1、第二讲 微生物的培养与应用,回扣基础 一、微生物的分离与培养 1无菌技术连一连,二、土壤中分解尿素的细菌的分离和计数 1分离原理：土壤中细菌之所以能分解 ，是由于它们体内能合成 ，这种物质在把尿素分解成无机物的过程中起到 作用。 2统计菌落数目：统计样品中的活菌一般用法。 3实验流程：土壤取样 微生物的培养与观察细菌的 。,尿素,脲酶,催化,稀释涂布平板,样品的稀释,计数,2筛选方法(1)方法：刚果红染色法，即通过是否产生 来筛选纤维素分解菌。(2)培养基：以 为唯一碳源的选择培养基。,透明圈,纤维素,3实验流程土壤取样：富含 的环境选择培养：用 培养，以增加纤维素分解菌的数量梯度稀释涂布平板
2、：将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上挑选产生透明圈的菌落：产生 的菌落周围出现透明圈,纤维素,选择培养基,纤维素酶,优化落实 一、微生物的分离与培养 1判一判(1)据物理状态的不同，培养基只有液体培养基和固体培养基两种类型。 ()(2)培养基中一般都含有水、碳源、氮源和无机盐四种成分。 ()(3)在配制培养基时，除满足营养需求外，还应考虑pH、O2及特殊营养物质的需求。 (),(4)实验操作过程应在酒精灯火焰附近进行。 () (5)用酒精擦拭双手的方法对操作者进行消毒。 () (6)无菌操作用到的玻璃器皿要用干热灭菌的方法彻底消灭其中的微生物，用酒精擦拭不能达到目的。 (),二、土壤中分解
3、尿素的细菌的分离和计数 2判一判(1)只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。 ()(2)筛选分解尿素的细菌应以尿素作为培养基中的唯一氮源。 ()(3)统计样品中的活菌一般用平板划线法。 ()(4)在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，若指示剂变蓝，则说明筛选到分解尿素的细菌。 (),三、分解纤维素的微生物的分离 3判一判(1)在琼脂固体培养基上长出的单个菌落含有多种细菌。()(2)在培养基中加入青霉素可抑制真菌而促进细菌生长。()(3)向液体培养基中通入氧气能促进破伤风杆菌的生长。()(4)在半固体培养基中接种细菌培养后可以观察其运动。(),关键点击 1培养基的种类(1)按物理状态分类,微
4、生物的实验室培养,(2)按功能分类,2.消毒和灭菌的比较,3.微生物的纯化培养平板划线法与稀释涂布平板法,误区警示(1)配制牛肉膏蛋白胨固体培养基的注意事项：倒平板的适宜温度是50 左右，温度过高会烫手，过低培养基又会凝固。平板需倒置，这样既可使培养基表面的水分更好地挥发，又可防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。(2)平板划线操作的注意事项：第一次划线及每次划线之前都需要灼烧接种环。灼烧接种环，待其冷却后才能伸入菌液，以免温度太高杀死菌种。划线时最后一区不要与第一区相连。划线用力大小要适当，防止用力过大将培养基划破。,【解题技巧】 1两种纯化细菌的方法的比较,2.培养基的营养构成(1)各种培
5、养基的具体配方不同，但一般都含有水、碳源、氮源和无机盐(2)不同培养基要满足不同微生物对pH、特殊营养物质及氧气的需求。,演练提升 1(2013江苏卷)某研究小组从有机废水中分离微生物用于废水处理。下列叙述正确的是 ( )A培养基分装到培养皿后进行灭菌B转换划线角度后需灼烧接种环再进行划线C接种后的培养皿须放在光照培养箱中培养D培养过程中每隔一周观察一次,B 在配制培养基的过程中要先灭菌后倒平板，A错误；转换划线角度后要对接种环进行灼烧灭菌再进行划线，B正确；接种后放置在恒温培养箱中进行培养，C错误；培养过程中一般要隔天观察一次，D错误。,2(2013北京海淀模拟)下列关于微生物培养的叙述，不
