1、 项目名称 链霉素的生产编制人 刘燕编制时间 2012 年 10 月 18 日目录一、 产品概述二、 生产工艺三、 产品规格与质量标准四、 生产组织五、 成本核算六、 EHS一、 产品概述1.链霉素的定义氨基糖苷类抗生素是由氨基糖和配糖基（分子的非糖部分）以糖苷键形式结合而成的苷类衍生物，主要有链霉素、卡那霉素、庆大霉素、新霉素、巴龙霉素等。近年来还出现了一些新品种，如丁胺菌霉素、妥布霉素、核糖霉素、青紫霉素等。链霉素（streptomycin）是一种氨基葡萄糖型抗生素，分子式 C21H39N7O12。链霉素是由土壤放线菌( Streptomyces griseus )产生的,能有效地抵抗许多
2、细菌（结核杆菌、鼠疫杆菌、大肠杆菌等）,主要用其盐治疗结核病、鼠疫、百日咳、细菌性痢疾、泌尿道感染和主要由革兰氏阴性细菌引起的其它传染病。链霉素也是一种从灰链霉菌的培养液中提取的抗菌素。属于氨基糖甙碱性化合物。2.链霉素的发展史1943 年美国 S.A.瓦克斯曼从链霉菌中析离得到，是继青霉素后第二个生产并用于临床的抗生素。1942 年，萨兹成为瓦克斯曼的博士研究生。不久，萨兹应征入伍，到一家军队医院工作。1943 年 6 月，萨兹因病退伍，又回到了瓦克斯曼实验室继续读博士。萨兹分到的任务是发现链霉菌的新种。在地下室改造成的实验室里没日没夜工作了三个多月后，萨兹分离出了两个链霉菌菌株：一个是从土
3、壤中分离的，一个是从鸡的咽喉分离的。这两个菌株和瓦克斯曼在 1915 年发现的链霉菌是同一种，但是不同的是它们能抑制结核杆菌等几种病菌的生长。据萨兹说，他是在 1943 年10 月 19 日意识到发现了一种新的抗生素，也即链霉素。几个星期后，在证实链霉素的毒性不大之后，梅奥诊所的两名医生开始尝试将它用于治疗结核病患者，效果出奇的好。1944 年，美国和英国开始大规模的临床试验，证实链霉素对肺结核的治疗效果非常好。它的抗结核杆菌的特效作用，开创了结核病治疗的新纪元。它随后也被证实对鼠疫、霍乱、伤寒等多种传染病也有效。与此同时，瓦克斯曼及其学生继续研究不同菌株的链霉菌，发现不同菌株生产链霉素的能力
4、也不同，只有 4 个菌株能够用以大规模生产链霉素。从此，结核杆菌肆虐人类生命几千年的历史得以有了遏制的希望。链霉素的样品3.链霉素的结构链霉素是由链霉胍、链霉糖和 N-甲基-L-葡萄糖胺通过糖苷键装配 而成的化合物。链霉 素的化学结构式如下：它与结核杆菌菌体核糖核酸蛋白体蛋白质结合，起到了干扰结核杆菌蛋白质合成的作用，从而杀灭或者抑制结核杆菌生长的作用。由于链霉素肌肉注射的疼痛反应比较小，适宜临床使用，只要应用对象选择得当，剂量又比较合适，大部分病人可以长期注射（一般 2 个月左右） 。4.链霉素的性质（1）物理性质链霉素游离碱为白色粉末，大多数盐类也是白色粉末或结晶，无臭，味微苦。链霉素分子
5、中有 3 个碱基基团，其中两个是链霉胍上的强碱性胍基，第三个是葡萄糖胺上的弱碱性甲氨基。因此，链霉素在水溶液中随着 pH 降低可能依次以 4 种不同的型式存在：链霉素游离碱、一价阳离子、二价阳离子、三价阳离子。（2）溶解度链霉素分子中含有较多亲水性基团，易溶于水，难溶于有机溶剂。链霉素盐酸盐易溶于甲醇，难溶于乙醇，而硫酸盐即使在甲醇中也很难溶解。（3）稳定性链霉素比较稳定，空气和阳光对干燥粉末的影响不大。但链霉素的游离碱或盐均易吸收空气中的水分而潮解，潮解后含水量增加，容易分解破坏，稳定性下降。链霉素的水溶液比较稳定，但稳定性受 pH 和温度的影响较大。5.药理作用（链霉素的杀伤力）链霉素是一
