1、邓小园 基础医学院生物化学与分子生物学教研室,实验目的,学习利用SDS-PAGE测蛋白质的分子量。,实验原理,电泳是指带电粒子在电场的作用下,发生定向泳动的现象。 电泳技术指利用电泳现象对混合物进行分离分析的技术。,蛋白质N端游离氨基,C端游离羧基以及侧链上一些基团在一定pH条件带电荷, 因此可以用电泳技术分离和鉴定,COO- COO- COOH + H+ + H+ Pr Pr Pr + OH- + OH- NH2 NH3+ NH3+PHPI PH=PI PHPI,电泳使用不同的支持介质,早期有滤纸、玻璃珠、淀粉粒、纤维素粉、海砂、海绵、聚氯乙烯树脂;以后有淀粉凝胶、琼脂凝胶、醋酸纤维素膜,现
2、在则多用聚丙烯酰胺(PAGE)和琼脂糖凝胶。,聚丙烯酰胺凝胶电泳基本原理:聚丙稀酰胺是由丙稀酰胺和N,N-亚甲基双丙稀酰胺经共聚合而成。此聚合过程是由四甲基乙二胺(TEMED)和过硫酸胺(AP)激发的。被激活的单体和未被激活的单体开始了多聚链的延伸,正在延伸的多聚链也可以随机地接上双丙稀酰胺,使多聚链交叉互连成为网状立体结构,最终多聚链聚合成凝胶状。,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS, SDS能断裂分子内和分子间氢键,破坏蛋白质的二级和三级结构,强还原剂能使半胱氨酸之间的二硫键断裂,蛋白质在一定浓度的含有强还原剂的SDS溶液中,与SDS分子按比例结合,形成带负电荷
3、的SDS-蛋白质复合物。,这种复合物由于结合大量的SDS,使蛋白质丧失了原有的电荷状态形成仅保持原有分子大小为特征的负离子团块,从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异,由于SDS与蛋白质的结合是按重量成比例的,因此在进行电泳时,蛋白质分子的迁移速度取决于分子大小,影响电泳速度的因素,样品本身:带电量,分子大小,形状 电场强度:电压 电泳介质的pH和离子强度 凝胶网络的孔径,实验材料和仪器,丙烯酰胺丙烯酰胺是一种白色晶体化学物质,是生产聚丙烯酰胺的原料,易溶于水。具有毒性作用:刺激皮肤和神经系统,甲叉双丙烯酰胺交联剂甲叉双丙烯酰胺,是一种白色晶体粉末,无味,吸湿性极小。遇高温或强光则自
4、交联,微溶于水、乙醇。,过硫酸铵(AP)过硫酸铵是一种白色、无味晶体,常作强氧化剂使用,也可用作单体聚合引发剂,极易潮解。过硫酸铵提供驱动丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合所必需的自由基。,四甲基二乙胺(TEMED)无色液体,有异味,对光敏感,应避光保存。丙烯酰胺聚合成凝胶的催化剂,十二烷基硫酸钠(SDS)SDS是一种阴离子去污剂,带有大量负电荷,当其与蛋白质结合时,所带的负电荷大大超过了蛋白质原有的负电荷,因而消除或掩盖了不同种类蛋白质间原有电荷的差异,使蛋白质均带有相同密度的负电荷,因而可利用分子量差异将各种蛋白质分开。,-巯基乙醇有特殊气味,可将蛋白质的二硫键断裂,形成单链多肽,保证结合SDS后,
5、单位肽链长度带相同点荷,考马斯亮蓝蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡,完成反应十分迅速;其结合物在室温下1h内保持稳定,是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。,实验器材垂直板电泳装置直流稳压电源移液管滤纸 微量注射器大培养皿,实验步骤,1.试剂配制实验管理人员,已配好,无需配制,具体配制方法,参考教材P79-P80,2.将玻璃板用蒸馏水洗净晾干,把玻璃板在灌胶支架上固定好,3.配制灌注聚丙烯酰胺凝胶-10%分离胶分离胶缓冲液 2.5ml 蒸馏水 12.25ml 30%分离胶储存液 4.9ml 10%AP 100l SDS 200l TEMED 50l,按比例配好分离胶
