2016-2017学年人教版选修3 基因工程的基本操作程序 第1课时 课件（45张）.pptx

1、专题1 基因工程,温故而知新,1、DNA重组技术的基本工具有哪些？ 2、限制酶的来源、作用、作用结果分别是什么？有何特点？ 3、DNA连接酶有几种？作用是什么？ 4、DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗？ 5、运载体的作用是什么？常用的运载体有哪些？ 6、运载体的条件有哪些？,基因工程基本操作的四个步骤,1、目的基因的获取,2、基因表达载体的构建,3、将目的基因导入受体细胞,4、目的基因的检测与鉴定,1.2 基因工程的基本操作程序,一、目的基因的获取,1、目的基因主要是指_,编码蛋白质的结构基因,2、获取目的基因的常用方法有哪些?,（1）从基因文库中获取,（2）利用PCR技术扩增,（3）人工合

2、成,请阅读P9,了解：目的基因、基因文库的概念,（1）从基因文库中获取目的基因,将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库,.基因文库,基因文库的本质是,含有某生物基因的菌体群,基因组文库的建立方法,提取某种生物的全部DNA,用适当的限制酶酶切,一定大小的DNA片段,将DNA片段与运载体连接,导入受体菌中储存,基因组文库,直接分离法(鸟枪法),基因组文库与部分基因文库的关系,怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因呢?,根据基因的有关信息：如基因的核苷酸序列、基因在染色体上的位置、基因转录的mRNA，以及基因表达的产物等。,受

3、体细胞,外源DNA扩增,产生特定性状,分离,目的基因,（2）cDNA文库的构建mRNA反转录形成,与载体连接 导入受体菌群,mRNA,逆转录酶,杂交双链,核酸酶H,单链DNA,DNA聚合酶,双链DNA (cDNA),该生物 cDNA文库,在细胞质中将mRNA分离并加入反转录酶,合成第二条DNA链,外显子,内含子,外显子,外显子,内含子,真核细胞的基因,在细胞核内转录,RNA,在核内内含子被切去，外显子彼此连接,在细胞质中将mRNA分离并加入反转录酶,合成第二条DNA链,基因的cDNA不含内含子,mRNA,原核细胞的基因,在细胞质内转录,基因组文库和cDNA文库的主要区别,小,大,无,有,无,有

4、,某种生物的部分基因,某种生物的全部基因,可以,部分基因可以,PCR技术聚合酶链式反应,原理：前提：条件：,PCR扩增仪,DNA双链复制的基本原理,一段已知目的基因的核苷酸序列,四种脱氧核苷酸(dNTP),一对引物一对寡核苷酸序列：与目的基因的起始段互补,热稳定DNA聚合酶(Taq酶）,DNA的两条链为模板,温度控制,（2）利用PCR技术扩增目的基因,变性,1.目的基因DNA受热变性，解链； 2.引物与单链互补结合； 3.合成链在DNA聚合酶作用下进行延伸。,（2）利用PCR技术扩增目的基因,过程：,a、DNA变性（90-95）：双链DNA模板在热作用下，_断裂，形成_,b、复性（55-60）

5、：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部_。,c、延伸（70-75）：在Taq酶的作用下，从引物的5端3端延伸，合成与模板互补的_。,氢键,单链DNA,双链,DNA链,PCR扩增为指数形式扩增2n(n为扩增循环的次数），在短时间内扩增大量目的基因。,根据已知的氨基酸序列合成DNA法 ：,根据已知蛋白质的氨基酸序列，推测出相应的信使RNA序列，然后按照碱基互补配对原则，推测出它的结构基因的核苷酸序列，再通过化学方法，以单核苷酸为原料合成目的基因。,蛋白质的氨基酸序列,mRNA的核苷酸序列,结构基因的核苷酸序列,推测,推测,目的基因,化学合成,（3）人工合成法,总结,目的基因的获取：三种方法