6、正确的是 ( )A获得纯净培养物的关键是防止外来杂菌入侵B高温灭菌的目的是杀死微生物的细胞、孢子、芽孢C划线分离可在培养基上获得均匀分布的单菌落D稀释涂布平板法易获得单菌落和计数活菌数目,C 获得纯净培养物的关键是防止外来杂菌入侵；高温灭菌的目的是杀死微生物的细胞、孢子、芽孢；稀释涂布平板法易获得单菌落和计数活菌数目；划线分离可在培养基上获得单菌落但不是均匀分布的。,关键点击 1筛选菌株的原理微生物的选择培养：在选择培养基的配方中，把尿素作为培养基中的唯一氮源，原则上只有能够利用尿素的微生物才能够生长。,分解尿素细菌的分离和计数,误区警示(1)在同一稀释度下，至少对3个平板进行重复计数，然后求
7、出平均值，并根据平板所对应的稀释度计算出样品中细菌的数目。如果某个平板的菌落数与其他差别甚远，说明该平板操作过程中出现失误，应舍弃。(2)统计的菌落往往比活菌的实际数目低。这是因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。因此，统计结果一般用菌落数而不是用活菌数来表示。,【解题技巧】 对照原则的运用(1)判断培养基中是否有杂菌污染，需将未接种的培养基同时进行培养。(2)判断选择培养基是否具有筛选作用，需设立牛肉膏蛋白胨培养基进行接种后培养，观察两种培养基上菌落数目，进行对比得出结论。,演练提升 3(2013广东深圳模拟)某学者欲研究被石油污染过的土壤中细菌数量，并从中筛选出能分解
8、石油的细菌。下列操作错误的是 ( )A利用平板划线法对细菌进行计数B以石油为唯一碳源的培养基筛选C采用稀释涂布平板法分离菌种D称取和稀释土壤时应在火焰旁A 平板划线法能对细菌分离纯化，但不能对细菌进行计数，稀释涂布平板法可以分离菌种还可进行计数，A错误。,4(2013上海卷)回答下列关于微生物的问题。阿拉伯胶是一种多糖，研究者从某地合欢树下距离地表深1015 cm处的土样中初筛到能合成阿拉伯胶降解酶的菌株SM01，以下为该菌株的鉴定过程。(1)为获得单菌落，可采用_法将初筛菌液接种在_培养基上。,(2)SM01的菌落为粉白色，菌落初期呈突起絮状，在显微镜下观察到，菌丝白色致密，且有分生孢子，细
9、胞核直径约 1 m，初步推测为真菌，则其特征中，最能说明SM01是真菌的是_。 A菌落初期呈突起絮状 B菌落粉白色 C有菌丝，白色致密 D有细胞核，且有分生孢子 (3)SM01还一定具有的结构有_(多选)。 A细胞膜 B核糖体 C拟核 D荚膜 E芽孢 F菌盖,(4)下表中培养液pH均为60，若对SM01中阿拉伯胶降解酶的活力进行测定，则应选用表中的_培养液，针对不选用的其他培养液，分别说明原因：_；_；_。 表 实验用培养液配方,解析 平板划线法是将不同稀释度的菌液通过接种环在固体培养基表面连续划线的操作，稀释涂布平板法是将不同稀释度的菌液倒入液体培养基进行培养，这两种方法都可以获得单个菌落。
10、 答案 (1)划线法/涂布法 固体 (2)D (3)A、B (4)D A培养液缺少氮源，SM01不能很好生长 B培养液缺少氮源，SM01不能很好生长；且有阿拉伯胶酶，会影响对SM01自身产生的酶活力的测定结果 C培养液缺乏阿拉伯胶酶催化底物阿拉伯胶，会影响SM01的生长，也无法对阿拉伯胶酶活力进行测定,关键点击 1选择培养基与鉴别培养基,分解纤维素的微生物的分离,2两种刚果红染色法的比较,3分离纤维素分解菌(1)分离纤维素分解菌的实验中先用选择培养基，再用鉴别培养基。选择培养基为液体培养基，以纤维素作为碳源和能源的微生物可以正常生长，而其他绝大多数微生物不能正常生长；因培养基中无凝固剂，为液体
