1、1 Aglient LC/MSD的系统概述 2 质谱基础与相关术语 3 电离影响因素与溶液化学 4 进样之前的准备工作 5 数据采集,液相色谱/质谱联用仪 Aglient 1100 LC/MSD VL,1 Aglient LC/MSD的系统概述,一、该仪器的介绍 1、液相部分型号： Aglient 1100，包括五个部分：真空脱气机，四元泵，自动进样器，柱温箱和紫外检测器。 液相部分是VWD紫外检测器；紫外波长是190400nm，可见光波长是400760nm。2、质谱型号： LC/MSD VL 质谱部分是单四极杆检测器（型号：G1956A）。,.,1 Aglient LC/MSD的系统概述,二
2、、该液质仪可以解决什么问题1、对未知的样品进行分子量的测定。2、对已知分子量的样品进行定量分析。3、可测分子量范围是：50-1500道尔顿。,.,离子输送,离子分析,离子检测,真 空,质谱分析示意图,样品汽化,离子化,离子源,液相进样系统,质量分析器,1 Aglient LC/MSD的系统概述,1 Aglient LC/MSD的系统概述,三、质谱的限制 1.样品必须离子化离子化的化合物才能被移动、控制和质量分析2.必须具有一定的真空离子飞行的平均自由程需最大化理论上，真空度越大越好3.测量离子的质量数即质荷比（m/z）,1 Aglient LC/MSD的系统概述,四、 离子化的模式 1、电喷雾
3、电离(ESI或API-ES)： 其电离过程通过电场产生带电液滴，样品离子通过离子蒸发后做质谱分析。电喷雾过程有三步：喷雾和带电、去溶剂、离子蒸发。 适用于分子量大、极性强的有机化合物，如蛋白质、糖、肽等。 离子在样品及流动相中已经形成。化合物无需有挥发性，高电场将样品离子气化。是分析热不稳定化合物的首选方法。 ESI离子化方式占90以上。,1 Aglient LC/MSD的系统概述,2、大气压化学电离 (APCI)：离子在气态下形成，生成单电荷离子，溶剂相当于反应气将样品离子化。有电晕针，高压放电使空气中中性分子电离，产生H3O+ ， N2 +,， O +等离子，这些离子与样品反应使样品分子离
4、子化。化合物需有一定的挥发性且是热稳定的化合物。 APCI适用于中等极性或极性弱的化合物，如：酯类、酮类等。APCI 是ESI的补充 ，其质谱中很少有碎片离子，主要产生准分子离子，分析的化合物分子量一般小于1000Da.APCI 比ESI多了两个部件：蒸发室和电晕针。,1 Aglient LC/MSD的系统概述,五、本仪器离子化的模式： 复合源Multimode Ion Source（MM-ES+APCI）对复杂样品的离子化效果比较好。1、ESI-only（单独采集ESI模式下的数据）。2、APCI-only （单独采集APCI模式下的数据）。3、ESI+APCI （采集ESI和APCI共同作
5、用模式下的数据）,六、 离子化的选择示意图,ESI,分子量,200,000,15,000,1,000,非极性,APCI,极性,七、离子化方法的指导方针,是,化合物有极性吗?,化合物热稳定吗?,化合物是酸、碱或是中性?,APCI or APPI,不,是,ESI,中性,碱性,酸性,ESI (正谱),ESI (负谱),APCI,不,2 质谱基础与相关术语,一、质谱常用术语 1、分子离子：易碎裂而产生广义的碎片离子。 2、准分子离子：阳离子加合离子或阴离子加合离子。 如： M+H+ , M+Na+,M+K+ , M-H- 。一般看到的是准分子离子峰。 3、碎片离子：分子离子裂解生成碎片离子。 4、奇电
6、子离子和偶电子离子。 5、多电荷离子：蛋白质与多肽会产生多电荷离子。 6、同位素离子,苯基丁氮酮（Phenylbutazone）的API-ES 谱图 其实际质量是308。,你得到的是哪一类的数据？ ESI或APCI模式下的单电荷离子,基峰: 谱图中最强的离子,309,M+H,+,12,Ginsenoside,ESI模式下的单电荷离子，人造酐，实际质量是1131.7-23，是基峰，准分子离子峰。,13,ESI模式下的单电荷离子，碎片离子,从加钠峰（m/z 1131.7）所得的碎片离子,14,2 质谱基础与相关术语,二、质谱图相关概念 1、三维数据组：时间、质荷比、信号强度 2、UV色谱图是时间与
