1、第五章 自动生化分析仪,4.1 自动生化分析仪的发展和特点 一、自动生化分析仪的出现随着科学技术和医疗事业的发展，临床化学检验的样品、数量迅速增加，新的检验项目不断增添，传统的手工操作方法已不能满足临床需求。这主要体现在以下几个方面： 随着医学研究的进步，对疾病诊断需要更多的检验信息来辅助诊断 对检验信息的时效性要求也越来越高 对一些快速流行的传染型疾病发病病原的快速筛查 研制新药时的大量的药物成分药效的筛查,1957年美国医师发明了临床化学自动分析技术，建立了临床化学自动分析法的里程碑，同时也开通了整个临床医学检验，向自动化分析发展的道路。 近几十年来，各种自动生化分析仪器和试剂均得到很大发
2、展生化分析由手工操作进入机械化、自动化阶段。自动生化分析仪在实验室和临床检验中均得到了广泛的应用。,二、自动生化分析仪的发展历程 1957年美国泰克尼康公司根据Skeggs教授的设计方案制造了世界首台自动化分析仪 1965年诞生了分立式自动分析仪 70年代 干化学分析仪和半自动型分析仪开始获得应用。 80年代初美国泰克尼康公司发明了任选式测定方式的自动生化分析仪 90年代以来，自动分析技术主要是向着完善仪器各种功能的方向发展。,三、自动生化分析的优点 提高工作效率，即在单位时间内，一个实验室工作人员可以完成更多的工作，通过自动化可以大大降低单个劳动力所消耗的费用。 提高试验的精密度与准确度，减
3、少测定结果的室内和室间变异系数，增加了结果的可比性和可信度。 减少产生差错的因素，不受操作人员的技术高低、工作时间内技能状态（疲劳）等各种因素的影响。 改进了分析方法。时许多难以用手工操作方法进行精密分析的项目通过自动分析来完成。,有监测、统计、储存等多种功能，并可以及时报警纠正错误。 节约每个样品的检验费用。自动分析测定一个项目一般所需样品量仅数微升，试剂用量通常数百微升，而且分析快，获得结果的时间短，十分有利于患者的及时诊断和治疗。,四、现代自动生化分析仪的特点 经过几十年的发展后，目前国际上的最新的自动生化分析仪都具有以下的一些特点： 有效的抗交叉污染措施 任选式仪器 样品和试剂的冷藏设
4、计 工作效率的提高,4.2 生化分析仪的分类,生化分析仪的种类较多，可从不同的角度进行分类： 1按反应装置的结构划分可分为连续流动式、分立式、离心式和干片式4类。 2按自动化程度划分可分为全自动、半自动和手工型3类。 3按同时可测定项目划分可分为单通道和多通道两类。单通道每次只能检测一个项目，项目可以更换。多通道每次同时可以测多个项目。,4按仪器的复杂程度及功能划分可分为小型、中型和大型3类。小型一般为单通道、半自动及专用分析仪；中型为单通道(可更换几十个项目)或多通道，常同时可测210个项目；大型均为多通道仪器，同时可测10个以上项目 5按规定程序可变与否划分可分为程序固定式和程序可变式两类
5、。,4.3 不同类型的自动生化分析仪的工作原理及基本结构,所谓自动生化分析仪就是生化分析中的取样、加试剂、去干扰物、混合、保温反应、检测、结果计算和显示，以及清洗等步骤都能自动完成的仪器。目前，绝大多数生化分析仪都是基于光电比色法的原理进行工作的。其结构可粗略地看成是由光电比色计或分光光度计、微机（数据分析）和自动传输装置等几部分组成。,4.3.1 不同结构类型的自动生化分析仪 一、连续流动式（管道式）自动生化分析仪1. 工作原理,整个分析仪主要是由样品盘、比例泵、混合管、透析器、恒温器、比色计和记录器等组成 自动生化分析仪工作过程如下：首先通过比例泵，将标本和试剂按比例地吸到连续的管道系统中