6、种氨基糖苷类药，经主动转运通过细菌细胞膜，与细菌核糖体 30S 亚单位的特殊受体蛋白结合，干扰信息核糖核酸与 30S 亚单位间起始复合物的形成，抑制蛋白合成。使 DNA 发生错读，导致无功能蛋白质的合成；使多聚核糖体分裂而失去合成蛋白的功能，使大量氨基糖苷类进入菌体，细菌细胞膜断裂，细胞死亡。6.链霉素治疗的疾病该品适用于土拉菌病，或与其他抗菌药物联合用于鼠疫、性病肉芽肿、布氏杆菌病、鼠咬热，亦可与青霉素联合治疗或预防草绿色链球菌或肠球菌所致的心内膜炎。该品亦可与其他抗结核药物联合用于结核分枝杆菌所致的各种结核病或其他分枝杆菌感染。 该品主要与其他抗结核药联合用于结核分枝杆菌所致各种结核病的初
7、治病例，或其他敏感分枝杆菌感染。 该品可单用于治疗土拉菌病，或与其他抗菌药物联合用于鼠疫、腹股沟肉芽肿、布鲁菌病、鼠咬热等的治疗。亦可与青霉素或氨苄西林联合治疗草绿色链球菌或肠球菌所致的心内膜炎。7.链霉素与其他药物的相互作用(1)链霉素与其他氨基糖苷类同用或先后连续局部或全身应用，可增加耳毒性、肾毒性以及神经肌肉阻滞作用的可能性。可能发生听力减退、停药后仍可能进展至耳聋；听力损害可能恢复或呈永久性。神经肌肉阻滞作用可导致骨骼肌软弱无力，呼吸抑制或呼吸麻痹(呼吸暂停)，用抗胆碱酯酶药或钙盐有助于阻滞作用恢复。 (2)链霉素与神经肌肉阻滞剂合用，可加重神经肌肉阻滞作用，导致肌肉软弱、呼吸抑制或呼
8、吸麻痹(呼吸暂停)。链霉素与卷曲霉素、顺铂、利尿酸、呋塞米或万古霉素等合用，或先后连续局部或全身应用，可能增加耳毒性与肾毒性，听力损害可能发生，且停药后仍可能发展至耳聋，听力损害可能恢复或呈永久性。 (3)链霉素与头孢噻吩同用局部或全身应用可能增加肾毒性。 (4)链霉素与多粘菌素类合用，或先后连续局部或全身应用，因可增加肾毒性和神经肌肉阻滞作用，后者可导致骨骼肌软弱、呼吸抑制或麻痹(呼吸暂停)。8.使用后的副作用（1）链霉素容易损害听觉神经，可以引起眩晕，运动时失去协调（我们称共济失调） ；可以引起耳鸣，听力下降，严重时出现耳聋。上面提到不能用于孕妇的主要原因就在于它可以影响胎儿的听觉神经，以
9、后产生听觉障碍。因为，由于医疗单位不够认真负责，或者由于不懂药理知识乱用链霉素，引起所谓“先天性”耳聋，在过去由于人为的原因造成儿童听力障碍残疾的教训也是较多的。 （2）产生链霉素过敏反应的人很少，但还是有的。轻的出现发热、药物性皮疹，严重的会发生剥脱性皮炎（是一种全身性的严重的皮肤病） ，甚至过敏性休克。所以，有链霉素和其他药物过敏史者不用或慎用。 （3）前面已介绍过链霉素属氨基糖甙类抗菌素（其他如庆大霉素、小诺霉素、妥布霉素、卡那霉素、丁胺卡那霉素等等均属此类抗菌素）对肾脏的毒性较多，肾功能有损害的病人应该少用和不用，即使一定要用，必需经常查验肾功能和尿常规，老年人因药物血浓度维持时间比年
10、轻者长，所以，应用链霉素要减量和谨慎使用，并进行严密观察。 （4）有的病人可以出现口唇周围和面部的麻木感。轻者不须停药，重者必需在专门医师的指导下减量或停药。 9注意事项交叉过敏对一种氨基糖苷类过敏的患者可能对其他氨基糖苷类也过敏。 下列情况应慎用链霉素：(1)失水，可使血药浓度增高，易产生毒性反应。(2)第 8 对脑神经损害，因该品可导致前庭神经和听神经损害。(3)重症肌无力或帕金森病，因该品可引起神经肌肉阻滞作用，导致骨骼肌软弱。(4)肾功能损害，因该品具有肾毒性。 疗程中应注意定期进行下列检查：(1)尿常规和肾功能测定，以防止出现严重肾毒性反应。(2)听力检查或听电图(尤其高频听力)测定
11、，这对老年患者尤为重要。 有条件时应监测血药浓度，并据此调整剂量，尤其对新生儿、年老和肾功能减退患者。每 12 小时给药 7.5mg/kg者应使血药峰浓度维持在 1530g/ml，谷浓度510g/ml；一日 1 次给药 15mg/kg 者应使血药峰浓度维持在 5664g/ml，谷浓度1g/ml。对诊断的干扰：该品可使丙氨酸氨基转移酶(ALT)、门冬氨酸氨基转移酶(AST)、血清胆红素浓度及乳酸脱氢酶浓度的测定值增高；血钙、镁、钾、钠浓度的测定值可能降低。该品属氨基糖苷类，在儿科中应慎用，尤其早产儿及新生儿的肾脏组织尚未发育完全，使本类药物的半衰期延长，药物易在体内积蓄而产生毒性反应。老年患者应
