1、 菠萝蛋白酶提取纯化及化学修饰对其活性的影响一、实验目的1、掌握菠萝蛋白酶的提取和纯化方法2、研究菠萝蛋白酶的稳定性3、掌握菠萝蛋白酶的化学修饰并对修饰酶与未修饰酶的活性比较二、实验原理菠萝蛋白酶（Bromelain,EC 3.4.22.3）是从凤梨属植物菠萝中提取的一组复合的半胱氨酸巯基蛋白水解酶。菠萝蛋白酶属于糖蛋白，分子量约为 33000D，等电点为 9.55，白色至浅棕黄色无定形粉末，溶于水。水溶液无色至淡黄色，有时有乳白光，不溶于乙醇、氯仿和乙醚。菠萝蛋白酶是典型的巯基蛋白酶，能分解蛋白质，肽，酯，酰胺。它的水解蛋白的活性比木瓜蛋白酶的活性高十倍以上，因此有着广泛的用途。它作为一种食
2、品添加剂可用于肉质嫩化、啤酒澄清，还用于干酪、明胶、水解蛋白酶的生产。在医药上它可用于生物体内溶解纤维蛋白及血凝块，因此可用于治疗水肿及多种炎症；它能迅速溶痂，对正常组织无害，不影响植皮，适用于中小面积深度烧伤的治疗。菠萝蛋白酶的最适温度范围比较稳定，最稳定范围是 5565。菠萝蛋白酶的最适 pH 在 7.1 左右，呈现中性。金属盐离子中 NaCl、KCl 对酶活的影响不是很大，较高浓度的 MgCl2、CaCl2 对菠萝蛋白酶单宁复合物有一定程度的抑制作用，尤其在浓度较高的情况下对菠萝蛋2+白游离酶酶活的影响更大。Zn 的作用中以醋酸锌的作用更为显著，极低的浓度即能促使菠萝蛋白酶的酶活性明显提
3、高。较低浓度的 ZnCl2 也能使酶的稳定性有所提高。维生素 C、半胱氨酸、硫代硫酸钠、2-巯基乙醇是菠萝蛋白酶的稳定剂，都能使酶分子中巯基基团维持还原态，能够作为还原剂来提高酶活力。0.05%的苯甲酸钠即能使氧化脱氢酶的活性得到抑制，对酶起到保护作用。对酶活有影响的金属离子，EDTA 能通过螯合而保护菠萝蛋白酶，消除其对酶的失活作用。其它试剂如 50%的甘油、葡萄糖、40%的半乳糖都能使菠萝蛋白酶的半衰期延长，蔗糖、麦芽糖、棉籽糖、松三糖、乙二醇和甘露醇均对菠萝蛋白酶有一定的保护作用。菠萝蛋白酶含有 1 个巯基和 4 个内肽二硫键。在蛋白质中 , SH 部分是与酶活性有关的最具有反应性的官能团，巯基能够和 N 取代马来酰亚胺反生加成反应，可以对巯基进行修饰，验证巯基对酶催化活性的影响三、试剂材料1、材料：新鲜的成熟菠萝2、仪器：榨汁机、离心机、紫外分光光度计、恒温水浴锅、氯化钙的干燥器、CM 琼脂糖凝胶柱（1.1cm30.0cm） 、研钵、滴管（大、小） 、烧杯（大、中、小） 、试管、具塞试管、白瓷板、温度计、PH 计、搅拌棒。