6、，并在一定的条件下，在管道系统内完成混合、分离干扰物、保温反应、显色、比色等步骤，然后将所测得的信号进行放大、运算等处理，最后，将测试结果显示并打印输出,连续流动式分析仪特点就是测定项目的各待测样品与试剂混合后的化学反应是在同一管道中经流动过程完成的。 在连续流动式分析仪中，检测分析是一个样品接着一个样品在连续流动状态下进行的。 这类仪器中，样品和样品之间可用空气来隔离，也可用空白试剂或缓冲液来隔离。 用空气分隔的叫空气分段式系统 用空白试剂或缓冲液分隔的叫非分段式系统。 在管道式分析仪中。以空气分隔式最多，且较典型,非分段系统是依靠试剂空白或缓冲液来间隔每个样品的反应液。所以在管道中流动的液
7、体不被分段。非分段系统又可分为流动注入系统和间隙系统两种。,流动注入系统的原理,2. 结构 样品盘(加样器)为一可转动的圆盘状架子，在圆盘上放若干聚乙烯塑料杯(或试管)，用以盛放待测样品和校正仪器用的标准液。在程序控制器的控制下，转盘的移动与采样管上塑料软管探头的活动同步，即圆盘每隔一定时间自动转动一格，采样管吸取一次样品。 比例泵(称量泵) 是一种蠕动泵，执行两个功能，即提供能使样品在仪器内进行运动的压力和向流经塑料管的液体注入空气。,(a)一种比例泵的外形 (b)转轴的横切面及其邻近装置的关系 (c)一只转轴的纵切面及其邻近装置的关系,混合管(反应器) 由玻璃螺旋管制成，它的作用是将比重不
8、同的液体充分混合、以便通过保温、加温、冷却等过程完成测定反应。,混合管外形及混合原理,透析器 其作用是使反应管道中的大分子物质(如蛋白质)与小分子物质(如葡萄糖、尿素等)分离。,透析器的结构,二、分立式自动生化分析仪,1. 工作原理 所谓分立式，是指按手工操作的方式编排程序，并以有节奏的机械操作代替手工，各环节用传送带连接起来，按顺序依次操作.,2. 结构 试样器为圆盘式或吊篮式。被测试样放在试样器上，试样器在驱动装置带动下，按一定速度移动，使试样一个个地传递到取样针下进行取样。 吸量装置和分布器吸量装置通常由注射器组成。注射器活塞通常采用气动控制机械传动装置带动，可定量吸取试样和试剂。 反应
9、管反应管固定在由微型马达带动的链式传送带上，步进式向前移动。步进速度乘以反应终点位号，即为总反应时间，可依反应时间选择适宜步进速度。 加热浴恒温槽可控温于35t、37C、50 检测器 为光电比色计(或分光光度计)。待反应完成后，进行检测。,三、离心式自动分析仪,离心式分析仪由加样部分和分析部分组成。在一个圆盘的外周呈放射状排列着比色室，在比色室的内侧有与比色室呈对应排列的试剂槽和试样槽，槽间由隆起的脊隔开。将圆盘放到离心机上，开机后由于快速旋转所产生的离心力，使试剂、试样向外移动并混合、反应，反应物最后转移到比色室中进行检测。,离心式自动分析仪的结构图,四、干化学生化分析仪,1. 工作原理 其
10、原理是将某项测定所需要的全部试剂成分固化在具有特定结构的反应装置(试剂载体)上，当把样品加到载体上之后，液体成分将试剂溶解并发生反应然后通过检测器检测反应信号。 干化学分析仪的结构特点主要表现在试剂片和检测器两个部分。试剂片采用涂层技术组成多层复合膜结构，一般为四个功能层，可分为展开层、两个中介层，一个显色剂层。 干化学试剂片的定量测定方法有差式电位法和反射光度计法。,反射光度计原理示意图,基于反射的比色法反射光度法的测量原理当对某些固态物质的吸收光谱进行比色分析时，通常采用反射光度法来测定其光谱。 Kubelka-Munk理论和Williams-Clapper公式当对固态物质进行反射光度法测
11、量时碰到的主要问题为漫反射(diffuse reflection)。这种反射有两个主要的特点：因显色反应发生在“固相”，后者对透射光和反射光均有明显的散射作用，因而不服从Lamber-Beer定律。固相反应膜的上下界面之间存在多重内反射。对于前者，Kubelka-Munk理论基本上可以直接应用，而对于后者，则需应用Williams- Clapper方程来对结果进行修正。,（1）Kubelka-Munk理论设某固相反应层的厚度为X，来自外部的照射光可通过该固相反应层后在下界面被反射；而在透射和反射的过程中除了光的吸收外，均存在明显的散射作用。现设照射光强度为In，在该固相反应层内距下界面距离为x
