1、答 辩 人： 研究方向： 指导教师：,嗜热链球菌高密度培养及冷冻保护的研究,目 录,引 言,1,材料与方法,2,结果与分析,3,结 论,4,引 言,1.1 嗜热链球菌 1.2 高密度发酵 1.3 乳酸菌保护剂 1.4 研究内容与意义,1. 引 言,1.1 嗜热链球菌属于兼性厌氧的革兰氏阳性乳酸菌，在食品、医药及畜禽生产中有着广泛的应用。,1.2 高密度发酵 营养物质 发酵液的pH值 生长抑制物的积累 溶氧浓度和培养温度 补料方式及发酵液流变学特性。,1.3乳酸菌保护剂 冷冻作用机理 保护剂 冻干前预处理,1. 引 言,脂肪酸,冷激蛋白,冷冻作用,A,B,核酸,D,核糖体,C,与RNA非特异性结
2、合，阻止mRNA形成二级结构，抑制其它蛋白的转录和翻译,改变DNA分子的超螺旋结构,饱和脂肪酸 不饱和脂肪酸 抗氧化剂：Vc等,翻译的效率将降低,1. 引 言,脂肪酸的变化 冷刺激对细胞最重要的影响之一是使细胞膜从固有的结晶性液态转变为凝胶态，导致流动性下降。但是，冷冻过程中也可以激活一些脱氢酶类，在这些脱氢酶的催化作用下，乳酸菌细胞膜上的饱和脂肪酸可以转变为不饱和脂肪酸。由于不饱和脂肪酸磷脂的熔点较低，从而冷冻过程中细胞膜的流动性增强，菌体的活性可以得到保护。,1. 引 言,冷激蛋白(CSPs)合成 微生物在受到低温刺激时，会发生冷激反应，此时会合成许多冷诱导蛋白(Cold-induced
3、Proteins，CIPs)，其中最为重要的是冷激蛋白(Cold-shock proteins，CSPs)，分子量大约在7 kD。在低温环境下，这类蛋白作为RNA陪伴分子与RNA通过非特异性结合，可阻止mRNA二级结构的形成，抑制其它蛋白的转录和翻译。,1. 引 言,核糖体变化 微生物核糖体对温度敏感。随着温度的升高，核糖体翻译的速率将高于相应氨基酸的tRNA(氨基酰tRNA)的供应速率，核糖体的酰胺基位点随之空缺。此外，核糖体在冷刺激之后翻译的效率将降低。,1. 引 言,核酸变化 温度能改变DNA分子的超螺旋结构。DNA分子的延伸由DNA促旋酶和DNA拓扑异构酶来调控。DNA相关功能，如复制
4、、转录、重组等，都与DNA超螺旋结构具有紧密联系。,1. 引 言,保护剂,1. 引 言,预冷处理 产生冷应激蛋白 饱和脂肪酸转变为不饱和脂肪酸,1. 引 言,pH调节 发酵液pH为5.5时，有较好的抗冷冻性 不饱和脂肪酸与饱和脂肪酸的比例,协同作用：嗜酸乳杆菌培养过程中pH为4.44.6时，添加Ca、Mn等盐能加强细胞壁硬度，抑制乳酸菌短杆变为长杆,1. 引 言,1.4 研究内容与意义 研究内容 菌株筛选 培养基优化及高密度发酵工艺优化 冷冻保护剂配方及冻干工艺优化 目的及意义 提高菌体产率 提高冷冻保护效果 为国内乳酸菌发酵剂的应用及早日摆脱对进口发酵剂的依赖奠定基础,1. 引 言,材料与方
5、法,2.1 材料 菌株 仪器、试剂等,2. 材料与方法,2.2 方法 初筛 发酵7h后滴定酸度55T 复筛 发酵至pH4.5与商业Yc时间接近 正交试验 测菌体密度OD600 平板倾注计数法计活菌数,结果与分析,3.1 嗜热链球菌中优良菌株的筛选 3.2 ND03培养基优化 3.3 ND03静态培养条件 3.4 ND03高密度发酵 3.5 ND03冻干保护剂及工艺,3. 结 果 与 分 析,3.1嗜热链球菌中优良菌株的筛选 初筛按37发酵7h滴定酸度55T的标准进行筛选，从289株嗜热链球菌中筛选出了62株(筛出率21.5%)目标菌。,3. 结 果 与 分 析,复筛,3. 结 果 与 分 析,
6、以发酵pH值到达4.5时的时间为指标， 筛选出接近商业嗜热链球菌Yc发酵时间 的菌株，共12株。,发酵特性,3. 结 果 与 分 析,3.2ND03培养基优化 碳源,3. 结 果 与 分 析,碳源正交,3. 结 果 与 分 析,氮源,3. 结 果 与 分 析,氮源正交,3. 结 果 与 分 析,碳氮量及碳氮比,碳氮比1:2 总量4%,3. 结 果 与 分 析,缓冲盐,3. 结 果 与 分 析,微量元素,3. 结 果 与 分 析,生长因子,3. 结 果 与 分 析,三因素三水平旋转正交试验,二次多项式回归方程： Y=-1.878+0.027X1+0.136X2+ 0.086 X3-7.00010