11、培养基，利用液体培养基能使营养成分充分消耗，以增加纤维素分解菌的浓度。(2)鉴别培养基含琼脂，为固体培养基，因为要在培养基上形成我们肉眼可见的菌落。刚果红染色法应用的就是此培养基。,误区警示关于选择培养基(1)在培养基中加入某种化学物质。例如，加入青霉素可以分离出酵母菌和霉菌；加入高浓度的食盐可以得到金黄色葡萄球菌。(2)改变培养基中的营养成分。例如缺乏氮源时可以分离出固氮微生物；石油作为唯一碳源时，可以分离出能消除石油污染的微生物。(3)改变微生物的培养条件。例如，将培养基放在高温环境下培养，可以得到耐高温的微生物。,【解题技巧】(1)土壤中分解尿素的细菌：选择培养基的成分：尿素作为唯一的氮
12、源鉴定方法：在培养基中加入酚红指示剂，若指示剂变红，pH升高，说明细菌能分解尿素。(2)分解纤维素的微生物：选择培养基的成分：纤维素作为唯一的碳源鉴定方法：刚果红染色法，即刚果红与纤维素形成红色复合物，当纤维素被分解后，培养基出现以纤维素分解菌为中心的透明圈。,演练提升 5下表为某培养基的配方，有关叙述正确的是 ( ),A能在此培养基上生长的大肠杆菌，拟核上有抗青霉素的基因 B此培养基是天然鉴别培养基 C此培养基可以用来检测自来水中细菌含量是否符合饮用水标准 D此培养基可以用于选育转基因大肠杆菌菌种的基因工程的操作过程中,D 此表表示鉴定大肠杆菌的合成培养基。抗性基因一般位于大肠杆菌的质粒上，
13、而不是拟核上；此培养基只能用来检测自来水中大肠杆菌含量是否符合饮用水标准。,6纤维素分解菌能够产生纤维素酶分解纤维素。回答下列问题：,(1)在筛选纤维素分解菌的过程中，通常用_染色法，这种方法能够通过颜色反应直接对纤维素分解菌进行筛选。甲同学在实验时得到了如图所示的结果，则纤维素分解菌位于 ( ) A B C D,(2)乙同学打算从牛胃中分离纤维素分解菌并计数，与分离醋酸菌相比，进行培养时除了营养不同外，最主要的实验条件差别是_。 该同学采用活菌计数法统计的菌落数目往往比活菌的实际数目_。,(3)丙同学在提取和分离纤维素酶的过程中，为了抵制外界酸和碱对酶活性的影响，采取的措施是向提取液和分离液
14、中添加_。若探究纤维素酶活性的最适温度，如何设置对照？_。,解析 (1)刚果红与纤维素形成的红色复合物在纤维素被分解后将不再形成，则在培养基上出现以纤维素分解菌为中心的透明圈。(2)牛胃是一个厌氧的环境，所以其中的纤维素分解菌与需氧的醋酸菌培养条件有所不同。因是活菌计数法，所以部分死亡菌无法计数。另外当两个或多个细菌连在一起时平板上只观察到一个菌落，所以偏小。(3)探究最适温度可设置一系列的温度梯度相互对照，其他无关变量要适宜。 答案 (1)刚果红 A (2)保证无氧环境 小(低) (3)缓冲溶液 不同的温度梯度之间相互对照,高考回顾 2013江苏卷、上海卷、四川卷、新课标卷卷 2012浙江卷
15、、北京卷 2011天津卷、重庆卷,典题例析 考向一 微生物的实验室培养(2013四川卷)普通酵母菌直接利用淀粉的能力很弱，有人将地衣芽胞杆菌的淀粉酶基因转入酵母菌中，经筛选得到了可高效利用淀粉的工程酵母菌菌种(过程如图甲所示)。,(1)图甲中，过程需要的酶有_。为达到筛选目的，平板内的固体培养基应以_作为唯一碳源。 、过程需要重复几次，目的是_ _。 (2)某同学尝试过程的操作，其中一个平板经培养后的菌落分布如图乙所示。该同学的接种方法是_；推测该同学接种时可能的操作失误是_。,(3)以淀粉为原料，用工程酵母菌和普通酵母菌在相同的适宜条件下密闭发酵，接种_菌的发酵罐需要先排气，其原因是_。 (
