1、第八章：蛋白质组学,普通高等教育 “十三五”规划教材生物信息学 Bioinformatics,概念,蛋白质组学proteomics，是以蛋白质组为研究对象，研究细胞、组织或生物体蛋白质组成及其变化规律的科学。,第一节 蛋白质组学概述,一、蛋白质组学的产生,一切生命活动的实际实施者是蛋白质，蛋白质组学的目标是阐明蛋白质的结构、功能和蛋白质相互作用的机理,基因组学的成就,基因组学， genomics，研究生物基因组和如何利用基因的一门科学。 结构基因组学：全基因组测序 功能基因组学：基因功能鉴定,基因组学的局限,基因组学推测的大量蛋白功能未知 蛋白功能只能依靠同源基因分析类推和预测 一个基因并不代
2、表唯一一种蛋白 一个蛋白在转录、翻译、折叠、修饰中可能有无限变化 蛋白质无法PCR扩增，无法大规模自动化测序,核酸和蛋白的直观对比,MW：340D,MW：128D,70-90 NT MW：30KD,MW： 3.9-4.5MD,二、蛋白质组学的研究内容 表达蛋白质组学 对所有蛋白质进行分离、识别和定位，构建全蛋白质表达谱 功能蛋白质组学 研究蛋白质的翻译后修饰、结构、定位和表达与功能间的关系，构建蛋白质功能网络 1、蛋白质的分离与鉴定 2、蛋白质互作或蛋白质复合体研究 3、蛋白质翻译后修饰分析 4、蛋白质功能鉴定研究 5、蛋白质复合体整体结构分析,三、蛋白质组学研究的技术手段,X射线衍射 冷冻电
3、镜 核磁共振 质谱分析 双向电泳,第二节 蛋白质的大规模分离鉴定技术,一、蛋白质二维电泳-质谱技术 （一）蛋白质二维电泳技术2-DE,SDS-PAGE,IEF,蛋白质的结构,蛋白质是两性电解质，在不同PH下所带的电荷不同：等电聚焦IEF 蛋白质的分子量和分子形状不同，电泳迁移率不同：SDS-PAGE,2-DE数据库,蛋白质分离后可建立2-DE数据库，用于鉴定和比较,凝胶图像扫描 图像加工 斑点检测和定量 凝胶配比 数据分析 数据呈递 2-DE数据库建立,（二）质谱技术,2-DE分离的蛋白经切胶回收、酶解后进行质谱分析,Edman测序：将蛋白肽链逐步化学解聚，色谱鉴定酶解下来的氨基酸，反推氨基酸
4、序列,质谱测序：将蛋白肽链打碎电离，通过测定分子碎片的荷质比，推算出氨基酸组成和序列,蛋白切胶回收,胰蛋白酶酶解,肽段打质谱,比对,专家系统,蛋白质数据库,虚拟酶解,虚拟质谱,质谱原理,分子电离与荷质比,利用离子化的带电物体在磁场中的行为确定其分子量，利用这些质量信息对分子进行鉴定。,蛋白质谱,传统硬电离方式的缺点,高能电子轰击破坏化学键，产生复杂的分子碎片 一个蛋白质分子硬电离后可产生10000种以上的不同的信号峰，导致数据庞杂无法分析,软电离方式,极强激光脉冲激发释放大分子离子（MALDI） 极强电场推动大分子直接喷射（ESI）,蛋白质谱,质量分析器,三重四极杆质量分析器,蛋白质谱,数据解
5、析：肽质量指纹谱PMF,寡肽、氨基酸小分子,蛋白质,多肽,短肽,胰蛋白酶,串联质谱,PMF,2-DE,二、一维（二维）色谱-质谱技术（一）一维电泳（色谱）-质谱技术（HPLC-MS） 1、一维SDS-PAGE电泳（色谱）-质谱技术 2、一维IEF电泳-质谱技术,与2-DE的区别：采用自动化色谱仪分离蛋白质，不采用割胶回收的办法,1.在线脱气机 (G1322A/G1379A)2. 四元二元/单元泵 (G1311A/G1312A/G1310A)3. 自动进样器 (G1313A)4. 二极管阵列检测器 (G1315B)5. 可变波长紫外检测器（G1314A),（二）二维色谱-质谱技术（2-DE-HP
6、LC、MS）,三、荧光差异凝胶电泳技术2-DIGE,目的：显示不通样品中蛋白表达的差异，寻找差异表达蛋白,2-DIGE的定量原理,四、同位素亲和标签技术ICAT,2-DIGE的不足： 无法对分子量极高和极低、等电点极酸和极碱、含量极低的蛋白进行分离,ICAT的改进： 使用带有生物素和氘标记的ICAT标签标记蛋白分子，利用8道尔顿的分子量差实现相对定量,ICAT的目的：对一对蛋白样品进行定量和比较,五、蛋白质芯片技术,原理：与DNA芯片（DNA微阵列）的原理相类似，蛋白质芯片在固体支持物上采用了高密度的网格来固定整个蛋白质组，从而得以对特定样品中的表达蛋白进行大规模的分析。蛋白识别关系：抗原与抗
7、体蛋白质互作DNA-蛋白质互作 用途已知蛋白的定量未知蛋白的筛选 检测方法荧光扫描质谱检测,六、通过数据库搜索鉴定蛋白质ExPASYexpert protein analysis system 是由瑞士生物信息研究中心维护的一个整合全面的蛋白质组学信息的网络服务器，提供了众多的蛋白质序列、序列特征、结构、功能注释等方面信息与分析工具，在其蛋白质组学工具中就包含了Mascot、ProFound等多种与质谱数据相关的肽段质量指纹数据分析工具。,第三节 蛋白质的翻译后修饰,蛋白质的多样性不仅仅体现在氨基酸序列的变化，还在于翻译后的修饰常见的蛋白质翻译后修饰类型 磷酸化、糖基化、泛素化、乙酰化和硫酸盐
