1、组织工程软骨生物支架材料研究新进展前言关节软骨为覆盖关节表面的一层光亮的结缔组织,富有弹性，摩擦系数小，能吸收关节间的振荡，是机体重要的力学器官之一。关节软骨属于透明软骨，组织代谢活性较低，创伤及退行性变等所致的软骨损伤难以自我修复或以纤维软骨、纤维组织所填充替代。这种损伤可涉及全层关节软骨和软骨下骨，表现为关节的疼痛和功能障碍。两个半世纪以来，人们一直致力于探索修复软骨缺损的最佳途径和方法，其中包括软骨刨削、钻孔、微骨折术、软骨组织移植术等，这些治疗方法均存在不同程度的限制如：供体来源不足，免疫排斥、生成软骨不佳、远期效果不好等，远不能满足临床应用的需要。由Langer和Vacanti提出的
2、组织工程学使得关节软骨的生物学替代物即人工软骨显示出美好的前景。生物支架材料是构建人工软骨的中心内容之一， 本文检索PubMed数据库及中文期刊全文数据库200301200612有关组织工程软骨生物支架材料的文章，就近年来生物支架材料的新进展做一综述。正文1 生物支架材料概述作为细胞赖以生存的三维空间生物支架材料不仅提供软骨细胞生长依附的空间架构、力学需求和几何形状，更重要的是它作为细胞外基质之一，可以协调生物活性因子和细胞之间的相互作用，增进细胞的附着，潜在地影响细胞表面因子受体的表达和细胞的分化。理想的生物支架材料应该具有以下10个特征： 良好的生物相容性。可降解性。足够的孔隙结构。 促进
3、细胞黏附与增殖。 具备承载生长因子的能力。 支架的容积应能保持不变。 支架能与周围组织融为一体。 不易从缺损区脱落。 具有一定的弹性。 具有关节软骨的分层结构。目前常用的支架材料按其应用形态可分为：凝胶类、微球类、海绵类、人工高分子聚合物支架材料；按其来源可分为：天然生物材料、人工合成高分子材料和复合材料。天然生物材料主要包括：胶原、明胶、纤维蛋白、壳聚糖、琼脂、糖胺多糖(如：透明质酸、硫酸软骨素等)、藻酸盐、蚕丝蛋白 、松质骨骨基质、脱细胞基质等。作为天然的细胞外基质成分或同源成分，天然生物材料具有良好的生物相容性和弱抗原性且材料本身含有特殊的氨基酸序列，有利于细胞表面黏附分子识别，并能维持
4、细胞的分化状态。天然脱细胞包括脱细胞软骨基质、小肠黏膜下基质等，其方法主要是利用同种或异种器官组织，经过脱细胞、去除抗原处理得到脱细胞基质材料。该材料具有细胞外基质成分，有良好的组织亲和性和相容性，有利于细胞的黏附、增殖和分化，并且具有一定的力学强度。但是脱细胞基质比较致密，孔隙率较低制约着种植细胞向深层发展，因此天然脱细胞生物支架材料有待于进一步改进。Yin等报道制备一侧松质骨，一侧皮质骨的“双相”骨质基明胶，体外接种免骨髓基质干细胞以修复兔关节软骨缺损。结果显示：“双相”骨质基明胶松质骨面，细胞于其中增生，形成富含细胞的软骨层；皮质骨面，细胞层状覆盖于其表面，可作为支撑作用的软骨下骨。术后
5、1个月即可重建关节骨软骨缺损；6个月内始终保持关节面及软骨下骨结构完整。天然生物材料来源于动物或人体，其网状结构、成分、生物力学环境适合种子细胞的生长、发育及新陈代谢，材料可降解，因此越来越受到研究者的重视。但是在运用中均存在不足：如胶原、纤维蛋白、琼脂等在体外水解过程中不能保持空间构型，并且吸收过快；壳聚糖支架的亲水性、吸附能力较差，降解率偏慢。而且天然材料每批之间都有差别，产品质量比较难以控制，因此亟待对天然生物材料进行多材料复合等改性。3 人工合成高分子材料人工合成高分子材料的微结构、机械性能以及材料的降解时间等都可以预先设计和调控。目前常用的主要包括：聚乙醇酸、聚乳酸、B一磷酸三钙、聚
6、乙二醇(PEG)、聚乙内酯(PCL) 、聚氨酯(polyurethane) 引、聚乙烯氧化(polyethylene oxide)、聚N异丙基丙烯酰氨(PNIPAAm)等。目前运用较广泛的聚乙醇酸、聚乳酸由于具有良好的生物相容性、可降解性、降解可调性等，已被美国食品与药品管理局(FDA)批准可用于组织工程支架材料。但是在运用中也发现了不少缺点，如其亲水性不够，对细胞的黏附性较弱，降解产物偏酸性可引起炎症反应，并且有一定的免疫原性 。lbusuki等用聚N一异丙基丙烯酰氨与凝胶制成可注射热反应凝胶支架，并接种兔软骨细胞，结果表明细胞扩张增值，培养12周后，生成的胶原和硫酸糖胺聚糖(sGAG)含量
7、接近体内透明软骨。近年来法国地中海大学成功地研制了微孔结构可控的B一磷酸三钙多孔陶瓷材料，该材料不仅具有良好的生物相容性和较高的机械强度，而且能够根据需要调节材料在体内的降解时间。其平均孔径为100-300 m， 孔隙率为52 ， 孔与孔之间连接桥大小为30100 m，其体内完全降解时间在6个月左右。郭希民等将扩增后的骨髓间质干细胞接种到预制的B一磷酸三钙上，植入羊关节软骨缺损处，发现p一磷酸三钙在体内具有良好的生物相容性和软骨组织生长引导能力，其微孔结构适宜软骨组织生长，新生组织为透明软骨样组织，结果表明B一磷酸三钙为目前软骨组织工程较为理想的细胞支架材料。4 复合材料复合材料是目前研究的热
