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类型实验三血红蛋白吸收及其衍生物光谱分析(终版2012-11-27).ppt

  • 上传人:dcs1276
  • 文档编号:4896467
  • 上传时间:2019-01-20
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    实验三血红蛋白吸收及其衍生物光谱分析(终版2012-11-27).ppt
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    1、实验三 血红蛋白及其衍生物的吸收光谱测定,生物技术专业实验室 王小英,一、实验目的,1、熟悉Hb及其衍生物吸收光谱测定的原理及操作方法。 2、掌握吸收光谱曲线绘制的方法。,1、吸收光谱曲线:将各种波长()的单色光依次通过一定浓度的某一溶液,测量该溶液对各种单色光的吸收程度(吸光度A),以为横坐标,以A为纵坐标,可得到一条曲线,即吸收光谱曲线或称为吸收曲线。,二、实验原理,2、吸收曲线的特点,同一种物质对不同波长光的吸光度不同。吸光度最大处对应的波长称为最大吸收波长max 。 不同浓度的同一种物质,其吸收曲线形状相似max不变。而对于不同物质,它们的吸收曲线形状和max则不同。 在max处吸光度

    2、随浓度变化的幅度最大,所以测定最灵敏。吸收曲线是定量分析中选择入射光波长的重要依据。,3、血红蛋白(Hemoglobin,简称Hb),血红蛋白四聚体结构模式,4、Hb及其衍生物,吸收峰数量,峰 值,2个 541nm,576nm,2个 540nm,569nm,1个 540nm,1个 555nm,HbO2 + K3Fe(CO)6 + NaCN MetHbCN,500650nm,图1 HbO2吸收光谱,图2 HbCO吸收光谱,图-3 MetHbCN吸收光谱,图-4 脱氧Hb吸收光谱,三、操作步骤,1、样品制备 (1)HbO2液: 取全血0.1ml(1滴)盛于小烧杯中,加蒸馏水10ml,混匀,此即Hb

    3、O2液。,(2)MetHbCN液: 取上述氧合血红蛋白约5ml于小试管中,加新鲜配制的10%K3Fe(CN)6 2滴,然后加1滴1%NaCN液,混匀,此即为MetHbCN液。,(3)混匀,静置5min。,2、比色,将以上制备的两种血红蛋白液分别盛于比色杯内,在722型分光光度计上以蒸馏水为空白调节0和100%。在500650nm分别测定HbO2和MetHbCN液的吸光度(*在相应峰值的10nm范围内每隔5nm记录一次吸光度读数,其余均每隔10nm记录一次吸光度读数)。,四、结果记录及曲线绘制,以波长为横坐标,吸光度为纵坐标描点,并将各点连接成光滑曲线,即为血红蛋白及其衍生物的吸收光谱。,2、绘制吸收曲线(*并确定最大吸收波长),1、记录各波长下的A(制成表格),四、注意事项,1、NaCN溶液是剧毒物,要注意安全,切忌口服,实验完毕注意洗手。 2、取全血前要混匀。 3、比色时每次换波长都要重新调零和100%。 4、绘图时,纵横坐标比例要适当,要用圆滑线把点连起来。,五、思考题:,1、什么叫吸收光谱?测定血红蛋白及其衍生物的吸收光谱有何意义?,

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