7、信号强度 3、Scan所得到的TIC总离子流色谱图是时间与信号 强度。 4、 SIM 选择离子监测，得到的是时间与信号 强度。 5、质谱棒棒图是质荷比与信号强度 6、EIC(提取离子流色谱图)是在数据采集后数据分析时生成的，寻找目标峰，准确定量。,质谱图的类型,Profile 轮廓图,Centroid 棒状图,Abund,Abund,m/z,m/z,threshold,16,2 质谱基础与相关术语,三、质谱图的解释 1、检测到的离子种类依赖于溶剂添加剂和分析所用的条件。 2、正离子检测： 流动相 M+H+ , 酸性条件 M+Na+,M+K+ 有盐时 M+NH4+ 有铵盐缓冲溶液 M+X+ X=
8、溶剂或缓冲溶液中的阳离子 2M+H+ , 在高浓度时形成的二聚体,2 质谱基础与相关术语,3、负离子检测： 流动相 M-H- , 碱性条件 M+X- , X=溶剂或缓冲溶液中的阴离子 M-H+S+ , 溶剂添加剂,3 电离影响因素与溶液化学,一、电喷雾电离必须考虑的 1、样品 在溶液中为离子态：儿茶酚胺、季胺 有可诱导电离的化合物2、溶液化学参数 流速、样品的pKa、溶液的pH、溶液的导电性。3、应避免的样品 非极性样品,3 电离影响因素与溶液化学,二、电喷雾电离离子形成的必要步骤步骤一：溶液中的电离步骤二：喷雾步骤三：去溶剂步骤四：离子从溶液中解吸,3 电离影响因素与溶液化学,三、影响电喷雾
9、离子化的因素1、溶液的化学性质 流动相：溶液pH、溶液的导电性、流速 被分析物 ：浓度、pKa（酸度系数，离解常数） 、表面活性 2、高电压电极注意：不要用洗衣粉等表面活性剂清洗样品瓶，会残留污染样品。可以用高锰酸钾清洗再用纯水清洗。,3 电离影响因素与溶液化学,四、电喷雾电离下pH影响正常pH在2-8，增加pH会降低灵敏度，会减少多电荷离子中的电荷数目。 随着pH增加，离子数会越来越少。 蛋白、多肽这种生物大分子在酸性条件下易离子化。,3 电离影响因素与溶液化学,五、大气压化学电离APCI必须考虑的 与ESI相比，APCI对于流动相、流速或添加剂的依赖性小。主要是溶 剂的选择，一般APCI用
10、甲醇+水做溶剂。 1、样品 不含酸性和碱性位点的化合物：醇、醛酮和酯。 分子量和极性中等的化合物：脂肪酸，邻苯二甲酸酯类。 电喷雾响应不好的样品。 2、应避免的样品 在气化过程中热不稳定的化合物,3 电离影响因素与溶液化学,六、离子源的选择 ESI APCI 离子在溶液中已经生成 离子在气态条件中生成 化合物无需具有挥发性 化合物需具有一定的挥发性 是分析热不稳定化合物的首选 化合物必须是热稳定的 除了生成单电荷的离子之外 只生成生成单电荷的离子 还可以生成多电荷的离子,3 电离影响因素与溶液化学,七、溶剂的选择 1、常用的溶剂有：超纯水、进口的色谱纯的甲醇和乙睛。尽可能不用乙睛。 2、流动相
11、中可能加有添加剂，目的是调节流动相的pH值。建议用挥发性的添加剂：甲酸、乙酸、甲酸铵和乙酸铵。 3、如果这些常规的溶剂能满足你分析的需要，可不考虑其他溶剂。,3 电离影响因素与溶液化学,八、LCMS添加剂1、在流动相中添加缓冲液或无机盐，主要是调节pH值，有时是为了改变峰形。常用：乙酸、甲酸、甲酸铵和乙酸铵。 2、 LCMS中调节流动酸性常用的酸是甲酸：3、LCMS中调节流动碱性常用的碱是氨水。4、尽可能不用这三种盐：硼酸盐、硫酸盐、磷酸盐5、通过分流阀，进质谱的流速保证在0.2-0.3ml/min之间。6、在ESI中影响添加剂选择的主要因素是离子配对和挥发性。7、在APCI中影响添加剂选择的
