1、1,注射制剂无菌保证 工艺技术要求的探讨,注射剂2008新法规解析及应对方案系列培训班,2,注射制剂无菌保证工艺技术要求,一、前言二、注射剂基本技术的要求三、无菌保证工艺研究与验证要求 四、无菌药品生产关键工艺的法规要求(以最终湿热灭菌药品工艺为例),3,一、前 言,4,1970年1975年，美国因输液污染所导致的并发败血症事件有400多起，这在美国国内引起强烈的反响。FDA从1975年开始进行了深入、广泛的调查，发现这些事件并不是出于企业违规生产，而是整个生产体系中的不稳定因素所致。 此后，FDA于1976年首次将验证列入GMP。承认在无保证系统中，过程控制优于结果检验。,5,30多年过去了
2、，注射剂染菌所致的药难事件降临我国，“欣弗”事件使得无菌制剂的无菌保障问题成为公众关注的焦点。-无菌检查的局限性-研究无菌保证的途径,6,面临的主要问题 剂型选择不合理 无菌保证工艺选择不合理 无菌保证工艺研究不全面 无菌保证工艺缺乏必要的验证 GMP与发达国家要求还存在差距,7,整顿和规范药品研制、生产、流通秩序工作方案（国食药监办2006465号）要求:严格审评审批化学药品注射剂、中药注射剂和多组分生化注射剂等安全性风险较大的3类品种。,8,二、注射剂基本技术的要求,9,审评审批要求: 一、国家局已受理但尚未批准注册的化学药品注射剂和多组分生化药注射剂应参照技术要求进行研究。 二、已经批准
3、注册的化学药品注射剂和多组分生化药注射剂也应参照技术要求进行相关研究，并在申报再注册时提供相关研究资料。 三、对已上市化学药品注射剂、多组分生化药注射剂进行仿制、改变剂型或者改变给药途径研究时，研究者应当慎重考虑已上市品种的研究基础。,10,以化学药品注射剂为例: 一、化学药品注射剂剂型选择的必要性、合理性 二、化学药品注射剂规格的合理性、必要性 三、化学药品注射剂原、辅料质量控制及来源 四、化学药品注射剂处方及制备工艺合理性、可行性研究，特别是灭菌工艺的选择及验证研究、工艺稳定性研究等,11,五、化学药品注射剂质量研究及质量标准制订 六、化学药品注射剂稳定性研究 七、化学药品注射剂非临床安全
4、性评价的技术要求 八、化学药品注射剂临床研究技术要求 九、仿制化学药品注射剂的技术要求 十、化学药品注射剂说明书和标签内容的技术要求,12,本讲座主要探讨无菌保证工艺研究及评价 包括： 制备工艺的选择工艺参数的确定工艺的验证注射剂灭菌工艺及其验证,13,三、无菌保证工 艺研究与验证要求,14,最终灭菌产品的无菌保证水平规定为: 微生物污染概率不超过百万分之一采用无菌生产工艺的产品: 其无菌保证水平为微生物污染概率不超 过千分之一,15,与产品无菌保证相关的影响因素 环境 厂房、设备 原材料（原辅料、包装材料） 无菌保证工艺 生产过程控制 人员卫生,16,灭菌方法选择按欧盟1999年8月正式开始
5、执行灭菌方法选择的决策树 决策树的作用是在考虑各种复杂因素的情况下辅助选择最佳的灭菌方法 凡是可以最终灭菌的产品务必要最终灭菌,17,18,19,决策树越往下，风险越大 需要提供的必要证据越多,20,基本原则: 无菌产品应在灌装到最终容器后进行最终灭菌（首选） 如因产品对热不稳定不能进行最终灭菌时，可采用最终灭菌方法的替代方法-过滤除菌和/或无菌生产工艺（退而求其次）,21,同时明确如下要求： 无菌药品生产企业，首先应根据特定的处方选择最佳的灭菌方法，然后再选择包装材料 使用热不稳定的包装材料不能作为选择无菌生产工艺的理由 因其他因素选择的包装容器不能进行最终灭菌，药品生产企业仍有责任不断寻找
