1、蛋白质化学,Structure and Function of Protein,一、什么是蛋白质?,蛋白质(protein)是由许多氨基酸(amino acids)残基通过肽键(peptide bond)构成多肽链，再由一条或一条以上的多肽链按一定的方式组合成具有特定结构的生物活性分子。,1）生物催化作用酶,二、 蛋白质具有重要的生物学功能,几乎所有的酶都是蛋白质,2）调控作用,参与基因调控：组蛋白、非组蛋白等 参与代谢调控：如激素或生长因子等,3）运动与支持,运动：动物肌肉收缩、细菌的鞭毛运动 机体的结构蛋白：头发、骨骼、牙齿、肌肉等,4）运输与贮存,血红蛋白 运输氧 铜蓝蛋白 运输铜 铁蛋
2、白 贮存铁,5）免疫保护,抗原抗体反应 凝血机制,另外，蛋白质在遗传信息的控制、细胞膜的通透性，以及高等动物的记忆、识别机构等方面起到重要作用, 组成蛋白质的元素,有些蛋白质还含有少量的P、Fe、Cu、Mn、Zn、Se、I等。,C 50 55 % H 6 7 % O 19 24 % N 13 19 % S 0 4 %,主要元素组成,三、 蛋白质的分子组成,各种蛋白质的含氮量很接近，平均为16。,由于体内的含氮物质以蛋白质为主，因此，只要测定生物样品中的含氮量，就可以根据以下公式推算出蛋白质的大致含量：,100克样品中蛋白质的含量 ( g % ) = 每克样品含氮克数 6.25100,1/16%
3、, 蛋白质元素组成的特点,凯氏定氮法：,四、蛋白质的分类,* 根据蛋白质组成成分,* 根据蛋白质形状,纤维状蛋白质：多为结构蛋白，难溶于水,球状蛋白质：多数具有生理活性，多数可溶如酶、免疫球蛋白等等,* 根据蛋白质来源,微生物蛋白质,一、氨基酸 组成蛋白质的基本单位,存在自然界中的氨基酸有300余种，但组成人体蛋白质的基本氨基酸仅有20种,氨基酸的通式：,氨基酸的结构通式：19种氨基酸具有一级氨基（-NH3+）和羧基（-COOH）结合到碳原子（C），同时结合到（C）上的是H原子和各种侧链（R）；Pro具有二级氨基（-亚氨基酸）,非极性疏水性氨基酸 极性中性氨基酸 酸性氨基酸 碱性氨基酸,（二）
4、氨基酸的分类,分类依据 ：R侧链基团的结构及理化性质的不同,甘氨酸 glycine Gly G 5.97,丙氨酸 alanine Ala A 6.00,缬氨酸 valine Val V 5.96,亮氨酸 leucine Leu L 5.98,异亮氨酸 isoleucine Ile I 6.02,苯丙氨酸 phenylalanine Phe F 5.48,脯氨酸 proline Pro P 6.30,非极性疏水性氨基酸,色氨酸 tryptophan Try W 5.89,丝氨酸 serine Ser S 5.68,酪氨酸 tyrosine Try Y 5.66,半胱氨酸 cysteine Cys
5、 C 5.07,蛋氨酸 methionine Met M 5.74,天冬酰胺 asparagine Asn N 5.41,谷氨酰胺 glutamine Gln Q 5.65,苏氨酸 threonine Thr T 5.60,2. 极性中性氨基酸,侧链基团在中性溶液中解离后带负电荷。(天冬氨酸、谷氨酸）,3. 酸性氨基酸 Glu，Asp,4. 碱性氨基酸 His，Arg，Lys,侧链基团在中性溶液中解离后带正电荷。(赖氨酸、精氨酸、组氨酸）,另外：,1、蛋白质中的很多氨基酸是经过加工修饰的修饰氨基酸如：脯氨酸 羟基化 成 羟脯氨酸赖氨酸 羟基化 成 羟赖氨酸 2、半胱氨酸Cys常以胱氨酸的形式存
6、在,（三）氨基酸的理化性质,1. 两性解离及等电点,氨基酸是两性电解质，其解离程度取决于所处溶液的酸碱度。,等电点(isoelectric point, pI) 等电点：在某一pH的溶液中，氨基酸解离成阳离子和阴离子的趋势及程度相等，成为兼性离子，呈电中性。此时溶液的pH值称为该氨基酸的等电点。 氨基酸等电点的特点：净电荷数等于零，电导性最差、在电场中不移动（电泳迁移率最小）；此时氨基酸的溶解度最小（最不稳定）。 氨基酸等电点的确定：酸碱滴定：等电点等于两性离子两侧pK值的算术平均数。紫外分光光度法：色氨酸和酪氨酸的最大吸收峰在 280 nm 附近。大多数蛋白质含有这两种氨基酸残基，所以测定蛋
7、白质溶液280nm的光吸收值是分析溶液中蛋白质含量的快速简便的方法。,(1) 茚三酮反应：在弱酸性溶液，氨基酸可与茚三酮共热缩合产生蓝紫色化合物，最大吸收峰在570nm。该反应可作为蛋白质定性、定量分析的基础。 (2) 甲醛反应： (3) 2,4-二硝基氟苯（DNFB）反应：在弱碱性溶液中，氨基酸与DNFB反应产生黄色化合物。 (4) 异硫氰酸苯酯（PITC）反应：在弱碱性条件下，氨基酸与PITC反应产生无色化合物，再用层析法加以分离鉴定（Edman用于鉴定多肽或蛋白质的N-末端氨基酸）。,2氨基酸的化学性质,(1) 与印三酮的反应,(2) 与甲醛的反应,OH-,中和滴定,取代DNFB测定蛋白
