1、分离以尿素为氮源的微生物,实验2,从自然界中分离微生物,自然环境中微生物的种类和数量要受到所处环境中有机物、氧、温度、水分、pH值、光线等各种因素的影响。 土壤中的微生物分布的数量：按种类递减，细菌(108个/g)放线菌(107个/g)霉菌(106个/g)酵母菌(105个/g)藻类(104个/g)原生动物(103个/g)。 土壤中的大量微生物已成为分离各种抗生素、生理活性物质、酶和氨基酸产生菌的主要来源。 目前全世界能分离培养的微生物还不到其总数的1%。,从土壤中采集微生物,土壤有机质含量和通气状况 有机质丰富的土壤如耕土,菜园土,近郊土壤,通气保水性能好,适合细菌,放线菌生长繁殖;森林土植被
2、多,枯叶多,有机质丰富,但阴暗潮湿,适合霉菌,酵母生长繁殖;沙土,无植被的山坡土等有机质含量少的,微生物含量少。 土层的纵剖面 采土样最好的土层是525cm。由于阳光照射，1-5cm的表层土的蒸发量较大、又由于紫外线具有杀菌作用，所以该土层的微生物数量较少；25cm以下的土层因土质紧密,空气、营养、水分缺乏,含菌量逐步减少。 土壤采样方法:采土样地点选好后,用小铲子去除5cm表土,取离地面5-15cm处的土样10-25克,盛于预先灭菌的牛皮纸袋中扎紧,并标明时间,地点和环境等情况,以备查考。,分离纯化,为了获得某一特定的微生物菌种，必须进行微生物的分离纯化，把最需要的菌株直接从样品中分离出来。
3、,好氧微生物的分离纯化,1、常规的分离方法：划线分离法、稀释涂布法,变色圈法：在平板中加入指示剂或显色剂，使所需微生物能被快速鉴别出来。产生有机酸或胺等碱性物质的微生物，通常采用pH值指示剂可检测出来。,2、平皿反应快速检出法：选用特异的检出方法和筛选方案，可显著提高菌株分离纯化的效率。,原理：根据微生物特殊的生理特性或利用某些代谢产物生化反应来设计特殊的分离培养基,通过观察微生物在选择性培养基上生长状况或生化反应如透明圈、变色圈、抑菌圈等进行分离。,细菌尿素 NH3中性 碱性酚红颜色： 黄色 紫红色,变色范围是pH6.4-8.2,细菌产生的脲酶向周围扩散，将培养基中的尿素分解，产生的氨使培养
4、基变碱，于是酚红由黄变红。随着培养时间的延长，红色区域的面积越来越大。,（一）制备培养基： 全培养基、 尿素培养基,（二）制备细菌悬液 制备成10-2、10-3、10-4、10-5土壤稀释液,实验组,对照组,倒平板,需要倒3个LB平板，9个尿素平板,每个稀释度 1个LB对照平板 3个尿素平板(平行重复组),（四）实验结果1,全培养基,尿素培养基,10-2,10-3,10-4,10-5,（四）实验结果2,全培养基,尿素培养基,10-2,10-3,10-4,恒温37培养,LB培养基上10-2、10-3、10-4 、10-5稀释度土样涂布结果,尿素培养基上10-2、10-3、10-4 、10-5稀释
5、度土样涂布结果,配制菌悬液,1个99ml无菌水 2个9ml无菌水,得10-2, 10-3, 10-4的菌悬液,1g土壤,稀释菌悬液 （使用1000L）,高浓度低浓度，换枪头,涂布分离,低浓度高浓度，可不用换枪头,涂布分离,涂布前后三角刮刀需要灼烧吗？,微量移液器的使用,第一档,第二档,严禁超越两端极限量程 使用结束后，将刻度调回最大量程,微量移液器的使用,练习题,1、选择培养基：在微生物学中，将允许 种类的微生物生长，同时 和 其他种类微生物生长的培养基，称作选择培养基。,阻止,特定,抑制,2、常用稀释涂布平板法来统计样品中活菌的数目。当样品的 足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀
6、释液中的一个 。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。为了保证结果准确，一般选择菌落数在 的平板进行计数。此外，测定微生物数量的常用方法还有 直接计数。,显微镜,稀释度,细菌,30-300,3、在同一稀释度下，至少对3个平板进行重复计数，然后求出 ，并根据平板所对应的稀释度计算出样品中细菌的数目。,平均数,4、用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数，在对应稀释倍数为106的培养基中得到以下几种统计结果，正确的是A涂布了一个平板，统计的菌落数是230B涂布了两个平板，统计的菌落数是215和260，取平均值238C涂布了三个平板，统计的菌落数分别是21、212和256，取平
7、均值163D涂布了三个平板，统计的菌落数分别是2l0、240和250，取平均值233,D,5.在做分离分解尿素的细菌实验时，A同学从对应106培养基上筛选出大约150个菌落，而其他同学只选择出大约50个菌落。A同学的结果产生原因可能有( )由于土样不同 由于培养基污染由于操作失误 没有设置对照A B C D,A,分解纤维素的微生物的分离与鉴定,二、实验原理土壤有“微生物的天然培养基”之称，土壤中含有大量的不同类型的微生物。可用选择培养基(利用微生物的特性,配制成适合于某种微生物生长,而限制其他微生物生长的培养基)选择一些特定的微生物进行分离培养，并能对特定的微生物类群进行数量测定。基本原理是通
8、过稀释使菌体细胞充分分散，单细胞得以生长发育形成菌落。可使用稀释涂布接种细菌，并可通过平板菌落计数，推算单位重量土壤样品含有某种菌的数量。,二、实验原理选择培养基选择一些特定的微生物进行分离培养，为了得到数量较多的特定的微生物，可以进行富集（增殖）培养。培养后的分解纤维素的微生物可以用刚果红染色法进行鉴别。刚果红是一种染料，它可以与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，但并不和水解后的纤维二糖和葡萄糖发生这种反应。当纤维素被纤维素酶分解后，刚果红纤维素的复合物就无法形成，培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈。,二、实验原理 微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落，通常是由一个细胞繁殖而成
9、的集合体。因此可通过挑取单菌落而获得一种纯培养。在特定环境中只让 1种来自同一祖先的微生物群体生存的技术叫做纯化。(获得单菌落） 分离纯化的方法：稀释涂布平板或平板划线等将微生物的培养物或含有微生物的样品移植到培养基上的操作技术称之为接种。接种是微生物实验及科学研究中的一项最基本的操作技术。无论微生物的分离、培养、纯化或鉴定以及有关微生物的形态观察及生理研究都必须进行接种。接种的关键是要严格的进行无菌操作，如操作不慎引起污染，则实验结果就不可用。,四、实验步骤1、流程 制备培养基 灭菌 倒平板划线 称土样梯度稀释菌液 涂布,培养观察、计数、鉴别。,4.1.2 探究纤维素分解菌的种类,实验3 观察土壤中能水解纤维素的微生物,实验结果,1号,2号,色素斑,1号培养皿经高压灭菌后，培养一段时间：纸仍为白色且没有色斑。,2号培养皿未经高压灭菌，培养一段时间：纸上有红色、黑色色斑，如果继续培养，会发现纸张局部变薄。,实验结果,
