1、大肠杆菌的培养和分离,微生物包括五类：,病毒 细菌 放线菌 真菌 原生动物,原核生物,一、基础知识： (一)微生物:绝大多微生物与传染病无关， 90%以上的微生物对人类有利。,真核生物,(二)细菌 1、形态,(二)细菌 2、结构,拟核,细胞质,细胞膜,细胞壁,基本结构,特殊结构,(有的有质粒),根据细菌所利用的能源和碳源的不同将细菌 分为两大营养类型。自养菌:异养菌:,光能自养型:光合细菌 化能自养型:硝化细菌,铁细菌,硫细菌,大肠杆菌属于异养兼性厌氧菌,腐生菌 寄生菌 大部分病原菌,(二)细菌 3、细菌的营养类型,碳源,为微生物提供生长繁殖所需碳元素的营养物质。如CO2、NaHCO3、糖类、
2、脂肪酸等。糖类是最常用的碳源，尤其是葡萄糖。碳源主要用于合成微生物的细胞物质和代谢产物。有些碳源还是异养微生物的主要能源物质，因此，微生物对碳源的需要量最大。,氮源,凡是能为微生物提供所需氮元素的营养物质。有铵盐、硝酸盐、尿素、牛肉膏、蛋白胨等。,二、大肠杆菌,革兰氏染色,革兰氏阳性,革兰氏阴性,单个或少数细菌在固体培养基上大量繁殖时，就会形成一个肉眼可见的，具有一定形态结构的子细胞群体，叫做菌落。 单菌体在固体培养基上大量繁殖时，就会形成一个肉眼可见的，具有一定形态结构的子细胞群体，叫做单菌落。 菌落是鉴定菌种的重要依据。 单菌落的分离是消除污染杂菌的通用方法，也是用于筛选高表达量菌株的最简
3、便方法之一。,菌落、单菌落,微生物的培养与观察,在自然界中，微生物呈混合状态存在，要想获得所需菌种，则必须把它们从中分离出来并加以纯化培养。 分离：将特定的微生物个体从群体中或从混杂的微生物群体中分离出来的技术叫作分离。 纯化：在特定环境中只让 1种来自同一祖先的微生物群体生存的技术叫作纯化。,概念,分离技术主要是稀释和选择培养。 稀释：是在液体中或在固体表面上高度稀释微生物群体，使单位体积或单位面积仅存留一个单细胞，并使此单细胞增殖为一个新的群体。最常用的为划线分离法和涂布分离法。 选择培养：如果所要分离的微生物在混杂的微生物群体中数量极少或者增殖过慢而难以稀释分离时，需要结合使用选择培养法
4、，即选用仅适合于所要分离的微生物生长繁殖的特殊培养条件来培养混杂菌体，改变群体中各类微生物的比例，以达到分离的目的。,概念,三、大肠杆菌的培养和分离,培养基的配制,菌种保存,(一)培养基的配制 1、原则,根据所培养的微生物种类、培养目的等，选择原料配制培养基。如：细菌喜荤，霉菌喜素 营养要协调 不管哪种培养基，一般都含有碳源、氮源、水、无机盐等营养物质，另外还需要满足微生物生长对pH 、氧气、渗透压的要求,LB培养基(通用的细菌培养基),蛋白胨0.5g，酵母提取物0.25g，氯化钠0.5g, 水50mL,2、培养基的配制流程,称量、溶解,调节PH值,分装加塞,倒皿 摆斜面,灭菌,3、培养基分类
5、,液体培养基 固体培养基 半固体培养基,选择培养基 鉴别培养基 基础培养基 ,物理状态,01,成分,02,用途,合成培养基 半合成培养基 天然培养基,03,液体培养基：,表面生长,均匀混浊生长,沉淀生长,培养基的用途,液体培养基：扩增细菌、工业生产固体培养基：纯化（分离），鉴定、保藏菌种,1.无菌技术的概念,无菌操作泛指在培养微生物的操作中，所有防止杂菌 污染的方法。,成功地培养微生物的关键。,(二)细菌的培养无菌技术,2.消毒与灭菌的概念及两者的区别,消毒：指杀灭病原微生物的方法； 灭菌：指杀灭或清除环境中一切微生物（包括芽孢、孢子）的方法。,灼烧灭菌,3、常用灭菌的方法：,高压蒸汽灭菌：1
6、kg/cm2、121 下维持15-30min.紫外光灭菌法 ,（三）倒平板,灭菌后的培养基在无菌操作台(超净台)上倒入4个培养皿中，倒后立即置于水平位置上，轻轻晃动，使培养基铺满平皿底部，待凝，使之形成平面,注意事项： 1.培养基灭菌后，需要冷却到60 左右时，才能用来倒平板 2.灭菌及消毒：无菌操作台用超净紫外灯和过滤风灭菌；桌面及人手用酒精棉球消毒3.操作时右手无名指和小指夹住封口膜,另外三指持三角瓶,左手拿培养皿并打开上盖的一边,在酒精灯火焰旁操作. 4.需要使锥形瓶的瓶口通过火焰，灼烧灭菌 5.平板冷凝后，要将平板倒置,既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养
7、基，造成污染.,（四）大肠杆菌的扩大培养,将斜面上培养的大肠杆菌菌种接种到灭菌后的液体培养基中,使其在37摇床培养12小时。,注意事项: 1.火焰旁从斜面上用接种环取菌; 2.取菌前接种环要用酒精灯灼烧 灭菌,冷却后方能取菌; 3.取菌后封口膜和棉塞复原.,（五）大肠杆菌的分离培养,分离方法:划线分离法和涂布分离法,划线分离法,连续划线法 交叉划线法（分区划线法）,1.划线分离法：目的：使混合的细菌呈单个分散生长，形成单菌落，以获得纯菌。方法：分区划线法：适用于含菌量较多的标本连续划线法：适用于含菌量较少的标本,1.划线分离法,（五）大肠杆菌的划线分离,注意事项: 1.接种环只蘸一次菌液 2.