12、的微分层厚度dx上的入射光强度与反射光强度分别为i与j，则可建立以下的微分方程组：,式中S为固相反应层单位厚度的散射系数，K为显色反应后或空白固相反应层单位厚度的吸光系数。,解以上的微分方程组，可得上表面处反射率R(R=jIo)的数学表达式为：,其中的双曲正弦函数与双曲余弦函数分别为：,式中的系数分别为：,由反射率的上述数学表达式可见，其数值由散射系数S，固相反应层单位厚度的吸光系数K和固相反应层的厚度X所决定。而K又正比于待测物质的浓度C,因此当S和X固定时，反射率R则仅与待测物质的浓度有关。换言之，即可由测得的R，求出C。 在实际工作中与在溶液中应用的Lambert-Beer定律一样，人们
13、更感兴趣的是吸光度而非透射率和反射率。为此，可用反射吸光度(reflection absorbance)Rf来描述固态物质的吸光程度:Af=lg(R/R0)，式中的R为实测的反射吸光度，R0为固相反应层的空白反射率，即：R0 =SX(SX+1),（2）Williams-Clapper公式在某些多层膜系统中，还需考虑膜上下界面之间的多重内反射，此时应对Kubelka-Munk理论予以修正。为此，可推导出如下的Williams- Clapper式： Dr=Lg(Ro(RtRr)式中Dr为反射吸光度。R0为空白反射光强度，Rt为测定之反射光强度，Rr为非线性校正因子,反射法的Kubelka-Munk
14、理论曲线(0SX20),Williams-Clapper变换前（Dr)后(Dt)反射吸光度与浓度的关系,4.3.2 自动化程度不同的生化分析仪,一、半自动生化分析仪半自动生化分析仪指在分析过程中的部分操作(如加样、加试剂、混勾、结果记录等步骤)由手工完成，如吸入反应液、保温、比色测定、吸光度监测、结果的计算、打印等功能由仪器自动完成。与普通分光光度计相比，优点是节省试剂、可进行连续监测法的测试、精密度高。且仪器的体积小，结构简单，灵活件大，价格便宜。半自动生化分析仪主要用于动力学法、两点法及终点法的检测，可以采用人机对话方式进行操作。,二、全自动生化分析仪,全自动生化分析仪是从加样开始到结果打
15、印完全由仪器自动完成的自动化仪器。操作者只需把样品放在分析仪的特定位置上，选择程序开动仪器即可等取检验结果。 这类仪器功能全，灵活性大，易于操作，主观误差小准确度、精密度和分析效率高。 大多采用吸光度法，也有荧光光度法、光散射法、浊度测定法和离子选择性电极法，应用于常规生化、特种蛋白和药物监测等 既能用于终点法测定，又可用于各种动态法测定。,4.4 自动生化分析仪的性能评价与合理选用,一、自动化程度自动化程度指在人发出指令后，能够由仪器自己独立完成工作的程度。除此之外，自动化程度还包括单位时间可处理标本的能力，可同步分析的项目数等等。 二、分析效率分析效率是指在测定方法相同的情况下分析仪的分析
16、速度。分析速度决定于一次测定中可测样品多少和可测项目的多少。,三、精度和准确度自动生化分析仪测定的精度和准确度取决于仪器各部件(加液、温度控制、波长、记时等)的加工精度和精确的工作状态。 四、应用范围仪器的应用范围指所能进行的分析方法以及可测定项目的种类，这是仪器的综合性指标，与仪器的设计原理及结构有关。,4.5 自动生化分析仪的测量方法,一、平衡法（终点法）在终点法反应中，首先测定样品添加前比色皿中的基准吸光度值(即试剂空白)、然后测定当样品添加到达了一个标志反应完成的稳定平台后的吸光度值，其差值用于浓度的最后计算。,典型的终点法反应曲线,二、动态法（速率法） 1. 可变信号法直接法 导数法