6、可接受的替代容器，使得产品可以在可接受的时间范围内采用最终灭菌的方法 任何商业考虑均不能作为不使用具有最高无菌保证水平的最终灭菌方法的理由,22,常用的灭菌方式及其无菌保证水平 1、过度杀灭法微生物残存概率10-6 2、残存概率法微生物残存概率10-6 3、无菌生产工艺 无菌保证一般只能达到10-3水平,23,最终灭菌工艺的验证要求 最终灭菌工艺： 过度杀灭法（ Fo12） 残存概率法（8 Fo12）目标：灭菌后的微生物残存概率10-6,24,过度杀灭设计方法： 一种灭菌设计方法，只需要最少的关于产品生物负载的信息。最差条件的生物负载猜测用来确定所产生的杀灭力需要获得灭菌物上的PNSU为10-
7、6。在使用这个方法时，确效计划必须证明FBIO和FPHY都大于12分钟。,25,残存概率法： 一种灭菌设计方法，当所产生的杀灭力需要达到PNSU为10-6时，以（灭菌物品上或内的）生物负载的特性和产品对热的敏感度为基础。应产品而定的设计方法,26,工艺验证要求： 过度杀灭法和残存概率法均应进行工艺验证 验证内容：空载热分布满载热分布热穿透试验微生物挑战试验（残存概率法） 灭菌前微生物污染水平-数量和耐热性-过程控制,27,热力灭菌的动力学原理微生物耐热参数 （D值） 温度系数 Z值 FT 值 T灭菌时间 F0 值标准灭菌时间 无菌保证值（SAL） 灭菌率L,28,对数规则：Arrhenius
8、质量作用定律湿热灭菌的对数规则始于1921年Bigeow发表的论文-用对数规则阐述灭菌工艺过程，他认为，灭菌过程可以用阿伦尼乌斯的一级反应式来描述。根据质量作用定律，在恒定温度及保持其它条件不变的情况下，单位时间内被杀灭的微生物数正比于t0时原有的数目，即：dN/dtK(N0Nk)式中：N0为t0时，存活的微生物数；Nk为t时被杀灭的微生物数；N为t时存活的微生物数。 由此得出，灭菌时微生物的死亡遵循对数规则。,29,微生物存活数与灭菌时间关系图,半对数座标,Y轴：微生物取对数 X轴：时间为10进制普通座标,Y轴及X轴均为普通座标,30,微生物灭活曲线,红色为理想状态：直线 自然界存在的芽孢可
9、能为A、B、C 生物指示剂测试的线性较好,生物指示剂,31,微生物耐热参数（D值）:D值是指在特定灭菌条件下，使微生物数量下降一个对数单位或杀灭90%所需要的时间（分钟）。,32,D-值：在基本温度时使微生物数量下降一个对数 值（或90%）所需的时间,33,灭菌温度系数（Z值）:Z 值系指使某一种微生物的D 值变化一个对数单位，灭菌温度应升高或下降的度数.在没有特定要求时 :湿热灭菌条件下Z值通常取10；干热灭菌条件下Z值通常取20；干热去热原时Z值通常取54。,34,35,FT 值T():灭菌时间FT 值指T()灭菌值，系指一个给定Z 值下，灭菌程序在温度T()下的等效灭菌时间。FTDTlg
10、N 式中: DT 为在T()下微生物的D 值； lgN 为T()下灭菌程序使微生物数下降的对数单位数。,36,F0值:标准灭菌时间（用于湿热灭菌），系灭菌过程赋予待灭菌物品在121下的等效灭菌时间（分钟）。 FH值:标准灭菌时间（用于干热灭菌），系灭菌过程赋予待灭菌物品在170下的等效灭菌时间（分钟）。,37,灭菌率L：L 指在某一温度T()下灭菌lmin 所获得的标准灭菌时间。 L=10 (Ti-TR) /Z Ti灭菌温度TR标准参照温度Z 微生物死亡率常数,38,39,时间 温度 致死率,湿热灭菌的致死率,40,无菌生产工艺的验证要求 无菌生产工艺： 过滤除菌无菌生产工艺 无菌组装工艺,4