12、用氨基糖苷类后易产生各种毒性反应，应尽可能在疗程中监测血药浓度。老年患者的肾功能有一定程度生理性减退，即使肾功能测定值在正常范围内仍应采用较小治疗量。二、 生产工艺1.工艺流程图A 发酵砂土孢子转入试管斜面，培养 一级试管斜面菌种转入试管斜面，培养二级试管斜面菌种转入三角瓶液体培养基，培养27,恒温培养 7d 27培养 6d孢子成熟后，保存于 4冰箱里于 27培养4548h于 27培养6263h，通气量为 1:1.5vvm三角瓶菌液（菌液立即用最好，也可保存于 4冰箱里，但不超过一周）以 0.2%0.4%的接种量转入一级种子罐，培养以 10%左右的接种量，转入二级种子罐，培养二级种子培养液于
13、27培养 5560h，通气量为 1:1.5vvm一级种子培养液以 10%左右的接种量，于27.5培养 5456h，通气量为 1:1.1vvm 转入三级种子罐三级种子发酵液以 20%的接种量转入发酵罐，发酵发酵液 后处理工段B 提取发酵液 酸化液过滤或离心酸化滤洗液NaOH 中和中和滤液离子交换饱和树脂7%H2SO4 洗脱一次洗脱液离子交换饱和树脂7%H2SO4 洗脱二次洗脱液精制，中和精制液2%3%的活性碳脱色硫酸链霉素成品精脱液薄膜浓缩蒸发浓缩液硫 酸 ， 2% 3%活 性 炭酸性脱色液Ba（ OH）2,1.5% 2%活 性 炭成品浓缩液 喷雾干燥10 以 下 PH6.7 7.2Na+弱酸树
14、脂 Na+弱酸树脂H+型强酸树脂，OH型弱碱树脂Ph4.35.035,20mmHg Ph2.5 Ph5.56.0酸 化 处 理 ， 加1 2 倍 水 、 草酸 ，70 75h， ,PH 32.生产原理灰色链霉菌生长的原理灰色链霉菌的孢子柄直而短，不呈螺旋状。孢子量很多，呈椭圆球形。气生菌丝和孢子都呈白色。单菌落生长丰满，呈梅花形或馒头形，直径为 34mm。基内菌丝透明，在斜面背后产生淡棕色色素。 发酵链霉素是由灰色链霉菌产生的，菌种在一定组成的培养基内，经过逐级扩大培养，进行发酵生产。其过程包括 2 级斜面孢子培养、12 级摇瓶菌种培养、2 级菌种培养和发酵罐培养。在发酵罐中，在适宜的培养条件
15、下培养 89d 得发酵液。提取链霉素是一种有机碱，其盐类在中性与酸性水溶液中可解离成三价阳离子，故可用阳离子交换树脂提取。链霉素在 Ph47 时稳定，所以链霉素的吸附只能在中性条件下进行。氢型羧酸型树脂在酸性条件下的电离度多很小，交换容量很低，只能在碱性条件下才能起交换作用，而链霉素在碱性条件下很不稳定。因此应将其转化成钠型并选择在中性条件下吸附。链霉素是高价离子，配制较稀的溶液有利于链霉素的吸附而不利于杂质的吸附，从而得到某种程度的提纯。羧酸型树脂对氢离子的亲和力大，用酸洗脱能是链霉素洗脱完全链霉素离子交换吸附和洗脱可用下列方程式表示：吸附：3ROONa+St+3(RCOO)3Str+3Na
16、洗脱：（RCOO）3Str+3H+3RCOOH+Str+3链霉素经过离子交换树脂处理后，体积缩小十分之一，得以浓缩，而且纯度有所提高。3.操作步骤（1） 种子的配方：葡萄糖、黄豆粉、硫酸铵、玉米浆、磷酸盐和碳酸钙等。灰色链霉菌可以利用的碳源非常广范，最好是葡萄糖，其次是果糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、麦芽糖、甘油。（2） 发酵种子的扩大培养首先转接到一级试管斜面进行活化，一级斜面于27恒温培养 7 天，长满白色菌台与孢子，再转入二级试管斜面 27培养 6 天，孢子成熟后，保存于冰箱。试管菌种转入三角瓶液体培养基，于 27培养 4548h为菌种液。将三角瓶菌种以 0.2%0.4%的接种量转入一级种子罐