12、主要因素是挥发性。,3 电离影响因素与溶液化学,九、离子检测模式的选择1、正离子检测模式 适合于碱性样品，酸性流动相。用得比较多的是酸性流动相的正离子 检测模式，碱性流动相用得少对仪器和柱子的损害较大。2、负离子检测模式适合于酸性样品，中性偏碱性流动相。3、可正、可负离子检测模式可以用正离子检测模式也可以用负离子检测模式，比较灵敏度，再确定是用正离子检测模式还是负离子检测模式。,非挥发性缓冲剂的影响,10 mM 磷酸钠/35% 甲醇 ESI, 1 hr 0.2 mL/min. 对轴喷雾,直角 ESI,4 进样之前的准备工作,一、查阅文献： 1、查阅文献，了解样品的极性与分子量的范围，如何离子化
13、（ESI、APCI），怎样采集（正离子、负离子模式）？ 2、选择流动相。甲醇和水（比例？）；还是乙睛和水（比例？）。 3、每一个离子源都有适当的参数设置。雾化气压力、干燥气流速、干燥气温度、蒸发室温度、毛细管电压、电晕针电流和放电电压。 4、选好液相部分紫外检测器的检测波长：紫外波长是190400nm，可见光波长是400760nm。 5、样品浓度建议在100纳克/毫升至20微克/毫升之间。,4 进样之前的准备工作,二、进样之前的准备工作： 1、脱除溶剂中的气体 一个溶剂瓶一个溶剂瓶脱气，先打开脱气阀，用流量 3ml/min，约5分钟，可见管路中气体排出，再脱另一个溶剂瓶，脱完气之后先调低流量至
14、0.5ml/min再关push阀。 2、冲洗液相与质谱管路 一个溶剂瓶一个溶剂瓶冲管路，用流量 1ml/min，约10分钟，设好质谱管路的流向去废液瓶。 3、平衡柱子系统 装上柱子，接通进质谱的管子，流量调至0.5ml/min，平衡系统20分钟。溶剂在三通阀处一根进液相废液瓶，一根进质谱废液瓶。,5 数据采集,一、数据采集 两种采集数据方式：Scan和SIM 该MS在set up MSD Singal时有两种扫描方式：Scan全扫描和SIM选择离子监测。 1、Scan全扫描 采集数据在指定的范围内从高质量到低质量的扫描。 用于测定分子量，识别未知化合物和检验峰纯度。 Scan得到的是总离子流色
15、谱图（TIC) 总离子流色谱图（TIC)：是将每一个采样点所对应的质谱图 上所有离子丰度的加和与扫描时间一一对应作图产生的。 总离子流色谱图上每一个采样点都对应一张质谱图。,5 数据采集,一、数据采集 2、SIM选择离子监测 SIM主要用于已知化合物的定量分析。对于SIM 定量，可以对每个色谱峰选择一个定量离子。这个离子应该丰度高且唯一。应用精确质量，不要用名义质量（例如195.2而不用195）。该MS精确至小数点后一位。当不能确定195.2是最强信号，可以选定三个离子195.1，195.2，195.3，比较这三个离子的强度，强度最大的即是真实的分子量。,5 数据采集,二、采集参数方法的设置
16、1、要建立一个新方法，在chemstantion offline状态的Method and Run 视图中编辑方法。 2、方法是：从MSD图标进入，选择Set up MSD Signal。 3、然后从MSD图标进入选择Spray Chamber进行复合源参数的设置。 4、Method Spray Chamber:选MM-ES+APCI 5、Set up MSD 的信号时可以选离子源ESI，或APCI，如果吃不准用什么离子源也可以同时选ESIAPCI。复合源（Multimode Source）的优点是对复杂样品的离子化效果比较好，但是不如单独的ESI，或APCI源效果好。,Click on th
17、e Module Diagram,Access to Acquisition Parameters,5 数据采集,二、采集参数方法的设置 6、再从VWD图标进入,设置紫外检测器参数（主要是检测波长）。 7、从柱温箱图标进入，选择柱子两端的温度，也可以不控 制柱温。 8、从进样器图标进入，选择流动相的流速、比例。进质谱的流速必须小于0.5ml/min。 9、最后设定方法名称。保存该方法。 10、在chemstantion online状态的调用该方法。 11、在chemstantion online状态下，点击样品瓶编辑样品信息。然后就可以开始进样采集数据。注意进样量在20微升以下，系统默认是5
