川猪”；结果为含二元猪源性成分者，表述为“被检样品为二元陆川猪”；结果为含三元猪源性成分者，表述为“被检样品为三元陆川猪”。8 实验室防污染措施按照GB/T 27403的规定执行。DB 45/T XXXXX20175A A附 录 A（资料性附录）陆川猪特异性条带的核苷酸序列信息附录A给出了陆川猪特异性条带的核
12、苷酸序列信息。CAACCAAAACAAGCATTCCATTCGTATGCAAACCAAAACGCCAAGTACTTAATTACTATCTTTAAAACAAAAAAACCCATAAAAATTGCGCACAAACATACAAATATGCGACCCCAAAAATTTAACCATTAAAAACAAAAAATTTAATATATTATAGCCCTATGTACGTCGTGCATTAACTGCTAGTCCCCATGCATATAAGCATGTACATATTATTATTAATATTACATAGTACATATTATTATTGATCGTACATAGCACATATCATGTCAAATAACTCCAGTCAACATGCG
13、TATCACCACCATTAGATCACGAGCTTAATTACCATGCCGCGTGAAACCAGCAACCCGCTTGGCAGGGATCCCTCTTCTCGCTCCGGGCCCATAAATCGTGGGGGTTTCTATTGATGAACTTTAACAGGCATCTGGTTCTTACTTCAGGGCCATCTCATCTAAAATCGCCCACTCTTTCCCCTTAAATAAGACATCTCDB 45/T XXXXX20176B B附 录 B（规范性附录）PCR 所用引物信息表B.1给出了PCR所用引物信息。表 B.1 PCR 所用引物信息检测基因 引物序列5-CACTTACCGGAGCCCTATCA-3陆川猪线粒体细胞色素 b5-GGTGGTCAGCAACCTCCTAA-3