11、1,工艺验证要求： -培养基模拟灌装试验对生产系统的验证 -除菌过滤系统适应性试验包括过滤系统相容性测试、过滤前后滤膜完整性测试、滤膜的微生物截留量测试,42,微生物挑战试验,43,微生物挑战试验生物指示剂-简称为BI（biological indicator）:是对特定灭菌工艺具有一定耐受性并且能够定量测定灭菌效力的微生物制剂，适用于制备生物指示剂的微生物多为芽胞类细菌，这是因为，除辐射灭菌外，芽胞类细菌比常规的生长态微生物对灭菌工艺具有更强的耐受性。生物指示剂既可用来测定一个给定的灭菌工艺条件的灭菌效果，也可判别它是否符合无菌保证要求。,44,微生物挑战试验所谓湿热灭菌工艺的生物指示剂微生
12、物挑战试验，系指将一定量已知D值的耐热孢子接入被灭菌的产品中，在设定的湿热灭菌条件下灭菌，以验证设定的灭菌工艺是否确实能赋予产品所需的SAL 为106而进行的试验及评价过程。,45,微生物挑战试验USP和BP对这方面有专门的论述。一般说来，对生物指示剂选择的原则性要求是： 孢子（菌株）稳定 耐热性强于被灭菌物品中常见的污染菌 系非致病菌 易于培养，孢子萌发率要在90%以上 有效期长 保存及使用方便 安全性好,46,微生物挑战试验湿热灭菌工艺验证用生物指示剂的来源主要有两类:一类是采用标准生物指示剂，这类生物指示剂可从市场购买；另一类需用从日常生产污染菌监控分离出的最耐热微生物孢子制备，并测得相
13、关参数（最佳生长条件、耐热性等）后方可使用。,47,湿热灭菌工艺验证中常用的生物指示剂,48,例:国产非治病性嗜热肪芽胞菌芽胞（ATCC 7953）D值-D121值1.74 存活时间- 121oC饱和蒸汽下, 存活时间不 少于3.9分钟 死亡时间- 121oC饱和蒸汽下, 死亡时间不少于19分钟 孢子量- 5105-6cfu/支,49,使用方法:将生物指示剂和被灭菌物品一起放置在灭菌柜（锅）内，上、中层、中央和排气口（冷点处）灭菌后取出，然后直接置于56 60 oC培养24 48小时，并另取一支未经灭菌生物指示剂一起培养，作为阳性对照。 结果判断:根据颜色判断灭菌效果，培养后全部保持紫色灭菌合
14、格。若由紫色变为黄色判为灭菌不合格。对照管应紫变黄色为该指示剂有效。,50,例:进口3MTMATTESTTM (1262) 蒸汽灭菌生物培养指示剂(嗜热脂肪杆菌芽胞菌片) 在121饱和蒸汽条件下，存活时间大于或等于5分钟，杀灭时间小于或等于15分钟。 灭菌完毕，取出生物指示剂后至少冷却10分钟以上，方可挤破生物指示剂内安瓿。否则有可能导致安瓿的碎片伤人。只有对照管为阳性，其生物结果才算有效。,51,使用方法 1、将压力蒸汽灭菌生物培养指示剂放于一标准测试包中； 2、按照国家规范，分别将测试包放于锅内不同位置； 3、灭菌完毕，取出生物指示剂； 4、挤破内含的安瓿，与一支对照管一起放于56培养锅培
15、养； 5、48小时后，阅读结果。,52,微生物挑战试验 挑战试验合格标准 生物指示剂的选用应构成挑战性的必要条件：可用药典，如USP中规定的生物指示剂；对存活概率灭菌程序的产品而言，应当强调，所用生物指示剂的耐热性应大于产品中常见污染菌的耐热性，生物指示剂的用量也应大于产品中该污染菌的水平。经生物指示剂验证后，应能证明在设定的F0条件下，产品的无菌保证水平低于10-6。,53,微生物挑战试验 方案制订制订验证方案时，应当综合考虑相关法规要求、灭菌热分布及热穿透试验数据、产品的热稳定性、日常生产监控中所获得的灭菌前产品中的微生物污染水平和污染菌的耐热性数据。方案还包括验证记录的各种表格。,54,
16、微生物挑战试验 湿热灭菌程序通常分为两类：过度杀灭程序（Overkill Design Approach）残存概率程序（Product-Specific Design Approach ）,55,微生物挑战试验 挑战试验(生物指示剂验证试验 ):生物指示剂的装载 灭菌 检查和培养 结果评价 验证试验的频率,56,微生物挑战试验作为一项生物挑战性试验，尽管生物指示剂验证不能替代物理验证，但它能如实反映灭菌工艺条件对微生物的杀灭效果，从而证明该灭菌工艺所赋予相关产品的无菌保证水平是否符合要求。生产指示剂在试验中扮演了各种可能因素造成的产品中的“污染菌”的角色，以这种方式进行的验证更切合实际，更能说
