DB15T - 元宝枫组织培养技术规程.doc

1、DB15/ XXXXXXXXXICS B备案号： DB 15内 蒙 古 自 治 区 地 方 标 准元宝枫组织培养技术规程Technical regulation for tissue culture of Acer truncatum BungeDB 15/T - -发布 - -实施内 蒙 古 自 治 区 质 量 技 术 监 督 局 发 布DB15/ XXXXXXXXXI目 次前 言 II1 范围 .12 规范性引用文件 .13 术语和定义 .14 环境及器具灭菌 .15 培养基配制 .26 外植体及其灭菌 .37 初代培养 .48 增殖继代培养 .49 生根培养 .510 组培苗炼苗移栽 5

2、附录 1 .8附录 2 .9DB15/ XXXXXXXXXII前 言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由内蒙古林业厅提出并归口。本标准起草单位：内蒙古和盛生态科技研究院有限公司、内蒙古农业大学、内蒙古和盛生态育林有限公司、北京蒙树生态环境工程有限公司、赤峰市园林管理局。本标准主要起草人：赵泉胜、赵鹏武、铁英、封卫平、斯琴毕力格、王娟、田菊、王淑杰。DB15/ XXXXXXXXX1元宝枫组织培养技术规程1 范围本规程规定了元宝枫组织培养的术语和定义、环境及器具灭菌、培养基配制、外植体及其灭菌、初代培养、增殖继代培养、生根培养、组培苗炼苗移栽等基本内容及技术要求。本技术规程适

3、用于元宝枫组织培养技术生产。 2 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准。凡是未注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。LY/T 1882-2010 林木组织培养育苗技术规程。3 术语和定义LY/T 1882-2010界定的以及下列术语和定义适用于本标准。3.1 元宝枫 Acer truncatum Bunge元宝枫属于槭树科(Aceraceae)、槭树属(Acer)，落叶乔木。3.2 组培瓶苗 Tissue-Culture Container Seedling经生根培养，形成完整

4、根系且生长正常，未出瓶（试管）的组培苗。3.3 过滤灭菌 Filter Sterilization对不耐高温的植物生长调节物质，采用孔径小于 0.45 m 的滤网膜过滤消除杂菌的方法。 4 环境及器具灭菌4.1 洗涤室消毒灭菌每天用过氧乙酸、来苏水等喷洒地面，保持室内清洁。4.2 接种室消毒灭菌接种前应用紫外灯照射 20min30min，并定期(一般 2 周)用甲醛(HCHO，10 mL/m)和高锰酸钾(KMnO 4，5 g/m) 混合薰蒸 2 d3 d，通风无味后工作人员方可进入。4.3 培养室消毒灭菌一般一个月左右用甲醛(HCHO，10 mL/m)和高锰酸钾(KMnO 4，5 g/m)混合

5、薰蒸，或DB15/ XXXXXXXXX2用 70酒精喷雾消毒。4.4 超净工作台消毒灭菌接种前应用紫外灯照射 20min30min，并用 70酒精喷洒台面；定期清洗超净工作台的过滤膜以确保过滤膜清洁，具体方法：摘下滤膜，使用流水冲洗干净，晾干，安装回去，紫外灯照射灭菌。4.5 器具消毒灭菌4.5.1 接种器具消毒灭菌接种前，将接种工具用滤纸包好，置于高压灭菌锅灭菌，使用前用酒精灯外焰灼烧20s 以上， 或用接种工具灭菌器直接灭菌。4.5.2 污染瓶消毒灭菌用消毒锅高温高压消毒，然后再清洗培养容器。或者用 75%乙醇喷洒灭菌后再清洗培养容器。5 培养基配制5.1 基本培养基的选择元宝枫组培选择