8、质N端氨基酸，灵敏度高,（3）与2,4-二硝基氟苯(DNFB)的反应,（4）与异硫氰酸苯酯（PITC）的反应,pH8.3,无水HF,重复测定多肽链N端氨基酸排列顺序，设计出“多肽顺序自动分析仪”,肽(peptide),肽是由氨基酸通过肽键缩合而形成的化合物。,肽键(peptide bond)：是由一个氨基酸的-羧基与另一个氨基酸的-氨基脱水缩合而形成的化学键，本质为酰胺键。 氨基酸残基(residue) :肽链中的氨基酸分子因为脱水缩合而基团不全，被称为氨基酸残基。,N 末端：多肽链中有自由氨基的一端 C 末端：多肽链中有自由羧基的一端,多肽链有方向性：,N端,C端,牛核糖核酸酶,N端,C端,
9、蛋白质的结构 The Molecular Structure of Protein,蛋白质是由许多氨基酸单位通过肽键连接起来的，具有特定分子结构的高分子化合物。,蛋白质的分子结构包括 一级结构(primary structure) 二级结构(secondary structure) 三级结构(tertiary structure) 四级结构(quaternary structure),定义：蛋白质的一级结构指多肽链中氨基酸的排列顺序。由N指向C。(包括蛋白质分子中所有的二硫键的位置）,一、蛋白质的一级结构,主要的维系键：肽键，有些蛋白质还包括二硫键。,一级结构是蛋白质空间构象和特异生物学功能的
10、基础。但不是决定蛋白质空间构象的唯一因素,二、蛋白质的二级结构,氢键：由电负性较强的原子与氢形成的基团如NH和OH具有很大偶极距，成键电子云分布偏向电负性大的原子核，因此氢原子核周围的电子分布就少，正电荷的氢核（质子）就在外侧裸露。这一正电荷氢核遇到另一个电负性强的原子时，产生静电吸引,x H y,定义：蛋白质分子中某一段肽链的局部空间结构，即该段肽链主链骨架原子的相对空间位置，并不涉及氨基酸残基侧链的构象 主要的维系键： 氢键,肽键平面由于肽键具有部分双键的性质，使参与肽键构成的六个原子被束缚在同一平面上，这一平面称为肽键平面或肽单元。,（一）肽单元,由于-碳原子与其他原子之间均形成单键，因
11、此两相邻的肽键平面可以作相对旋转,(二）蛋白质二级结构的主要形式,-螺旋 ( -helix ) -折叠 ( -pleated sheet )-转角 ( -turn )无规卷曲 ( random coil ),1. -螺旋：,2. -折叠,-折叠是由若干肽段或肽链排列起来所形成的扇面状片层构象,3. -转角,是多肽链180回折部分所形成的一种二级结构,无规卷曲是用来阐述没有确定规律性的那部分肽链结构。,4. 无规卷曲,三、蛋白质的三级结构,整条肽链中全部氨基酸残基的相对空间位置。即肽链中所有原子在三维空间的排布位置。 三级结构是蛋白质结构的基础 对于单一多肽链的蛋白质，三级结构是它的最高级结构，
12、只有具有完整的三级结构，才具有全部的生物学功能,（一） 定义,肌红蛋白 (Mb),为单肽蛋白质，含有153个氨基酸，有8个螺旋区,（二）结构域,大分子蛋白质的三级结构常可分割成一个或数个球状或纤维状的区域，折叠得较为紧密，各行使其功能，称为结构域(domain) 。,四、蛋白质的四级结构,亚基(subunit)有些蛋白质分子含有二条或多条多肽链，每一条多肽链都有完整的三级结构，称为蛋白质的亚基 。,胰岛素受体：由4个亚基组成(22) ，亚基与亚基形成单体(monomer)，2个单体形成二聚体(dimer)。,亚基之间的结合力主要是疏水作用，其次是氢键和离子键。,蛋白质分子中各亚基的空间排布及亚
13、基接触部位的布局和相互作用，称为蛋白质的四级结构。,血红蛋白的四级结构,蛋白质的理化性质与分离纯化The Physical and Chemical Characters and Separation and Purification of Protein,（一）蛋白质的两性电离,一、理化性质,蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外，氨基酸残基侧链中某些基团，在一定的溶液pH条件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。,蛋白质的等电点( isoelectricpoint, pI) 当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的pH称为,（二）蛋白