6、,用移液管快速加入,直至距样品模板梳齿下缘1cm,之后加少许蒸馏水约34mm。凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面。,加水膜,灌注分离胶,水封的目的是为了使分离胶上延平直,分离胶 (分子筛效应)分子量或分子大小和形状不同的蛋白质通过一定孔径分离胶时,受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率,这就是分子筛效应。分离胶为小孔胶,缓冲液pH8.8。当样品进入分离胶,凝胶孔径变小,分子量小,阻力小,移动快;分子量大,阻力大,移动慢。,4.配制灌注聚丙烯酰胺凝胶-5%浓缩胶浓缩胶缓冲液 1.25ml 蒸馏水 6.8ml 30%浓缩胶储存液 1.7ml 10%AP 100l SDS 100l TEME
7、D 50l,5.倒出水并用滤纸把剩余的水分吸干,按比例配好浓缩胶,连续平稳加入浓缩胶至离边缘5mm处。,灌注浓缩胶,6.迅速插入样梳,静置40分钟,根据需要插入不同的梳子,30min左右加电泳缓冲液,再拔梳子!,浓缩胶浓缩胶为大孔胶,缓冲液pH6.8.在电泳槽内充以Tris甘氨酸缓冲液(pH8.3),这样便形成了凝胶孔径和缓冲液pH值的不连续性。在浓缩胶中 HCl几乎全部解离为Cl-,但只有极少部分甘氨酸解离为H2NCH2COO-。蛋白质的等电点一般在pH5左右,在此条件下其解离度在HCl和甘氨酸之间。当电泳系统通电后,这3种离子同向阳极移动。其有效泳动率依次为Cl-蛋白质 H2NCH2COO
8、- ,故Cl-称为快离子,而H2NCH2COO-称为慢离子。,浓缩胶电泳开始后,快离子在前,在它后面形成离子浓度低的区域即低电导区。电导与电压梯度成反比,所以低电导区有较高的电压梯度。这种高电压梯度使蛋白质和慢离子在快离子后面加速移动。在快离子和慢离子之间形成一个稳定而不断向阳极移动的界面。由于蛋白质的有效移动率恰好介于快慢离子之间,因此蛋白质离子就集聚在快慢离子之间被浓缩成条狭窄带。这种浓缩效应可使蛋白质浓缩数百倍。,7.在上槽内加入缓冲液,拔出样梳后, 整理上样槽,拔梳子后形成点样孔,孔周围有膜,用针拨开,8.点样。 分别取待测蛋白100l,再分别加入900l 样品缓冲液,混匀。取10l上
9、样。注意加标志蛋白质。,9.电泳槽中加入缓冲液,接通电源,进行电泳,开始电压恒定在4060V,当进入分离胶后改为120V,溴酚蓝距凝胶边缘约0.51cm时,停止电泳,断开电源。,10.凝胶板剥离与染色:电泳结束后,撬开玻璃板,将凝胶放在大培养皿内,加入染色液,染色1小时左右。,11. 脱色:染色后的凝胶板用蒸馏水漂洗数次,再用脱色液脱色,直到蛋白质区带清晰。,注意事项,制备凝胶应选用高纯度的试剂 固定玻璃板时,两边用力一定要均匀,防止夹坏玻璃板 凝胶配制过程要迅速, 催化剂TEMED要在注胶前再加入,否则凝结无法注胶.注胶过程最好一次性完成,避免产生气泡.,样梳需一次平稳插入,梳口处不得有气泡
10、,梳底需水平 取胶时应小心,防止损坏凝胶。做好标记,以便染色、褪色后仍可辨认。,SDS-PAGE应用,SDS-PAGE因易于操作,而具有广泛的用途,是许多研究领域的重要的分析技术。 1. 蛋白质纯度分析; 2. 蛋白质分析量的测定,根据迁移率大小测定蛋白质亚基的分子量; 3. 蛋白质浓度的测定;,4. 蛋白质水解的分析; 5. 免疫沉淀蛋白的鉴定; 6. 免疫印迹的第一步; 7. 蛋白质修饰的鉴定; 8. 分离和浓缩用于产生抗体的抗原; 9. 分离放射性标记的蛋白质; 10. 显示小分子多肽。,SDS-PAGE电泳,胶浓度与分子量关系,实验室常用的分离胶浓度为8-12%: 丙烯酰胺浓度(%) 线性分离范围(kD) 15 1243 10 1668 7.5 3694 5.0 57212,思考题,在PAGE中,当分离胶加完后,需在其上加一层水,为什么? 在PAGE中,分离胶与浓缩胶中均含有TEMED和AP,试述其作用? 推测凝胶不聚合的原因。,