1、1山西梁汾醋业有限公司文件类别及编号： LF-GC-01 版次 共 页 第 页菌落总数测定标准操作规程 制订年份： 年制订人： 审核人： 批准人：制订日期： 审核日期： 批准日期：颁发部门： 分发部门： 生效日期：菌落总数测定的标准操作规程1. 目的规范山西老陈醋菌落总数测定的操作规程，保证山西老陈醋产品的质量。2. 适用范围酿造食醋和配制食醋菌落总数的测定。3. 仪器设备恒温培养箱，冰箱，恒温水浴箱，天平（0.1g）,均质器，振荡器；无菌吸管1ml(0.01 刻度) 、10ml(0.1ml 刻度)或微量移液器及吸头；无菌锥型瓶，250ml/500ml;无菌培养皿：直径 90mm；PH 计或精
2、密 PH 试纸；放大镜或菌落计数器4.培养基和试剂4.1 平板计数琼脂培养基，成分：胰蛋白胨 5.0g 酵母浸膏 2.5g葡萄糖 1.0g琼脂 15.0g蒸馏水 1000mlPH7.00.22制法：将上述加于蒸馏水中，煮沸溶解，调节 PH。分装试管或锥型瓶，121高压灭菌 15min。4.2 磷酸盐缓冲液成分：磷酸二氢钾（KH 2PO4） 34.0g蒸馏水 500mlPH 7.2制法：贮存液：称取 34.0g 磷酸二氢钾溶于 500ml 蒸馏水中，用大约 175ml 的 1mol/L氢氧化钠溶液调节 PH,蒸馏水稀释至 1000ml 存于冰箱。稀释液：取贮存液 1.25ml,用蒸馏水稀释至 1
3、000ml,分装于适宜容器中，121 摄氏度高压灭菌 15 分钟。4.3 无菌生理盐水成分：氯化钠 8.5g蒸馏水 1000ml制法：8.5 克氯化钠溶于 100ml 蒸馏水中 121 摄氏度高压灭菌 15 分钟。5 检验程序3报告计数各平板菌落数计算菌落总数培养每皿中加入 15ml-20ml平板计数琼脂培养基，混匀检样 25 g(mL)样品+225 mL 稀释液，均质10 倍系列稀释选择 2-3 个适宜稀释度的样品均液，各取 1ml 分别加入无菌培养皿内6 操作步骤6.1 样品的稀释6.1.1 固体和半固体样品：称取 25 g 样品置盛有 225mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，8
4、000 r/min10000 r/min 均质1min2min，或放入盛有 225 mL 稀释液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打 1 min 2 min，制成 1:10 的样品匀液。6.1.2 液体样品：以无菌吸管吸取 25 mL 样品置盛有 225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成 1:10 的样品匀液。46.1.3 用 1 mL 无菌吸管或微量移液器吸取 1:10 样品匀液 1mL，沿管壁缓慢注于盛有 9 mL 稀释液的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面） ，振摇试管或换用 1 支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成 1
5、:100 的样品匀液。6.1.4 按 1.4.1.3 操作程序，制备 10 倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用 1 次 1 mL 无菌吸管或吸头。6.1.5 根据对样品污染状况的估计，选择 2 个3 个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液） ，在进行 10 倍递增稀释时，吸取 1 mL 样品匀液于无菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。同时，分别吸取 1mL 空白稀释液加入两个无菌平皿内作空白对照。6.1.6 及时将 15 mL 20mL 冷却至 46的平板计数琼脂培养基（可放置于 46 1恒温水浴箱中保温）倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。6.2 培养6.2.1 待琼脂凝固后，将平板翻转
6、，361培养 48 h2 h。水产品 301培养 72 h3 h。6.2.2 如果样品中可能含有在琼脂培养基表面弥漫生长的菌落时，可在凝固后的琼脂表面覆盖一薄层琼脂培养基（约 4 mL） ，凝固后翻转平板，按 1.4.2.1 条件进行培养。6.3 菌落计数可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器，记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落形成单位（colony-forming 5units，CFU）表示。6.3.1 选取菌落数在 30CFU300CFU 之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于 30CFU 的平板记录具体菌落数，大于 300CFU的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采
7、用两个平板的平均数。6.3.2 其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以 2，代表一个平板菌落数。6.3.3 当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时，则将每条单链作为一个菌落计数。7 结果与报告7.1 菌落总数的计算方法7.1.1 若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每 g（mL）样品中菌落总数结果。7.1.2 若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按公式（1）计算：N =C/(
8、n1 +0.1n2 )d （1） 式中： N样品中菌落数； C 平板（含适宜范围菌落数的平板）菌落数之和； 6n1第一稀释度（低稀释倍数）平板个数； n2第二稀释度（高稀释倍数）平板个数； d稀释因子（第一稀释度） 。示例：N =C/(n1 +0.1n2 )d=(232+244+33+35)/2+(0.12)10-2=544/0.022=24727上述数据按 1.6.2 数字修约后，表示为 25000 或 2.5104。7.1.3 若所有稀释度的平板上菌落数均大于 300 CFU，则对稀释度最高的平板进行计数，其他平板可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。7.1.4 若所有稀
9、释度的平板菌落数均小于 30 CFU，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。7.1.5 若所有稀释度（包括液体样品原液）平板均无菌落生长，则以小于 1 乘以最低稀释倍数计算。7.1.6 若所有稀释度的平板菌落数均不在 30 CFU300 CFU 之间，其中一部分小于 30 CFU 或大于 300 CFU 时，则以最接近 30 CFU 或 300 CFU 的平均菌落数乘以稀释倍数计算。7.2 菌落总数的报告7.2.1 菌落数小于 100 CFU 时，按“四舍五入”原则修约，以整数报告。7.2.2 菌落数大于或等于 100 CFU 时，第 3 位数字采用“四舍五入”原则修约后，取前 2 位数字，后面用 0 代替位数；也可用 10 的指7数形式来表示，按“四舍五入”原则修约后，采用两位有效数字。7.2.3 若所有平板上为蔓延菌落而无法计数，则报告菌落蔓延。7.2.4 若空白对照上有菌落生长，则此次检测结果无效。7.2.5 称重取样以 CFU/g 为单位报告，体积取样以 CFU/mL 为单位报告。