6、MS 培养基为基本培养基。5.2 母液的配制和保存5.2.1 母液的配制元宝枫 MS 培养基母液可以配制成几种化合物的混合母液(附件 1)，也可以配制成单一化合物母液。微量元素母液配制 100 倍，大量元素母液配制 50 倍，植物生长调节物质配制浓度 0.1mg/mL1.0mg/mL。5.2.2 母液的保存母液配制好后，要在存储瓶上放置完整的标签，并置于 4冰箱存放。注：每瓶试剂在使用前应目测无结晶无异色才能使用；并在有效期内使用。5.3 基本培养基的配制（以 1L 培养基的配置方法为例 ）5.3.1 准备根据培养基成分准备好容量瓶、蒸馏水、蔗糖、琼脂和各类母液等试剂，同时准备好移液枪、量筒、

7、量杯、天平、药匙、磁力搅拌器、pH 计等工具。5.3.2 琼脂融化加蒸馏水 700 mL 左右，再加入 5 g 琼脂，加热搅拌使琼脂融化。DB15/ XXXXXXXXX35.3.3 糖溶解琼脂融化后，加入 30 g 蔗糖，搅拌使糖溶解。5.3.4 加母液糖溶解后，吸取母液，再根据不同培养基要求加入激素(不耐高温的激素，如吲哚丁酸（IBA） 、细胞分裂素（6-BA）等，应在培养基高压灭菌后再过滤灭菌加入)，充分搅拌。5.3.5 定容 搅拌均匀后，加蒸馏水定容至 1 L。5.3.6 pH 值测定和调节充分搅拌后，用酸度计测定 pH 值，用 0.1 mol/L 的 HCl 或 0.1 mol/L 的

8、 NaOH 调节pH 至 5.8。5.3.7 分装使用 240ml 规格的培养瓶定量分装，每瓶分装约 50ml，1L 可分装约 20 瓶。分装培养基时勿将培养基沾在培养瓶瓶口。5.3.8 封口盖紧瓶盖，或用封口膜封口。5.3.9 灭菌应用高温高压蒸汽灭菌锅进行消毒，通常在压力 1.1kg/cm2、温度 121条件下保持15min20min 即可。5.3.10 冷却灭菌后的培养基放在超净工作台冷却，待完全凝固后使用。5.3.11 贮存灭菌后的培养基应注明编号。在无菌条件下 4贮藏备用，贮存时间不应超过一个月。6 外植体及其灭菌6. 1 外植体采集45 月份，晴天上午 10 点至下午 4 点之间，

9、选采无病虫害、生长健壮的元宝枫 1 年生嫩枝作为外植体试材。6.2 外植体灭菌DB15/ XXXXXXXXX4包括洗洁精、酒精和次氯酸钠灭菌环节。6.2.1 洗洁精水灭菌将 1 年生嫩枝，剪掉叶片，置于烧杯内用洗洁精水全面刷洗表面，倒掉污水，再用1 层纱布包裹烧杯口，用自来水流水冲洗 30min 后，将自来水倒掉，将其放在放在超净工作台上。拿到超净工作台上进行灭菌。6.2.2 酒精和次氯酸钠灭菌对洗洁精灭菌的 1 年生枝用 70%酒精浸泡数 30s，无菌水冲洗 3 次，再用 0.5%2%的次氯酸钠浸泡 15min，用无菌水冲洗 3 次，用灭菌滤纸吸附残留水分。6.3 制备外植体在超净工作台内，

10、将灭菌后的 1 年生枝用灭菌后的剪刀和镊子均匀切分成长度1cm2cm 的小段，每个茎段含 1 个芽。7 初代培养7. 1 初代培养基初代培养选用 MS + IBA 0.01 mg /L +6-BA 1. 5 mg /L。7.2 外植体接种在超净工作台内，将外植体转接到预先准备好的初代培养基上，每瓶培养基均匀接种3 个外植体。茎段的下部插入培养基内，芽露出，盖紧瓶盖；注明编号。7.3 培养方法将接种完毕进行初代培养的培养瓶送到培养室，整齐摆放在指定的组培架上；一般每 30d 更换培养基 1 次。待腋芽萌发的无根瓶苗生长到 5cm 时，可将其切段进行增殖继代培养。7.4 培养环境培养室温度在 25