8、化 蛋白质的翻译后修饰通过改变分子大小、疏水性及蛋白质的整体构象等对蛋白质生物学功能的正常行使产生影响。,蛋白质翻译后修饰的鉴定方法 Post modification，PTM 一、基于序列的蛋白质翻译后修饰预测 二、在蛋白质组学分析中鉴定翻译后修饰,翻译后修饰检测原理：修饰使蛋白分子量增加，可利用高精度的MS分析检出这个变化。糖基化修饰的鉴定： 糖苷内切酶切断糖链，接质谱，比较PMF差异 用凝集素直接提取含糖链肽段，接质谱,蛋白质空间构象的鉴定HDX-MS,目的：了解小分子药物如何与目标蛋白质键合，以及执行表位定位 原理：溶液中的氘可替换生物分子主链中的酰胺氢，位于蛋白表面的交换率高于内部，
9、而MS会对此变化进行测量，最终获得的结果将揭示蛋白质结构的相关信息,第四节 蛋白质分选,概念： 除线粒体和植物叶绿体中能合成少量蛋白质外，绝大多数的蛋白质均在细胞质基质中的核糖体上开始合成!然后运至细胞的特定部位，这一过程称蛋白质分选（protein sorting），也被称为蛋白质定向转运（protein targeting）,输入细胞核：-Pro-Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val- 输出细胞核：-Leu-Ala-Leu-Lys-Leu-Ala-Gly-Leu-Asp-Ile- 输入线粒体：+H3N-Met-Leu-Ser-Leu-Arg-Gln-Ser-Ile-Arg
10、-Phe-Phe-Lys-Pro-Ala-Thr-Arg-Thr-Leu-Cys-Ser-Ser-Arg-Tyr-Leu-Leu- 输入质体：+H3N-Met-Val-Ala-Met-Ala-Met-Ala-Ser-Leu-Gln-Ser-Ser-Met-Ser-Ser-Leu-Ser-Leu-Ser-Ser-Asn-Ser-Phe-Leu- Gly-Gln-Pro-Leu-Ser-Pro-Ile-Thr-Leu-Ser-Pro-Phe-Leu- Gln-Gly- 输入过氧化物酶体：-Ser-Lys-Leu-COO- 输入内质网：+H3N-Met-Met-Ser-Phe-Val-Ser-Leu
11、-Leu-Leu-Val-Gly-Ile-Leu-Phe-Trp-Ala-Thr-Glu-Ala-Glu-Gln-Leu-Thr-Lys-Cys- Glu-Val-Phe-Gln- 返回内质网：-Lys-Asp-Glu-Leu-COO-（KDEL） 由质膜到内体：Tyr-X-X-,蛋白质分选的基本途径和类型,门控运输 跨膜运输 膜泡运输,信号肽 转运肽,亚细胞定位信号预测程序SignalPTargetPPSORT,第五节 蛋白质相互作用,一、利用实验鉴定蛋白质互作 通过实验鉴定蛋白质的相互作用主要包括遗传学方法、生物化学方法和生物物理方法，其结果可以在原子、互作双组分、互作多组分（复杂互作）及
12、细胞水平等4个方面得到表现。,研究方法：1、酵母双杂交（Y2H）,2、双分子荧光互补BiFC,3、免疫共沉淀Co-IP,二、蛋白质互作的预测蛋白质相互作用预测的生物信息学方法包括：1、基于基因组信息的方法 2、基于进化关系的方法 3、基于蛋白质序列的从头预测的方法 4、基于蛋白质三维结构信息的方法,（一）根据邻接基因进行互作蛋白的预测,这个方法的依据是，在细菌基因组中，功能相关的基因紧密连锁地存在于一个特定区域，构成一个操纵子，这种基因之间的邻接关系，在物种演化过程种具有保守性，可以作为基因产物之间功能关系的指示。,（二）根据基因、结构域融合事件进行互作蛋白的预测,由于在物种演化过程中发生了基
13、因融合事件，一个物种的两个(或多个)相互作用的蛋白，在另一个物种中融合成为一条多肽链， 因而基因融合事件可以作为蛋白质功能相关或相互作用的指示。,（三）根据系统发育谱进行互作蛋白的预测,功能相关的(functionally related)基因，在一组完全测序的基因组中预期同时存在或不存在，这种存在或不存在的模式(pattern)被称作系统发育谱；如果两个基因，它们的序列没有同源性，但它们的系统发育谱一致或相似。可以推断它们在功能上是相关的。,（四）利用镜像树进行互作蛋白预测,功能相关的蛋白质或同一个蛋白的域之间，受功能约束，其进化过程应该保持一致。通过构建和比较它们的系统发育树，如果发现树的
14、拓扑结构显示相似性，这种相似的树被称作镜像树，那么，可以推测建树基因的功能是相关的。,（五）根据序列的同源性进行互作蛋白的预测（六）利用Domain相互作用来预测蛋白相互作用（七）利用多种方法进行互作蛋白的预测,STRING数据库分析 （search tool for the retrieval of interacting gene/proteins）,https:/string-db.org/,蛋白质组学课程总结,蛋白质组学与基因组学研究手段的异同 蛋白质的分离与纯化 蛋白质的定性与定量 蛋白质序列和结构分析 蛋白质修饰的分析 蛋白质功能的分析和预测 蛋白质交互作用的检测和预测,实验课,PyMOL 蛋白质三维结构显示技术,
