1、 ICS：65.020.30备案号：四 川 省 地 方 标 准DB51/T 6592007牛奶中青霉素残留检测方法酶联免疫吸附测定(ELISA)法Determination of Residues Penicillins in Milk by Enzyme-linked Immunosorbent Assay2007-03-17 发布 2007-05-01 实施四 川 省 质 量 技 术 监 督 局 发 布DBDB51/T6592007I目 次前言.II1 范围32 规范性引用文件33 制样33.1 样品的制备 33.2 样品的保存 34 测定方法34.1 方法提要或原理 34.2 试剂和材料
2、 34.3 仪器和设备 44.4 测定步骤 44.5 结果计算和表述 45 检测方法灵敏度、准确度、精密度55.1 灵敏度 55.2 准确度 55.3 精密度 5DB51/T 6592007II前 言本标准按 GB/T1.12000 标准的结构和编写规则进行编制本标准由四川省畜牧食品局提出并归口本标准由四川省质量技术监督局批准本标准起草单位：四川省兽药残留监控中心、四川省兽药监察所本标准主要起草人：杨松沛、彭莉、岳秀英、熊浩山、官艳丽、王海波、吴晓岚DB51/T65920073牛奶中青霉素残留检测方法酶联免疫吸附测定(ELISA)法1 范围本标准规定了牛奶中青霉素残留量检测的制样和酶联免疫吸附
3、测定法。本标准适用于牛奶中青霉素的残留量的快速筛选检测。对于可疑样品需用确证法确认。2 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T 1.1-2000 标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写规则 (ISO/IEC Directives, Part 3, 1997, Rules for the structure and drafting of Internati
4、onal Standards, NEQ)GB/T 6682-1992 分析实验室用水规则和试验方法农牧发20031号 兽药残留试验技术规范（试行）3 制样3.1 样品的制备 取适量新鲜的空白或供试牛奶，涡旋混合使之均匀，密封。3.2 样品的保存-20以下冰箱中贮存备用。4 测定方法4.1 方法提要或原理牛奶中残留的青霉素用PB缓冲液提取，酶联免疫吸附测定法测定,其基本原理是抗原抗体反应。酶标板的微孔包被有偶联抗原，标样或样品中的青霉素与酶标记抗原竞争青霉素特异性抗体。通过洗涤除去没有与特异性抗体结合的酶标记抗原。加入底物液，结合到板上的酶标记物将底物转化为有色产物。加入终止液，在450nm处测
5、定吸光度值，吸光度值与试样中青霉素浓度呈反比。 4.2 试剂和材料以下所用的试剂，除特别注明者外均为分析纯试剂；水为符合GB/T 6682规定的二级水。 4.2.1 正己烷4.2.2 PB 缓冲液的配制 称取 51.6gNa2HPO4.12H2O 和 8.7gNaH2PO4.2H2O，用 1000mL 水溶解（pH=7.2）即可。4.2.3 青霉素试剂盒（采用官方备案的试剂盒）4.2.6.1 青霉素系列标准溶液 0g/mL 、0.1g/mL、0.3g/ml、0.9 g/mL、2.7g/mL、8.1g/mL4.2.6.2 酶标板 8 条12 孔，包被有偶联抗原4.2.6.3 酶标记物4.2.6.
6、4 青霉素抗体 4.2.6.5 底物溶液A4.2.6.6 底物溶液BDB51/T 659200744.2.6.7 浓缩洗涤液 临用前用水稀释二十倍作为洗涤液4.2.6.8 终止溶液4.3 仪器和设备4.3.1 酶标仪（配备 450nm 滤光片）4.3.2 天平 感量 0.01g4.3.3 分析天平 感量 0.00001g4.3.4 漩涡混合仪4.3.5 振荡器4.3.6 组织匀浆机4.3.7 冷冻离心机4.3.8 氮吹仪4.3.9 离心管 20mL 4.3.10 微量移液器 单道 20L，50L，100 L，1000 L；多道 50250L 4.4 测定步骤4.4.1 试料的制备试料的制备包括
7、：取混匀后的供试样品,作为供试试料。取混匀后的空白样品,作为空白试料。取混匀后空白样品,添加适宜浓度的标准溶液，作为空白添加试料。4.4.2 提取和净化精密量取1mL试料于离心管中，精密加入4mL0.1moL/LPB缓冲液(pH=7.2)，充分混合后加入5mL正己烷振荡提取10min，于8000r/min15离心10min,取出下层液体50L用于分析。4.4.3 样品测定程序（2026条件下操作）4.4.3.1 使用前将试剂盒置于室温（2026）平衡 30min 以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀。取出需要数量的酶标板微孔条插入框架中，将不用的微孔条放入自封袋，保存于 28。将样品和标准品对
8、应微孔按序编号，每个样品和标准品均需做两个平行实验。4.4.3.2 加入 50 L 标准溶液或试样溶液到微孔底部，每孔再加入 50L 青霉素抗体溶液，轻轻振荡混匀，用盖板膜封板，37环境中反应 30min。4.4.3.3 倒出孔中液体，将酶标板倒置在吸水纸上拍打，去除孔中液体。每孔加入 250L 洗涤液，10s后倒出孔中液体，用吸水纸拍干，如此重复操作共洗板 5 次。4.4.3.4 加入 100L 酶标记物到微孔底部，用盖板膜封板，37环境中反应 30min。取出酶标板，如前述洗板 5 次。4.4.3.5 加入 50L 底物溶液 A 和 50L 底物溶液 B 到微孔中，轻轻振荡混匀 37环境避
9、光显色15min。4.4.3.6 加入 50L 终止液到微孔中，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于 450nm 处，测定每孔吸光度值（OD值） 。4.5 结果计算和表述所获得的标准或样品吸光度值的平均值除以第一个标准（0 标准）吸光度值的平均值再乘以100%，得到以百分比给出的吸光度值，以式（1.1）表示： 百分吸光度值= 100% 1.1 式中:B为标准溶液或供试样品的平均吸光度值；BB0DB51/T65920075B0为零浓度标准溶液的平均吸光度值。以 X 轴为标准溶液中青霉素浓度(g/L)的自然对数，Y 轴为百分吸光度值，在半对数坐标纸上绘制标准曲线图。相对应的供试样品的浓度（g/L）可以从标准曲线上查出。也可以求出回归曲线的方程，计算未知样品中青霉素的浓度。如果有专业计算机软件可直接求出供试样中青霉素的浓度。注：检测结果小于2.0g/L时，可判为未检出，大于2.0g/ L时，判为可疑，需用确证法确认。5 检测方法灵敏度、准确度、精密度5.1 灵敏度本方法在牛奶中的最低检出限为2.0g/L。5.2 准确度本方法在牛奶中2.0g/L6.0g/L添加浓度的回收率为60.0%120.0%。5.3 精密度本方法的批内变异系数CV14.0%；批间变异系数CV15.0%。