11、2，相对湿度 7080 ，光照强度 1500lx3000lx，光照时间 16h/d。8 增殖继代培养组培苗增殖是通过周期性继代培养实现的，继代培养周期根据培养苗大小而定，一般在培养 30d-50d 完成 1 次继代。8.1 培养基制备增值继代培养选用 MS + IBA 0.1 mg /L +6-BA 1.0mg /L。DB15/ XXXXXXXXX58.2 增殖接种在超净工作台内，将腋芽萌发的无根瓶苗切成长度 2cm 左右的茎段，每个茎段上保留有 1 个芽，形成增殖继代培养的外植体。每瓶培养基均有接种 3 个外植体（茎段） 。茎段下部插入培养基内，芽露出，盖紧瓶盖；注明编号。8.3 培养方法将

12、接种完毕进行继代培养的培养瓶送到培养室，整齐摆放在指定的组培架上；一般每 30d 更换培养基 1 次。8.3 培养环境培养室温度 252，相对湿度 7080， 光照强度 1500lx3000lx，光照时间16h/d。9 生根培养9.1 培养基制备生根培养基选用 1/2MS + IBA 0. 1 mg /L。9.2 生根接种当继代增殖培养小苗长至 2. 0 cm3. 0 cm 高时，在超净工作台内，从培养基上部剪取生长健壮、叶片舒展、叶色正常、大小相近的无根苗接种在生根培养基上进行生根培养，每个培养瓶均匀接种 3 株无根苗。无根苗在培养基中的插入深度为 1.0mm1.5mm，以保持无根苗直立为宜

13、。一般 20d45d 即可生根。9.3 培养方法将接种完毕进行生根培养的培养瓶送到培养室，整齐摆放在指定的组培架上；一般每 30d 更换培养基 1 次。9.4 培养条件培养室温度 252；相对湿度 7080；光照强度 1500lx3000lx；光照时间为16h/d。10 组培苗炼苗移栽10. 1 组培瓶练苗元宝枫组培苗生根培养后，选择有 35 片正常绿叶、苗高 5cm6cm、具有 2 cm3 条白色嫩根组培瓶苗，于出瓶前 2 周置于温室苗床上，保持环境温度 252，光照强度 15002000 lx 左右，进行过渡锻炼。出瓶前 1 周，将瓶口盖子逐步打开进行开DB15/ XXXXXXXXX6瓶锻

14、炼，即首先松盖 1d2d，然后部分开盖 1d2d，最后完全揭去盖，让瓶苗逐步适应外界的光照和湿度，待瓶苗生长到 23 个叶片时进行穴盘练苗。10.2 温室穴盘练苗10.2.1 基质采用容积比为河沙草炭 珍珠岩=532 混合物为基质。一般用多菌灵 800 倍液浸湿基质，用塑料布覆盖灭菌 24h 后使用。10.2.2 穴盘瓶苗采用塑料穴盘容器进行移栽。塑料穴盘容器规格一般选用孔径 8cm、深度 8cm，穴盘孔数无限定。10.2.3 填装用灭菌后的基质填充穴盘容器到饱满位置后，用刮板刮去多余基质，适当喷淋清水保湿，待用。10.2.4 瓶苗清洗将培养瓶中的幼苗连同培养基一起从培养瓶中取出，用常温清水洗

15、去基部培养基，动作轻柔避免破坏幼苗根部，切忌用力过重造成伤口而损伤幼苗。10.2.5 穴盘栽植将清洗完毕的幼苗植入穴盘盘孔基质居中位置，保持幼苗根系舒展，扶正茎叶，轻压幼苗周边基质。将植满幼苗的穴盘置于温室苗床上，常温清水饱和喷淋一次。10.2.6 温湿度管理每天用细喷雾壶喷水，使环境湿度保持在 8090之间，昼温 2129，夜温1821。可用薄膜覆盖来保持湿度，外面用遮阴网罩上，避免阳光直射。1 周以后，逐渐降低湿度。10.2.7 病害防治移栽后每隔 7d 喷施 1 次 800 倍液多菌灵或 50% 代森锰锌或 70%甲基托布津等杀菌剂，并要防止交叉感染。对于温室，使用前要进行 1 次彻底的