7、-4X1X2-1.080 10-3 X2X3+ 8.500 10-4X2X3-1.79810-5 X12 -1.831 10-3X22-2.86810-3 X32求解极值得到最优配方为：碳源X126.5g/L，氮源X233.5g/L，缓冲盐X310.1g/L，预测最大菌体密度为2.113。验证试验：实测菌体密度为1.985，与模型预测值拟合率达93.9。,3. 结 果 与 分 析,3.3 静态培养条件,培养条件,ND03生长曲线,3. 结 果 与 分 析,3.4 高密度发酵 中和剂,一般采用氨水、Na2CO3、CaCO3、KOH、NaOH等溶液。 使用中和剂CaCO3、氨水、NaOH溶液时乳酸
8、产量是无中和剂时的4.9倍、5.4倍和4.9倍OD620是无中和剂时的2.3倍、2.5倍和1.9倍,相对于氨水，CaCO3是一种缓慢型的酸中和剂，pH调节能力不强，只能将pH维持在4.95.2，且CaCO3与乳酸能生成乳酸钙沉淀，不利于分批式发酵提取乳酸菌。考虑用Na2CO3替代CaCO3与氨水做中和剂对照试验。,3. 结 果 与 分 析,pH 值,3. 结 果 与 分 析,搅拌速度,3. 结 果 与 分 析,通气条件,3. 结 果 与 分 析,1.75 1010cfu/mL,3.5ND03冻干保护剂及工艺 冻干工艺,3. 结 果 与 分 析,保护剂添加比例,3. 结 果 与 分 析,保护剂配
9、方,a糖类，如右旋糖苷、蔗糖、乳糖等； b多元醇类，如甘油、山梨醇、甘露醇等； c氨基酸类，如谷氨酸、脯氨酸、丙氨酸等； d盐类，如磷酸盐、油酸钠、苹果酸钠等； e蛋白质类，如粘多糖蛋白、酪蛋白等； f聚合物类，如糊精、PEG6000、明胶等。 本试验只对保护剂配方中，糖类、多元醇类、聚合物类、盐类等进行研究。,a糖类 葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖、果糖、木糖、半乳糖等,b多元醇类 甘油、肌醇、甘露醇、山梨醇等。,c聚合物类 糊精、PVP-K90、PEG4000、PEG6000、明胶等,d盐类 油酸钠、苹果酸钠、乙酸钠、柠檬酸钠、-甘油磷酸钠,3. 结 果 与 分 析,3. 结 果 与
10、分 析,结 论,4.1 筛菌289株嗜热链球菌以商业发酵剂中的嗜热链球菌Yc为对照菌，依次经过以观察凝乳状态为指标的初筛试验，以测定pH值到达4.5时的时间为指标的复筛试验，以测定发酵全脂乳特性等为指标的试验，最终得到在酸奶发酵剂中具有潜在优势的12株优良嗜热链球菌。,4. 结 论,4.2 培养基优化以嗜热链球菌ND03为代表菌株，对AST培养基依次经过碳源、氮源、碳氮比例、微量元素、缓冲盐和生长因子的筛选，采用响应面设计对各成分比例进行优化，得到嗜热链球菌的最适培养基。在此培养基中37静止培养810h，培养液活菌数可达到1.021010CFU/mL，比在AST培养液中的活菌数提高近13倍。,
11、4. 结 论,4.3 高密度发酵工艺在筛选出的最适培养基中对ND03静态培养条件进行优化，并在5 L发酵罐上对以中和剂、pH值、搅拌速度和通气条件等影响因素进行优化，得到最佳高密度发酵工艺。在此工艺下，ND03发酵时间为6h6.5h，活菌数达到1.801010CFU/mL，发酵时间比优化前缩短2h，活菌数比优化前提高76%。,4. 结 论,4.4 保护剂对嗜热链球菌ND03的保护剂添加比例、预冻温度、预冻时间进行优化，得到ND03的保护剂添加比例为1:6，最佳预冻温度为-40，最佳预冻时间为6h。对ND03的冻干保护剂配方中的糖类、多元醇类、聚合物类、盐类进行研究，得到ND03的最佳保护剂配方。嗜热链球菌ND03冻干菌粉中活菌数为1.831011CFU/g，冻干存活率达到84.3%，比优化前提高约20%。,4. 结 论,4.5 嗜热链球菌的发酵及菌粉生产对13株嗜热链球菌进行高密度发酵及菌粉生产，按嗜热链球菌代表菌株ND03优化的培养基配方和高密度发酵工艺能满足嗜热链球菌的培养要求，而优化的冷冻干燥工艺对大部分菌株的冷冻保护有促进作用。,4. 结 论,
