1、实验二 聚合酶链式反应（PCR）一、 实验原理聚合酶链式反应（PCR）是利用 DNA 片段旁侧两个短的单链引物，在体外快速扩增特异 DNA 片段的技术。它应用热稳定的聚合酶，通过双链 DNA 模板的热变性、引物退火和引物延伸的重复循环，DNA 片段以指数方式增加了百万倍。从非常微量的 DNA 甚至单个细胞所含有的 DNA 起始，可产生 ug 量的 PCR 产物。二、 器材与试剂1.器材：移液器，EP 管，热盖 PCR 仪，电泳仪，量筒，锥形瓶，微波炉，电子天平，紫外照色仪2.试剂：引物，模板，Taq DNA 聚合酶，原料（dNTPs） ，缓冲液与 Mg2+，H2O, 2*PCRmix 溶液，D
2、NA 染料三、 实验步骤PCR 反应体系的建立取离心管，依次加入试剂混匀1H2O 12l2模板 1l3引物 T7 1l4引物 sp6 1l52*PCRmix 15lPCR 仪的热循环反应把离心管放入 PCR 仪中，由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成1. 模板 DNA 的变性：模板 DNA 经加热至 94左右一定时间后，使模板 DNA 双链或经 PCR 扩增形成的双链 DNA 解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；2. 模板 DNA 与引物的退火(复性)：模板 DNA 经加热变性成单链后，温度降至56左右，引物与模板 DNA 单链的互补序列配对结合；3. 引物的延伸：经加热
3、至 72左右 DNA 模板-引物结合物在 TaqDNA 聚合酶的作用下，以 dNTP 为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板 DNA 链互补的半保留复制链。重复该循环 30次，每次需要 2-3 分钟。 电泳检测结果扩增产物在琼脂糖凝胶电泳中，电泳结束后，放到紫外照射仪中进行透射，电泳明胶显示清晰的条带，如下图所示 加入的为 1 号样，出现在 500bp 左右条带，而预算结果为扩增出 492bp 条带，故实验成功。四、 讨论1. Mg2+离子浓度对 PCR 扩增效率影响很大，浓度过高可降低 PCR 扩增的特 异性浓度过低则影响 PCR 扩增产量甚至使 PCR
4、 扩增失败而不出扩增条带。2. 变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR 扩增效率。3. EB：溴化乙锭是一种高度灵敏的荧光染色剂，用于观察琼脂糖中的 DNA，可与 DNA 结合，用标准 302nm 紫外光透射仪激发并放射出橙红色信号。4. 溴酚蓝：电泳指示剂，相当于 300bp 的 DNA 的电泳速度。5. 100bp DNA Marker是由单独的 PCR 扩增产物混合而成，已含有 1xLoading Buffer,可以直接电泳。包括 11 条双链 DNA 片断：100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、900bp、1000bp 和 1500bp。特异性加强 500bp。每次上样 45L。6. 模板一般采用 50ng-1ug 或 102-105 拷贝，浓度过高反而会抑制反应的进行。7. 引物的与模板的互补程度决定了 PCR 的特异性，常用 0.10.5uM，浓度过高则特异性下降，会形成引物二聚体影响试验结果。五、 结果及结论：经电泳检测到 PCR 扩增产物中出现 500bp 左右条带， PCR 扩增成功。