16、消毒灭菌，用百菌清烟雾剂熏蒸 34 次，温室使用后每隔 7d 喷一次福尔马林、来苏水等广普性杀菌剂。10. 3 温室容器练苗10.3.1 容器移栽DB15/ XXXXXXXXX7经过 1 月左右的驯化，当苗木表现为叶色深绿、叶片增大、有新叶长出，且形成根团时，将穴盘中的幼苗连同基质一起移栽到相同基质的直径 18cm、深度 20cm 的无纺布袋中，置于温室苗床继续培养。10.3.2 水肥管理移栽后先在遮阴且通风良好的条件下培养 4d5d，每天向叶面喷水 12 次，1 周后逐渐撤掉遮阴。每隔 20d 向苗木喷施 0.2%0.3%的尿素 1 次，用量为 3g/m25 g/m 2。10.3.3 病虫害

17、防治发现虫害、病害及时药物治疗。危害元宝枫苗木的害虫主要有京枫多态毛蚜、黄刺蛾、天牛、尺蠖等，应用黄色粘虫板驱避蚜虫，用辛硫磷 800 倍液喷施防治黄刺蛾、天牛、尺蠖。常见的病害有叶斑病、褐斑病和白粉病，可用 50%的多菌灵可湿性粉剂 800 倍液喷施，每半月喷施 1 次，连续 2-3 次。10.4 大田栽植炼苗10.4.1 移栽待苗木在温室生长 15d30d 后，将苗木放置在室外遮阴棚内过渡 1 周，遮阴棚使用透光率为 80%的遮阴网，温度控制在 35以下。之后将容器苗连同育苗容器一起置于预先开好沟的苗圃地，沟深 20cm，间距 1m。移栽容器苗间距 50cm，移栽后将四周用土掩埋，上部覆土

18、 2cm3cm。并及时浇透水 1 次。10.4.2 大田水肥管理苗木移栽后，要及时浇好头三水，第一水是移植后浇透水，第二水是移植后 48h 浇透水，第三水是浇二水后的 3-5 日内浇透水。在无降雨且气温较高时，每周浇水 1 次。以后每月浇水 1-2 次。苗圃地于前一年秋季深翻，并施入有机肥 60000kg/hm2。10.4.3 大田病虫害防治参见 10.3.3。DB15/ XXXXXXXXX8附录 1(资料性附录)MS 培养基母液配配制表母液名称 编号 化试名称 mg/L 扩大倍数 扩大后称量mg 母液定容体积 mL 配置培养基吸取量 mL/LA NH4NO3 1650 20 33000 10

19、00 50KNO3 1900 20 38000CaCl22H2O 440 20 8800MgSO47H2O 370 20 7400大量元素KH2PO4 170 20 3400B FeSO47H2O 27.8 100 2780 1000 10铁盐Na2EDTA2H2O 37.3 100 3730C MnSO44H2O 22.3 100 2230 500 5ZnSO47H2O 8.6 100 860H3BO3 6.2 100 620KI 0.83 100 83Na2MoO42H2O 0.25 100 25CuSO45H2O 0.025 100 2.5微量元素CoCl26H2O 0.025 100

20、2.5D 甘氨酸 2 200 400 1000 5盐酸硫胺素 B1 0.1 200 20盐酸吡哆酸 B6 0.5 200 100烟酸 0.5 200 100有机成分E 肌醇 100 50 5000 500 10DB15/ XXXXXXXXX9附录 2(资料性附录)常用植物生长物质的母液配置类别 种类 配置方法 常用浓度(mg/L)6-BA 0.10.2KT 0.052.0ZT 0.052.0细胞分裂素2-iP先用少量 0.1mol/L 的盐酸(HCl) 溶解，然后加蒸馏水定容。 0.052.00.11.0IAA0.55.00.051.0IBA0.25.00.010.5NAA0.22.0生长素2