6、,(1)从基因文库中获取,适用于目的基因序列为未知的情况,(2)利用PCR技术扩增,适用于目的基因的序列为已知的情况,(3)人工合成,适用于目的基因不是很大且其序列是已知的,1.用一定的_切割质粒，使其出现一个切口，露出_。2.用_切断目的基因，使其产生_。,二、基因表达载体的构建, 核心,3.将切下的目的基因片段插入质粒的_处，再加入适量_，形成了一个重组DNA分子（重组质粒）,限制酶,黏性末端,同一种限制酶,相同的黏性末端,切口,DNA连接酶,质粒,DNA分子,限制酶处理,一个切口两个黏性末端,两个切口获得目的基因,DNA连接酶,重组DNA分子（重组质粒）,同一种,过程,二、基因表达载体的

7、构建, 核心,质粒,目的基因,限制酶,(1)目的：(2)组成：,使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。,它们各自的作用是什么?,目的基因+启动子+终止子+标记基因,二、基因表达载体的构建, 核心,三、将目的基因导入受体细胞,1.转化：,目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的工程,2.常见转化方法：,农杆菌转化法：双子叶植物和裸子植物。,（1）将目的基因导入植物细胞,基因枪法：单子叶植物。,花粉管通道法：双子叶植物。,显微注射法。,（2）将目的基因导入动物细胞,（3）将目的基因导入微生物细胞感受态细胞法。,特点:,农杆菌转化法：

8、,（1）将目的基因导入植物细胞,能感染双子叶植物和祼子植物,对单子叶植物没有感染能力,过程：,Ti质粒的TDNA可转移至受体细胞并整合到其染色体上,适用生物：,双子叶植物、祼子植物。,脱分化,组织培养,脱分化,导入植物细胞通过组织培养产生新个体,再分化,移植,个体生物学水平的鉴定,如虫吃后中毒死亡，则说明摄入了抗虫基因并得到表达,导入植物细胞,组织培养,花粉管通道法：,将目的基因导入植物细胞,操作方法：,特点：,在植物花受粉后，花粉形成花粉管还末愈合前期，剪去柱头，然后，滴入DNA（含的基因）使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞,十分简便经济,例：,转基因抗虫棉,基因枪法：,利用压缩气体产生的

9、动力 ，将包裹在金属粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法,操作方法：,金属粒：,将目的基因导入单子叶植物细胞,钨粉粒子和金粉粒子，粒子的直径一般在0.64um 。,适用：单子叶植物,细胞类型：,操作程序：,_显微注射法：,（2）将目的基因导入动物细胞,发育成新性状动物,移植到子宫或输卵管,培养成早期胚胎,显微注射,取受精卵,提纯含目的基因表达载体,受精卵,常用法：,常用菌：,微生物作受体细胞原因：,繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少,过程：,大肠杆菌,Ca2+处理获得感受态细胞,Ca2+处理 大肠杆菌,感受态细胞,表达载体 与感受态 细胞混合,感受态细胞吸收DN

10、A,_感受态细胞法：,（3）将目的基因导入微生物细胞,例：,四 目的基因的检测与鉴定检查是否成功,导入过程完成后，全部受体细胞都能摄入重组DNA分子吗？,真正能摄入重组DNA分子的受体细胞很少。,目的基因进入受体细胞后，是否都能稳定维持 和表达？,不一定，需要检测,1.检测方法：,分子杂交技术：,（1）DNA分子与DNA分子的之间杂交,（2）DNA分子与RNA分子的之间杂交,（3）蛋白质分子（抗原与抗体）之间杂交,2.个体生物学水平的鉴定：,抗虫、抗病结种实验，活性比较实验,1.检测,转基因生 物的DNA,探针,15N,15N,14N,14N,（1）检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了 目