17、明所设定的灭菌程序是否安全。,57,微生物挑战试验对热稳定性很好的产品而言，通常采用过度杀灭程序，该程序能赋予产品足够大的安全系数，使在121下D值约为1.0min的细菌孢子至少下降12个对数单位。在过度杀灭程序的一半时间时，可使该孢子至少下降6个对数单位。由于杀灭微生物孢子（生物指示剂）的灭菌条件极为苛刻，因此，从灭菌程序的标准灭菌时间F0来看，毋须担心产品灭菌后的无菌保证问题。,58,微生物挑战试验并不是所有的灭菌程序都可进行生物指示剂验证。有些产品的热稳定性相当差，灭菌温度仅能控制在100左右，整个灭菌程序的F0值还不到1min，对此类程序进行生物指示剂验证就没有太多的意义。此类产品的无
18、菌保证水平主要是通过无菌生产工艺来实现，灭菌仅能作为提高产品无菌保证水平的手段。,59,微生物挑战试验WHO GMP中强调，化学或生物指示剂可用于灭菌过程的监控，但不得代替物理监控（温度、时间）。FDA均认为生物指示剂验证并不能取代物理验证，这是由生物指示剂验证的复杂性所决定的。,60,容器密封性试验,61,容器密封性试验FDA-GMP211.94（药品容器和密封材料）要求，药品容器和密封材料应是清洁的，按药品性质的指示进行灭菌和去热原。标准及检测方法、清洁方法、去热原及灭菌方法应形成书面文件，并遵照执行。EU-应采用经验证的适当方法完成产品的密封。(无菌产品的最终处理),62,容器密封性试验
19、在对产品包装进行评估测试的初期，常采用物理和微生物学检测手段。物理检测有许多优点，如灵敏度较高、使用方便、检测迅速及低成本等。在产品有效期内，均可使用物理检测方法来确定包装完整性是否符合规定要求。进行包装完整性检测的一个重要原因在于，确保无菌产品始终保持无菌状态。因此，在产品包装的研发阶段，应考虑采用微生物侵入试验，或采用经验证过的并且比微生物检测更为有效的物理试验方法，来检测产品包装的完整性。但是，对于效期内成品的稳定性试验来说，因进行微生物侵入试验较为困难，故建议采用物理检测方法。,63,容器密封性试验微生物侵入试验是对最终灭菌容器密封件系统完好性的挑战性试验。在验证试验中，取输液瓶或西林
20、瓶(小瓶)，灌装入培养基，在正常生产线上压塞、压盖灭菌。此后，将容器密封面浸入高浓度运动性菌液中，取出、培养并检查是否有微生物侵入，确认容器密封系统的完好性。此同时，需作阳性对照试验，确认培养基的促菌生长能力。,64,过滤系统的验证,65,过滤系统的验证 法规的要求FDA Aseptic Processing Guidelines FDA无菌工艺指南:与过滤器完整性相关的性能测试应包括：模拟生产条件，在最苛刻生产环境下进行微生物挑战试验。EU GMP 欧盟GMP 无菌药品附录所有除菌工艺必须进行验证,66,PIC/S无菌工艺验证(2004年7月)9.5.1 不管使用什么样的过滤器或过滤器组合,
21、验证都应包括微生物挑战试验,模拟 “最差情况”生产条件.用于挑战试验微生物(如缺陷假单胞菌)的选择必须证明适当.产品的性质可能影响过滤器,因此验证应在有产品的时候进行.如果产品具有细菌抑制作用或杀菌性,应使用产品替代品进行试验,该替代介质不含产品有效成分.可以将类似产品归类,然后只对其中一个产品做试验.过滤器完整性试验的限度应来自过滤器验证数据.过滤器生产商也应评估过滤器前后允许的最大压差,这应对照批记录做检查确保在无菌过滤期间没有超过这个数值.9.5.2 除了过滤器类型验证,每个日常生产中使用的单个产品过滤器的完整性也应在使用前后分别做试验.,67,过滤器的验证证明及过滤器生产工艺 完整测试