21、， 4-D先用少量 0.1mol/L 的 KOH 或 NaOH溶解，然后加蒸馏水定容。0.012.0赤霉素 GA3 先用少量酒精溶解，然后加水定 0.010.5DB15/ XXXXXXXXX10元宝枫组织培养技术规程编制说明1、工作简况（包括任务来源，起草单位，主要起草人）任务来源：根据内蒙古自治区质量技术监督局 2017 年地方标准修订计划项目（内质监标函201770 号）的通知，由内蒙古和盛生态科技研究院有限公司承担了元宝枫组织培养技术规程的编写工作。起草单位、协作单位本标准负责起草单位：内蒙古和盛生态科技研究院有限公司本标准参加起草单位：内蒙古农业大学、内蒙古和盛生态育林有限公司、北京蒙

22、树生态环境工程有限公司、赤峰市园林管理局主要起草人：表 1 元宝枫组织培养技术规程编写成员名单姓名 性别 职务/职称 工作单位 任务分配赵泉胜 男 董事长兼总裁 内蒙古和盛生态科技 有限公司 负责人赵鹏武 男 讲师 内蒙古农业大学 参与部分工作铁英 女 副总裁 内蒙古和盛生态科技 有限公司 参与部分工作封卫平 男 副总裁 内蒙古和盛生态科技 有限公司 参与部分工作斯钦毕力格 男 副教授 内蒙古农业大学 参与部分工作王娟 女 技术员 内蒙古和盛生态科技 研究院有限公司 编写人田菊 女 技术经理 内蒙古和盛生态科技 编写人DB15/ XXXXXXXXX11研究院有限公司王淑杰 男 高级工程师 赤峰

23、市园林管理局 参与部分工作2、制定标准的必要性和意义元宝枫( Acer truncatum Bunge)，又名华北五角枫、元宝槭，属于槭树科槭树属落叶乔木树种，因其翅果形状酷似中国古代 “金锭” （元宝）而得名。当前，我区水资源匮乏，发展抗旱的木本植物已经成为一个趋势。在干旱半干旱地区的应用元宝枫进行造林，其成活能力较高，这是由于元宝枫可以通过多种方式适应干旱。元宝枫侧根极发达，含有 VA 菌根，抗逆性强，特别是抗干旱能力强，一旦受到干旱胁迫，元宝枫就大幅度降低叶水势，增强吸水能力。今后一个时期，元宝枫作为一种优良的荒山造林树种，将能在我区生态环境建设中特别是林业生态工程建设中发挥巨大作用。同

24、时，元宝枫树冠荫浓，树姿优美，叶形秀丽，嫩叶红色，入秋后，叶片变色，红绿相映，甚为美观，是传统上营造风景林的重要树种，栽培苗木供不应求。另一方面，元宝枫具有重要的食用、药用、保健、工业原料以及风景园林旅游资源价值。依靠元宝枫组织培养技术对于其资源保存、新品种选育等方面有着很好的应用前景，对我区进一步研究该技术对槭树的苗木组培快繁有很大的推动作用。目前，元宝枫虽可用于播种或扦插繁殖，但其传统播种繁殖周DB15/ XXXXXXXXX12期长，繁殖系数低，且容易发生变异，再加上扦插繁殖成活率的技术难题也一直未能突破，从而导致元宝枫优良种苗的价格在市场上一直处于高位运行，没有下降的趋势。近年来，在元宝

25、枫大面积造林中，虽然已在其组织培养方面取得了一些进展，但由于缺乏组织培养技术规程进行规范，要实现大规模组培育苗还存在较大困难。元宝枫种苗是内蒙古自治区元宝枫造林生产的重要基础，种苗生产标准化、规模化、产业化是元宝枫造林发展的重要内容，规范内蒙古自治区元宝枫组织培养技术管理，建立元宝枫组培体系，制定其技术规程成为元宝枫种苗扩繁的必须基础环节。为此，编制元宝枫组织培养技术规程对于实现元宝枫组培育苗的规范化，提高苗木的产量和质量，具有重要意义。3、主要起草过程本标准是在大量查阅相关资料及实地考察的基础上，了解了元宝枫在国内外的研究现状及发展需求，在一定的研究基础上提出的。多年以来，本标准编制课题组成