14、质的胶体性质,蛋白质属于生物大分子之一，分子量可自1万至100万之巨，其分子的直径可达1100nm，为胶粒范围之内。,* 蛋白质胶体稳定的因素： 颗粒表面电荷(电荷层） 水化膜,水化膜,溶液中蛋白质的聚沉,（三）蛋白质的变性、沉淀和凝固,* 蛋白质的变性(denaturation) 在某些物理和化学因素作用下，其特定的空间构象被破坏，也即有序的空间结构变成无序的空间结构，从而导致其理化性质改变和生物活性的丧失。,变性的本质破坏非共价键和二硫键，不改变蛋白质的一级结构。,造成变性的因素如加热、乙醇等有机溶剂、强酸、强碱、重金属离子及生物碱试剂等 。,变性蛋白质的性质改变 物理性质：旋光性改变，溶
15、解度下降，沉降率升高，粘度升高，光吸收度增加等； 化学性质：官能团反应性增加，易被蛋白酶水解。 生物学性质：原有生物学活性丧失，抗原性改变。,天然状态，有催化活性,尿素、 -巯基乙醇,去除尿素、 -巯基乙醇,非折叠状态，无活性,蛋白质复性(renaturation)：若蛋白质变性程度较轻，去除变性因素后，蛋白质仍可恢复或部分恢复其原有的构象和功能,牛核糖核酸酶,* 蛋白质沉淀 在一定条件下，蛋白疏水侧链暴露在外，肽链融会相互缠绕继而聚集，因而从溶液中析出。 变性的蛋白质易于沉淀，有时蛋白质发生沉淀，但并不变性。,* 蛋白质的凝固作用(protein coagulation) 蛋白质变性后的絮状
16、物加热可变成比较坚固的凝块，此凝块不易再溶于强酸和强碱中。,（四）蛋白质的紫外吸收,由于蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸和色氨酸，因此在280nm波长处有特征性吸收峰。蛋白质的OD280与其浓度呈正比关系，因此可作蛋白质定量测定。,（五）蛋白质的呈色反应,茚三酮反应(ninhydrin reaction) 蛋白质经水解后产生的氨基酸也可发生茚三酮反应。,双缩脲反应(biuret reaction) 蛋白质和多肽分子中肽键在稀碱溶液中与硫酸铜共热，呈现紫色或红色，此反应称为双缩脲反应，双缩脲反应可用来检测蛋白质水解程度。,二、蛋白质的分离和纯化,（一）透析及超滤法,* 透析(dialysis)
17、利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法。,* 超滤法 应用正压或离心力使蛋白质溶液透过有一定截留分子量的超滤膜，达到浓缩蛋白质溶液的目的。,（二）丙酮沉淀、盐析及免疫沉淀,*使用丙酮沉淀时，必须在04低温下进行，丙酮用量一般10倍于蛋白质溶液体积。蛋白质被丙酮沉淀后，应立即分离。除了丙酮以外，也可用乙醇沉淀。,*盐析(salt precipitation)是将硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等加入蛋白质溶液，使蛋白质表面电荷被中和以及水化膜被破坏，导致蛋白质沉淀。,* 免疫沉淀法：将某一纯化蛋白质免疫动物可获得抗该蛋白的特异抗体。利用特异抗体识别相应的抗原蛋白，并形成抗原抗体复合物的性质，可从
18、蛋白质混合溶液中分离获得抗原蛋白。,（三）电泳,蛋白质在高于或低于其pI的溶液中为带电的颗粒，在电场中能向正极或负极移动。这种通过蛋白质在电场中泳动而达到分离各种蛋白质的技术, 称为电泳(elctrophoresis) 。 根据支撑物的不同，可分为薄膜电泳、凝胶电泳等。,几种重要的蛋白质电泳*SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，常用于蛋白质分子量的测定。 *等电聚焦电泳，通过蛋白质等电点的差异而分离蛋白质的电泳方法。 *双向凝胶电泳是蛋白质组学研究的重要技术。,PAGE,电泳结果,（四）层析,层析(chromatography)分离蛋白质的原理待分离蛋白质溶液（流动相）经过一个固态物质（固定相）时，根
19、据溶液中待分离的蛋白质颗粒大小、电荷多少及亲和力等，使待分离的蛋白质组分在两相中反复分配，并以不同速度流经固定相而达到分离蛋白质的目的 。,主要的层析技术有离子交换层析，凝胶层析，吸附层析及亲和层析等。,蛋白质分离常用的层析方法* 离子交换层析：利用各蛋白质的电荷量及性质不同进行分离。* 凝胶过滤(gel filtration)又称分子筛层析，利用各蛋白质分子大小不同分离。,（五）超速离心 ultracentrifugation,*既可以用来分离纯化蛋白质也可以用作测定蛋白质的分子量。,*蛋白质在离心场中的行为用沉降系数(sedimentation coefficient, S)表示,沉降系数与蛋白质的密度和形状相关 。,因为沉降系数S大体上和分子量成正比关系，故可应用超速离心法测定蛋白质分子量，但对分子形状的高度不对称的大多数纤维状蛋白质不适用。,