17、 积分法 2. 固定信号法固定信号法测定的原理是随着反应的进行，通过不断添加试剂使吸光度变化在很窄范围内，此时再测得加试剂的量，并依此来计算待测物质的浓度。 三、固定时间法该方法是仅测指定一段时间内的物质的吸光度，如只测定开始一分钟的反应。,4.6 自动生化分析仪的主要实验参数,一般自动生化分析仪有12个主要数据：波长、温度、标本及试剂量、空白时间(Tb)、开始收集实验数据时间（Ti）、实验数据收集窗时间（Tw）、实验数据收集完成时间（Td）和最后时间（Tf）、速率时间（Tr）、线性限度（L）、异常吸收率（ABN）、曲线拟合、浓度因素（F）。这些参数都是通过方法学的研究之后，根据反应的具体情况
18、加以确定。,波长温度样品量及试剂量分析时间的确定线性判断标准异常吸收率限度,4.7 生化分析仪实例1：ISP型半自动生 化分析仪,一、技术参数 测量范围：吸光度，0.32.3浓度：0.000 19999延迟时间：2 9999 s测量频率：每两秒测量一次 吸光度分辨力：仪器内部：仪器内部：10-4， 显示：10-3,光源：石英碘灯12V 20W 显示：6位液晶显示 泵：吸入量：25 1500l 比色皿：为可拆式流动式石英比色皿。容量为32l 波长选择：干涉滤光片，其半宽度为8 12nm 波长范围：300 1000nm 电源：220v22v或 110v11v 环境温度：10 30,ISP型半自动生
19、化分析仪的外观图,ISP型半自动生化分析仪的原理方框图,4.7 生化分析仪实例2：日立7170(A)全 自动生化仪,一、7170(A)的基本结构及其功能7170型全自动生化分析仪主要由样品盘、吸样机构、试剂盘、试剂吸量机构、反应盘、反应槽、搅拌机构、清洗机构、试剂冷藏装置、光度计、操作系统及附属装置等组成。 1样品盘(Sample Disk)共有两个样品盘，均为内、外因圆盘状结构，用于存放样品杯。,2吸样机构Sample Mechanism)由样品吸量管、样品探针(带有液面检测器)和针头清洗槽等组成，用于从样品杯中吸取一定量的样品，然后注入反应杯内。,吸样机构流程图,3试剂盘(Reagent
20、Disk)共有两个试剂盘，各有45个试剂瓶。用于放置四种试剂。 4. 试剂吸量机构(Reagent Pipetting Mechanism)由试剂吸量管、试剂探针(包括一液面检测器)及针头清洗槽等组成，用于从各试剂瓶中吸取一定量的试剂，然后注入反应杯内。 5. 反应盘(Reaction Disk)可放置160个比色杯(20个组8组)。比色杯为塑料材质，光径长5mm。 6反应槽(Incubator)其维持反应杯内的反应液在一特定温度(37土0.1)。,8清洗机构(Rinsing Mechanism)包括两个清洗装置用于清除测定完毕后的反应液、清洗反应杯、注入及清除测水空白时用的去离子水。 9试剂
21、冷藏装置(Reagent Cooling Unit)用于放置试剂盘和冷藏试剂，温度保持在515 10光度计(Photometer),光度计原理,11操作系统(Operation Unit)由触摸式显示器、打印机、键盘和主机等组成，用于输入信息以及显示、打印分析结果 l 2附属装置(Optional Units)包括测定纳、钾和氯的ISE装置和样品ID附件。,7170的原理结构图,二、分析流程,三、测光特点,其主要具有以下两个特点 1)反应过程的测光方式在3一l0分钟的反应时间内，不断地间隔一定时间测定一次反应液的吸光度。例如，在10min内测34次吸光度，侧出的各个吸光度的顺序叫做测光点。反应盘约18s转动1圈十4个杯子的距离。在此其间，所有160个杯子在横切光度计光路时的吸光度均被测试出来。,测试时相示意图,2)多波长光度计透镜聚焦来自光源的白色光，让其先通过反应比色杯，然后采用凹面光栅分光的后分光方式，分光后的各波长由12个固定的检测器同时接收，而对其中2个波长(A1、A2)的信号用2台放大器放大，并分别进行Log转换，求出吸光度差，即仪器采用双波长测光方式。,