8、培养基不同位置连续划线多次.划线首尾不能相接，划线不能划破培养基。3.划线后,培养皿倒置培养1224h,1、划线分离法,讨论,每次使用接种环之前都要进行灼烧， 为什么？,讨论,1.操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上 可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧 接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残 留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直 接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的 增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便 得到菌落。划线结束后灼烧接种环，能及时杀死 接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染 操作者。,2.(稀释)涂布分离法,取菌悬液,将菌液均匀涂布分散,37倒
9、置培养,按浓度捆成一摞,恒温37培养,平板菌落计数,划线分离法和涂布分离法哪个更好呢？,划线分离：方法简单，但单菌落较难分开。 涂布分离：单菌落更易分开，但操作复杂。,（六）大肠杆菌分离后保存,1、临时保藏：接种到固体斜面培养基，菌落长成后置于4冰箱保存。 2、长期保存：甘油冷冻管藏法,基本知识点,大肠杆菌的特点 单菌落的作用 培养基配制的要素 灭菌及其条件 LB液体培养基、固体培养基的用途 细菌的分离方法 细菌培养的条件,如何检测接种前培养基是否被污染？,将未接种的培养基在适宜条件下放置适宜时间，观察培养基上是否有菌落产生。,基本识记内容,大肠杆菌是基因工程技术中被广泛采用的工具 单菌落的分
10、离是消除污染杂菌的通用方法，也是用于筛选高表达量菌株的最简便的方法之一。 LB液体培养基用于扩大培养，LB固体培养基用于分离 划线分离法简单；涂布分离法，单菌落更易分开，但操作复杂 培养微生物时，全过程都要无菌操作，包括仪器和培养基 灭菌时，有温度、压力、时间三方面的基本要求（121、1kg/2、15min),培养基中有葡萄糖或尿素时则要改变灭菌条件。 制备培养基的基本要素营养、渗透压、pH 培养和分离时，培养皿要倒置,三、大肠杆菌的培养和分离,培养基的配制,菌种保存,1.为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？,答：操作的第一步灼烧
11、接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到单菌落。划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。,划线分离法,2.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？,答：以免接种环温度太高，杀死菌种。,3.在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？,答：划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随
12、着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的单菌落。,1.如何检测接种前培养基是否被污染？,将未接种的培养基在适宜条件下放置适宜时间， 观察培养基上是否有菌落产生。,2.如何操作才可以尽量避免被杂菌污染？,（1）胆大心细，操作快捷。 （2）注意灭菌操作原则，灭菌彻底，降低环境污染概率。 （3）注意微生物生长条件，如PH、渗透压、温度等。细菌喜碱，喜蛋白质，喜37度；霉菌喜酸，喜糖，喜25-30度,思考,3.在培养后如何判断是否有杂菌污染?,（1）菌落的形态，看是否湿润，透明，粘稠，颜色等。是区别细菌、酵母、放线菌和霉菌关键指标。 （2）显微镜观察其形态、大小、看是否有菌丝、孢子、
13、芽孢。是区别细菌、酵母、放线菌和霉菌关键指标。 （3）上述方法较难区别同类的不同物种，需借助化学和进一步的形态观察，如用革兰氏染色法等。,4.进行恒温培养时为什么要将培养皿倒置?,恒温培养时，培养基中的水分会以水蒸气的形式蒸发，倒放培养皿则会使水蒸气凝结成水滴留在盖上；如果正放，则水分形成的水滴会落入培养基表面并扩散开。如果培养皿中已形成菌落，则会导致菌随水扩散，很难再分成单菌落，达不到分离目的。,5.实验完成后,接种过细菌的器皿应如何处理?,所有接触过菌的器皿都要先高压灭菌后再洗涤（特别是培养基）；使用后的废弃物也要高压灭菌后再抛弃。,实验2 分离以尿素为氮源的微生物,实验步骤：,观察,注意：尿素经过细菌过滤器 灭菌后加入,培养基的配制和灭菌,倒平板,接种,LB全营养培养基（对照组）,尿素固体培养基（实验组）,玻璃刮刀、涂布分离,培养,对照组： 实验组：,制备土壤稀释液,倒置，37恒温培养箱，24-48h左右,菌落数量和种类多而杂,菌落少而纯，菌落周围出现 红色区域,LB培养基上10-4 、10-5稀释液涂布结果,尿素培养基上10-4 、10-5稀释液涂布结果,37恒温培养,微量移液器的使用,