16、4)用凝胶色谱法分离淀粉酶时，在色谱柱中移动速度较慢的蛋白质，相对分子质量较_。,【解析】 命题思路本题借“筛选可高效利用淀粉的工程酵母菌菌种”创设情境，实际考查生物技术实践中的微生物的实验室培养和蛋白质的提取和分离两个实验的原理或方法，属于选修部分的基础立意题。相对灵活的是(3)题，关键是审出“先排气”的准确含义，是指“发酵过程中首先排气”的意思，以此可知是高速利用淀粉的工程酵母菌，该酵母菌发酵时产生CO2的速度也很快。,【答案】 (1)限制性内切酶和DNA连接酶 淀粉 筛选出真正高效利用淀粉的工程酵母菌菌种 (2)稀释涂布法 涂布不均匀 (3)工程酵母 工程酵母菌利用淀粉的速度很快，发酵产
17、生CO2的速度也很快 (4)小,考向二 分解尿素细菌的分离和计数(2013郑州模拟)请回答下列有关微生物的一些问题。(1)微生物的分布：微生物主要分布在富含_的土壤表层；不同微生物对pH的要求不同，细菌常生活在酸碱度_的潮湿土壤中。,(2)微生物的消毒和灭菌：在菊花组织培养中，对外植体常用酒精和_进行消毒。在微生物培养中，对培养基常用_方法进行灭菌。静止空气中的细菌可用紫外线杀灭，其原因是紫外线能使蛋白质变性，还能_。如果要检测灭菌是否彻底，可以采用的方法是：_ _。 (3)微生物的应用：在葡萄酒的自然发酵过程中，运用吸附在葡萄皮上的野生酵母菌发酵产生酒精，请写出该过程的化学反应式：_。在果醋
18、制作时，运用醋酸菌在_和糖源充足时，将糖分解成醋酸。,(4)微生物的接种：微生物接种的方法很多，最常用的是_和_。 (5)微生物的计数：根据培养基上出现的菌落数目和稀释倍数计算得出细菌数目往往比实际的数目低，原因是_ _。 (6)微生物的鉴定：为检测尿素分解菌的存在与否，在以尿素为唯一氮源的_(选择、鉴别)培养基中加入_指示剂，如果存在尿素分解菌，则指示剂将变_色。,【解析】 (1)微生物主要分布在有机质丰富的土壤表层，细菌常生活在酸碱度接近中性的潮湿土壤中。(2)植物组织培养时，对外植体常用酒精和氯化汞消毒，对培养基常用高压蒸汽灭菌法灭菌；紫外线能使蛋白质变性，还能损伤DNA的结构；可通过在
19、适宜的温度下放置灭菌过的培养基看其是否有菌落产生来确定培养基灭菌是否彻底。(3)醋酸菌为需氧型生物。(4)最常用的微生物接种方法有平板划线法和稀释涂布平板法。(5)因一个菌落可由多个连在一起的细菌形成，所以计算得出的细菌数一般低于实际数目。(6)用选择培养基筛选目的菌，加入酚红指示剂检测尿素分解菌，若存在尿素分解菌，指示剂变红色。,(2013新课标卷)临床试用抗生素前，有时需要做细菌耐药实验。实验时，首先要从病人身上获取少量样本，然后按照一定的实验步骤操作，以确定某致病菌对不同抗生素的敏感性。,回答下列问题： (1)为了从样本中获取致病菌菌落，可用_法或_法将样本借种于固体培养基表面，经过选择
20、培养、鉴别等步骤获得。 (2)取该单菌落适当稀释，用_法接种于固体培养基表面，在37 培养箱中培养24 h，使其均匀生长，布满平板。,(3)为了检测该致病菌对于抗生素的敏感性，将分别含有A，B，C，D四种抗生素的滤纸片均匀置于该平板上的不同位置，培养一段时间后，含A的滤纸片周围出现透明圈，说明该致病菌对抗生素A_；含B的滤纸片周围没有出现透明圈，说明该致病菌对抗生素B_；含C的滤纸片周围的透明圈比含A的小，说明_；含D的滤纸片周围的透明圈也比含A的小，且透明圈中出现了一个菌落，在排除杂菌污染的情况下，此菌落很可能是抗生素D的_。 (4)根据上述实验结果，为达到抗菌目的，最好应选择抗生素_。,【解析】 本题考查微生物的培养和应用。 (1)分离菌落常用稀释涂布平板法或划线涂布法。 (2)取该单菌落适当稀释，用涂布法接种于固体培养基表面，适宜温度培养。 (3)含抗生素的滤纸片周围出现透明圈，说明该致病菌对该抗生素有敏感性，周围没有透明圈的说明该抗生素不具有敏感性。透明圈越大的敏感性越强。 (4)实验结果抗生素A对该致病菌的作用最好。,【答案】 (1)划线 稀释涂布(或涂布) (2)涂布 (3)敏感 不敏感 该致病菌对C的敏感性比对A弱 耐药菌 (4)A,课时作业(三十三),