18、微升。,Access Parameters from the Instrument Menu,5 数据采集,三、从MSD图标设置Set up MSD Signal注意点： 1、Use MSD。选择该对话框时MSD被用作检测器，这个对话框中的其他参数将会被执行。未选择时MSD保持在standby状态，不会被作为检测器。 2、Stop Time 。质谱停止采集的时间。一般设为As pump:与泵所设的停止时间一致。或选时间则达到指定时间将自动停止采集数据。 3、Fragmentor值与化合物性质有关。碎裂器电压范围在50到200V之间。碎裂器电压值是MS必须优化的数值。一般来说分子量大碰撞电压也要
19、大。但是太大会产生较多的碎片离子。,质谱信号设置面板 (SL Shown),Same settings as current LC/MSD,Acquire up to 4 signals with optional signal description,Specify the % of time spent collecting each signal,Mode and polarity set for each signal,Turn each signal on/off as desired,Specify an optimal fragmentor value for each SIM
20、ion,适用于多重信号采集,5 数据采集,四、MS雾化室参数设置说明 1、干燥气流速Dry Gas Flow (l/min):APCI通常为4，ESI通常为8-10， 最大是13。 2、雾化气压力Nebulizer Pressure (psig):最大为60，APCI选60，ESI与流速有关，流速0.2-0.4ml/min选20-30，流速0.4-0.8ml/min选30-45，流速大于0.8ml/min选45-60。 3、干燥气温度Dry Gas Temperature ():300-350，通常在300 以上。与流动相和流速有关，水相比较多或高流速时要求较高的温度。 4、蒸发室温度Vapo
21、rizer Temperature ():通常为350 。与溶剂和流速有关，高流速时要求较高的蒸发温度。只对APCI激活。 最高为500 。 5、毛细管电压Capillary Voltage (V):最高为6000V对复合源来说无论正模式 还是负模式 都选2000 6、电晕针电流Corona Current(uA):只对APCI激活，对正模式通常为4.0 uA、对负模式通常为25uA。 7、放电电压Charging Voltage (V):只有复合源才有此参数，通常为2000。,喷雾室对话框,对复合源只能选MM-ES+APCI,电喷雾喷雾室设置,大气压电离-电喷雾电离源 API-Electro
22、spray Ion Source,High Voltage Mesh Assembly,HPLC 流速 500L/min 雾化气压力 60 psig 干燥气温度 start with 350 C 干燥气流速 4 L/min 气化温度 随 FIA调节 帽电压 随 FIA调节 (2000-6000) 开始 2500 V 电晕电流 随 FIA调节 开始 25 A (neg) 或 4 A (pos),APCI 喷雾室的设置,APCI Ion Source,电晕针,5 数据采集,五、采集数据注意点 1、判断实验过程是否正常，检查系统压力（显示在进样器图标上），在100bar以下正常，否则停止操作，检查原因。 2、在online状态下，图标黄色代表仪器正在自检；图标绿色代表仪器可以使用了；图标兰色代表仪器正在使用。图标红色代表仪器出现问题必须停止使用，检查原因。 3、在offline状态下，可以实时查看数据。可以看到总离子流图（SCAN）或SIM,液相色谱图，利用快捷键可以看到质谱图查到m/z。,