22、标准 起泡点及扩散流 最大操作温度 最大操作压力 可以最多灭菌的次数次数，温度，时间 确保其过滤器符合法规要求 无纤维脱落 溶出物评估,68,滤器的选择与特征表现,滤器的类型 滤器的组能 粒子脱落 可抽取物 化学配伍性 吸附作用 热压迫阻抗性 水力压迫阻抗性 毒性试验 物理完整性试验,69,完整性试验,完整性试验的理论 完整性试验结果与细菌滞留的关系 制品-湿润的完整性试验VS水-湿润的完整性试验 制品-湿润的起泡点（比值） 制品-湿润的起泡点（统计方法） 制品-湿润的扩散性流动/前推流动试验规格 使用自动化完整性试验仪执行不需下游端操作的上游端试验 一种减菌级滤器何时必须执行完整性试验 失败
23、分析/寻找并解决问题,70,71,非破坏性物理完整性试验,起泡点试验 扩散性流体/前推流体 压力保持/消退试验 自动化完整性试验仪器 压力保持/消退与扩散流体/前推流体之间的关联性,72,滤孔大小的估测 毒性与滤器可抽取物试验 对计算之制品-湿润的起泡点之统计调整,73,四、无菌药品生 产关键工艺的法规要求,74,无菌药品的生产原则为降低微生物、微粒和热原污染的风险，无菌药品的生产应有各种特殊要求。这在很大程度上取决于生产人员的技能、所接受的培训及其工作态度。质量保证极为重要，无菌药品的生产必须严格按照精心制订并经验证的方法及规程进行。产品的无菌或其它质量特性绝不能仅依赖于任何形式的最终操作或
24、成品检验。,75,注射剂的无菌保证要求 人员 厂房设施、设备管理 物料管理 生产管理 灭菌工艺及其验证 无菌生产工艺 无菌检查,76,厂房设施、设备管理 洁净度级别 ABCD级及响应的操作工序 洁净区的控制 无菌操作区与有菌操作区应分开 关键操作区的悬浮颗粒、微生物、气流方向和压差 空气净化系统的运行和维护 更衣室,77,无菌药品生产洁净区的要求 无菌药品的生产必须在洁净区内进行，人员和/或设备以及物料必须通过缓冲进入洁净区。洁净区应当保持适当的洁净度，洁净区的送风须经具有一定过滤效率过滤器的过滤。 洁净区的设计必须符合相应的“静态”标准，以达到“动态”的洁净要求。 高风险操作区层流系统在其工
25、作区域必须均匀送风，风速为0.36-0.54m/s（指导值）。 生产操作全部结束，操作人员撤离生现场并经1520分钟（指导值）自净后，洁净区的应达到表中的“静态”标准。,78,98版GMP要求比92年还低 层流、风速及洁净区的换气次数被取消了，使高风险作业的要求变得不很明确。 无动态标准 无层流标准，将国际上B级的动态指标，作为静态百级的标准，不考核动态测试结果。 关键操作区无气流方向要求。 压差控制要求偏低。 沉降菌培养皿暴露时间为0.5小时，远低于国际标准。 无表面微生物监控限度。,79,工艺用水的管理 水处理设施及其分配系统的设计、安装和维护应能确保供水达到适当的质量标准。水系统的运行不
26、应超越其设计能力。 注射用水的生产、储存和分配方式应能防止微生物生长，例如，在70oC以上保持循环。 水源、水处理设施及水的化学和生物学污染状况应定期监测，必要时还应检测细菌内毒素。监测结果以及所采取纠偏措施的记录应予归档。,80,灭菌工艺及其验证生产企业对每产品需确立以下具体要求: 灭菌工艺验证、控制的具体要求。 灭菌再验证的时限规定。 生物指示剂的要求。 灭菌设备生物挑战性试验的要求。 干热灭菌设备细菌内毒素挑战性试验的要求。 灭菌冷却介质的质量要求。,81,无菌生产工艺及其验证 培养基灌装的标准和具体要求。 过滤和过滤器管理的具体要求。 产品密封性检查及验证的要求 无菌检查样品取样的要求,82,关注欧美GMP要求 关注欧美各行业标准,83,谢 谢！ 共同探讨，共同提高,