26、员对元宝枫市场需求进行了大量的考察，发现元宝枫作为优良经济树种具有巨大的开发价值，但市场苗木供不应求，实生播种苗木良莠不齐，而本课题组成员已掌握了元宝枫组织培养的初步技术。2017 年 3 月，在已有研究的基础上着手本标准起草，并对试验结果进行验证。于 2017 年 4 月完成征求意见稿撰写，2017 年 6 月内蒙古质监局关于下达 2017 年第一批内蒙古自治区地方标准制修订项目计划的通知，之后完善本标准的DB15/ XXXXXXXXX13具体内容，并邀请相关领域专家进行了两轮评审，根据提出的修改意见对本标准文本进行了修改完善，于 2018 年 6 月完成了征求意见稿，由内蒙古林业厅下发文件

27、，征求各盟市和林业系统相关单位意见。根据提出的修改意见对本标准文本进行了修改完善，于2018 年 7 月形成送审稿。4、制定标准的原则和依据，与现行法律、法规、标准的关系经搜索元宝枫组织培养技术规程没有相应的国家标准，行业标准和内蒙古自治区地方标准。与本标准有关的标准有 “茶条槭育苗及栽培技术规程” 、 “红花槭穴盘苗生产技术规程（DB3201/T 108-2007） ”和“林木组织培养技术规程（LY -T 1882-2010） ”，但以上规程中均未涉及元宝枫组织培养内容。5、主要条款的说明，主要技术指标、参数、试验验证的论述5.1 主题和范围元宝枫是我国特有的经济树种，具有较强的抗逆性，是我

28、国重要的能源树种，也是重要的生态建设、园林绿化树种。目前，元宝枫主要通过播种进行繁殖，但播种苗个体差异较大，生长良莠不齐，不能满足市场快速发展的需求。 元宝枫扦插生根较困难，而嫁接技术要求相对较高，且优良接穗数量有限。为此，本标准建立了元宝枫组织培养技术体系，为优良元宝枫幼苗生产工作提供技术指导。本标准适用于元宝枫组织培养技术生产。DB15/ XXXXXXXXX145.2 设项本规程规定了元宝枫组织培养的术语和定义、环境及器具灭菌、培养基配制、外植体及其灭菌、初代培养、增殖继代培养、生根培养、组培苗炼苗移栽等基本内容及技术要求。5.3 取值和主要参数来源本标准为设项的指标分别做出了具体的规定。

29、各设项的规定均主要基于本标准课题组实际操作和相关文献信息。6、重大意见分歧的处理依据和结果无7、采用国际标准或国外先进标准的，说明采标程度，以及国内外同类标准水平的对比情况无8、其他应说明的事项无9、附件：意见汇总表序号 意见 提出单位/专家 采纳 不采纳（说明原因） 1 依据实验顺序，调整内容 张文军 采纳2 删除本文本中引用 LY-T 1882-2010 中的术语和定义张文军 采纳DB15/ XXXXXXXXX153 增加组培瓶苗、过滤灭菌等术语和定义王生军 采纳4 增加超净工作台消毒灭菌的具体方法张文军 采纳5 增加接种器具消毒灭菌的具体方法王生军 采纳6 对外植体采集方法进行具体描述德永军 采纳7 应对外植体灭菌消毒的注意事项进行详细描述张文军 采纳8 应指明各阶段的培养周期 王生军 采纳9 应标明炼苗穴盘规格及基质装填方法德永军 采纳10 指明容器苗移栽适宜的时间王生军 采纳11 指明各类病虫害防治的方法王生军 采纳12 增加大田移栽炼苗内容 德永军 采纳13 应指明外植体接种的具体方法德永军 采纳14 将植物生长物质更名为植 王生军 采纳DB15/ XXXXXXXXX16物生长调节物质15 标题“7.2 外植体的接种” 、“ 8.2 培养方法” 、 “ 9.2 培养方法”应写明在超净工作台内操作。内蒙古林业监测规划院采纳