17、，于 27培养 6263h 通气量 1:1.1vvm，然后以 10%接种量转入二级发酵罐，于 27培养5560h，通气量为 1:1.5vvm,若菌种量需求大可采用三级种子罐培养。 培养条件的控制 通气与搅拌。通气状况对链霉菌的生长有很大影响，链霉菌的临界氧溶度约为 0.001mol/mL，溶氧度低于此值时，菌体生长受到抑制。适当增大通气量，可提高三羧酸循环的活力。通气量差时，无氧酵解途径活跃，丙酮酸和乳酸积聚，pH 下降，不利于链霉素的生产。 温度。链霉素生长适宜的培养温度为 28.5左右。 pH。链霉菌菌丝生长的最适 pH 为 5.57.0，链霉素合成的最适 pH 为 6.87.3。（3）
18、提取 发酵液预处理发酵结束后，为了使与菌丝体相结合的链霉素释放出来。用草酸等酸化剂进行短时间处理。酸化前，将发酵液稀释 12 倍，使发酵单位降至 6000u/ml 左右，再加入草酸至 PH2.83.2，在通入蒸汽加热至 7075，迅速冷却，使蛋白质发生凝聚，以利于固液分离，得到澄清的酸化滤液。 离子交换法提取和精制发酵液经酸化、过滤，除去菌丝及固体物，然后中和，通过弱酸型阳离子交换树脂进行离子交换，再用稀硫酸洗脱,收集高浓度洗脱液链霉素硫酸盐溶液。洗脱液再经磺酸型离子交换树脂脱盐，此时溶液呈酸性，用阴离子树脂中和后，再经活性炭脱色得到精制液（见彩图）。精制液经薄膜浓缩成浓缩液，再经喷雾干燥得到
19、无菌粉状产品，或者将浓缩液直接做成水针剂。三、 产品规格与质量标准1.链霉素的外观：白色或类白色粉末，无臭或微臭。分子式：C21H39N7O12分子量：581.59折射率：-84毒性 LD50(mg/kg)：对许多革兰氏染色阴性或阳性细菌有效，鼷鼠急性经口 9000。对人低毒。溶解情况：易溶于水，微溶于乙醇，不溶于甲醇、氯仿和丙酮。2.链霉素效价的测定效价测定的方法：（1）敏感菌菌液的制备 取培养基于37、67d 的枯草芽孢杆菌 6633 斜面一支，镜检芽孢必须在 80%90%左右，用无菌蒸馏水 20ml 洗下，65加热30min,4 冰箱保存备用。 （2）标准溶液的制备 精确称取一定量的链霉
20、素标准品，用无菌的 0.5mol/LpH6.0 磷酸盐缓冲液稀释成 1000ug/mL。 （3）标准曲线的制备 将链霉素标准溶液（1000um/ML）用 pH7.88.0 的磷酸盐缓冲液，稀释成 0.25、0.5、1.0、1.5ug/mL 的四种不同浓度的链霉素溶液。双碟平板的制备：取无菌培养皿 8 套，将菌层与底层培养基融化，冷至 5060 左右，向每套培养皿内倒入1015mL 的培养基，使其凝固，将融化的另一瓶培养基冷至 45左右，用无菌吸管加入以制备好的枯草芽孢杆菌菌液 1mL，摇匀，向每只双碟再加入 5mL 的含菌培养基。迅速摇动，使其均匀平布与底层培养基上。取上述制好的双碟平板六套，
21、每碟反面做好标记，用无菌镊子从放有无菌不锈钢环的器皿内取出不锈钢环，在火焰上通过两次。每个标准溶液浓度做两个双碟，然后用滴管向钢环滴加不同浓度的链霉素标准液，使钢环内充满链霉素液并在环口形成凸液面。将制好的双碟用无菌的砂盖好，正置在 37温箱中培养 1618h，取出不锈钢用卡尺量取抑菌圈直径。将每种浓度求其平均值制作标准曲线。(4)将样品用磷酸盐缓冲液稀释成每 mL 含 1ug 的溶液，去一只好的两个双碟作上标记放六个不锈钢环，以 A 环为校正用，滴入 1ug/mL 的链霉素标准液，其余三环滴入未知样品。放入温箱培养1618h 取出，量其抑菌圈的直径并校正，此校正后的抑菌圈的直径可在标准曲线找一合适值，此值为样品每 mL 链霉素的 ug 数，即效价值。四、生产组织五、成本核算六、EHS（环保、健康、安全）链霉素生产废水是一类含硫酸盐的高浓度有机废水，水质情况见表，比值一般为，碳氮比偏低，在左右，同时废水中含有较多生化抑制物质，如甲醛、草酸、链霉素单位及其降解物等。较高浓度硫酸盐的存在对正常的厌氧消化可能会造成严重影响。