11、的基因,基因探针：,放射性同位素等标记的DNA分子,方法,DNA分子杂交技术,变性,变性,变性,方法,DNA分子杂交技术,（2）检测目的基因是否转录出了mRNA,探针,15N,15N,转基因生物 的mRNA,14N,14N,提取,（3）检测目的基因是否翻译成蛋白质,方法抗原-抗体杂交,Bt毒素蛋白,将Bt毒蛋白注射小鼠体内,从小鼠血管抽出血液分离出抗Bt毒素的抗体,抗体,蛋白质,出现杂交带,脱分化,组织培养,证明：提取蛋白质与Bt毒素蛋白质一样,例：用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现中毒症状，说明未摄入目的基因或摄入目的基因未表达。如虫吃后中毒死亡，则说明摄入了抗虫基因并得到表达。,2.鉴定个体

12、生物学水平的鉴定,（1）多细胞个体,抗虫、抗病结种实验，活性比较实验,不能，受体细胞必须表现出特定的性状，才能说明目的基因完成了表达。,受体细胞摄入DNA分子后就说明目的基因完成了表达吗？,若不能表达，要对抗虫基因再进行修饰。,细菌的检测，将每个受体细胞单独培养形成菌落，检测菌落中是否有目的基因的表达产物。淘汰无表达产物的菌落，保留有表达产物的进一步培养、研究。,（2）单细胞生物,1、有关基因工程的叙述中，错误的是( )A、DNA连接酶将黏性末端的碱基对连接起来 B、限制性内切酶用于目的基因的获得C、目的基因须由运载体导入受体细胞D、人工合成目的基因不用限制性内切酶,A,课堂练习,2、下列属于

13、获取目的基因的方法的是( )利用mRNA反转录形成从基因组文库中提取从受体细胞中提取 利用PCR技术 利用DNA转录 人工合成A. B. C. D.,D,课堂练习,3、有关基因工程的叙述正确的是 （ ）A、限制酶只在获得目的基因时才用 B、重组质粒的形成在细胞内完成C、质粒都可作为运载体 D、蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料,D,4、基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的。在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是 （ ）A、人工合成目的基因 B、目的基因与运载体结合C、将目的基因导入受体细胞 D、目的基因的检测和表达,C,5、1997年，科学家将动物体内的能够合成胰岛素的基因

14、与大肠杆菌的DNA分子重组，并且在大肠杆菌中表达成功。请据右下图回答问题。 (1)此图表示的是采取_合成基因的方法获取_基因的过程。 (2) 图中DNA是以为_ _,人工,目的,控制胰岛素合 成的信使RNA,模板，形成单链DNA，在酶的作用下合成双链DNA，从而获得了所需要的目的基因。,(3) 图中代表 ， 它往往含 基因，以便对 目的基因的检测。,重组DNA分子,标记,1.基因的结构,（1）原核生物基因结构,编码区,非编码区,非编码区,编码区上游,编码区下游,编码蛋白质,调控遗传信息的表达,（调控程序）,AATGTGCACGTAGTTAGTTACACGTGCATCAATC,启动子,终止子,能

15、转录相应的信使RNA，能编码蛋白质,编码区:,非编码区:,有调控作用，含启动子、终止子等。,编码区是连续的,编码区,非编码区,非编码区,启动子,终止子,ATGTGCACGTAGTTA,TACACGTGCATCAAT,RNA聚合酶,AUGUGCACGUAGUUA,启动子：位于基因首端一段能与RNA聚合酶结合并能起始mRNA合成的序列。没有启动子，基因就不能转录。,RNA聚合酶:能够识别启动子上的结合位点并与其结合的一种蛋白质.,终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断，它能阻碍RNA聚合酶的移动，并使其从DNA模板链上脱离下来，使转录终止。,编码区,非编码区,非编码区,（能编码蛋白质）,启动子,终止子,外显子,内含子,编码蛋白质,（不能编码蛋白质）,编码区,非编码区,非编码序列：,包括非编码区和内含子,外显子：能编码蛋白质的序列 内含子：不能编码蛋白质的序列,（二）真核细胞的基因结构,原核细胞与真核细胞的基因结构比较,思考,编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞与真核细胞基因结构一样长吗？,连续,不连续,编码区,非编码,