8、点， 即将两种或两种以上具有互补特征的生物相容性可降解材料，按一定比例和方式组合，可设计出结构与性能优化的三维材料。以弥补单用人工合成或天然生物材料的缺陷。复合材料的制备不仅包括同一类生物材料的复合，还包括不同类别生物材料之间的交叉复合。41 天然生物材料之间的复合软骨细胞外基质为胶原蛋白和糖胺聚糖形成的物理与化学交联网络，该基质不仅使细胞在空间结构形成特定的组织，而且还为其提供和传导环境信号，引导细胞粘连。并形成组织之间的间隔。运用仿生学原理，通过多种天然生物材料的复合，模拟软骨细胞外基质成分来构建与人体软骨组织结构和性能相类似的支架材料即仿生材料。目前常用的包括：壳聚糖，型胶原l、壳聚糖，
9、透明质酸、壳聚糖，硫酸软骨素、纤维蛋白，透明质酸、胶原、明胶、胶原、透明质酸、硫酸软骨素、壳聚糖、藻酸盐、透明质酸钠、明胶、硫酸软骨素、透明质酸钠等。Yamane等用壳聚糖和透明质酸混制得水凝胶，接种软骨细胞发现细胞能很好地贴附于材料上，并且能维持细胞表型，存在有限的有丝分裂，能生成型胶原及蛋白聚糖等。阎继红等用刀研制胶原一透明质酸一硫酸软骨素支架，结果表明该复合支架有较强的案水性，软骨细胞在支架上增殖分化良好，并分泌大量新的细胞外基质，保持球型的软骨细胞形态，维持表达特有的型胶原分化表型。体外培养21 d已有软骨样组织形成，出现软骨陷窝。Hsu等将软骨细胞植入精氨酰一甘氨酰一天冬氨酸肽修饰的
10、壳聚糖藻酸盐透明质酸钠复合支架，发现软骨细胞能良好地在支架上黏附生长和繁殖，并分泌丰富的糖胺聚糖和型胶原。将细胞支架复合物植入兔关节软骨缺损处，8周后缺损区完全修复，研究表明该支架的壳聚糖，藻酸盐最佳比例为：1：1。42 人工合成高分子材料之间的复合主要包括： 聚乳酸羟基乙酸、聚磷酸钙纤维，L 聚乳酸、聚己内脂，乳酸共聚物、聚氧乙烯聚氧丙烯共聚物、对苯二甲酸聚乙二醇酯一对苯二甲酸丁二醇酯共聚物(PEGT，PBT)、3 一羟基丁酸、3 一羟基己酸共聚酯，聚羟基丁酸脂(PHBHHPHB)、聚对二氧六环L 聚乳酸，聚乙二醇(PPDOPLLAbPEG)等。Malda等采用三维纤维沉淀技术制成的对苯二甲
11、酸聚乙二醇酯一对苯二甲酸丁二醇酯共聚物多孔支架，具有良好的孔隙率(7580)和孔径(平均525 m)，进行体内培养14 d后显示：该支架能促进基质的分泌，GAGDNA 重量比与正常软骨相近，为一种较为理想的支架材料。清华大学微生物实验室开发了3一羟基丁酸、3一羟基己酸共聚酯聚羟基丁酸脂共混体系作为新型的组织工程材料。研究表明该材料呈现比聚乳酸更好的生物相容性和一定强度的韧性，其生物材料的最终代谢产物为水和二氧化碳，对细胞无毒。培养在3一羟基丁酸、3一羟基己酸共聚酯聚羟基丁酸脂共混支架上的软骨细胞不但能够生长、增殖，而且保持了正确的分化形态，胞外基质中发现大量磷酸钙盐生成，其成分为天然骨及软骨中
12、的主要无机成分羟基磷灰石。3一羟基丁酸、3一羟基己酸共聚酯聚羟基丁酸脂最佳比例为2：12023。Bhattarai等采用聚对二氧六环，L聚乳酸，聚乙二醇纤维制成的电镀薄膜。实验表明：该支架具有良好的直径(平均为380 nm)、中间孔径(8 m)、孔隙率(80)及机械强度(14 MPa)。接种NIH3T3成纤维细胞进行体外培养发现，该 架具有良好的细胞相容性，能诱导细胞增殖，保持细胞表型。43 天然生物材料与人工合成高分子材料之间的交叉复合利用天然生物材料的良好生物相容性、细胞表面识别信号和人工合成高分子材料合适的机械性能等特性，设计出结构与性能优化的三维材料。卢华定等 研制具有分层柱状结构的胶
13、原一羟基磷灰石复合支架，该支架表层为胶原；中层为多孔胶原一羟基磷灰石复合；底层为羟基磷灰石。研究表明该复合支架具有良好的细胞相容性、亲水性，较胶原纤维有更强的力学性能，有望成为比较理想的软骨支架材料。李忠等 。 将胶原凝胶包埋的软骨细胞整合入聚乳酸，羟基乙酸、聚磷酸钙纤维，L聚乳酸巨孔三维支架进行体外培养。既能发挥巨孔三维支架力学强度好及易于塑形等优点，又能发挥胶原凝胶对细胞的均匀包埋和黏附作用。结果显示软骨细胞能高效种植、均匀分布于支架内并能在支架上良好的黏附、生长和增殖，细胞一支架复合物能保持培养前的形貌，新形成组织为透明软骨样组织。分析天然高分子材料对于用于人体骨骼支架具有可行性。在未来
14、不久，这一技术的开发和利用将受用与千千万万的残疾人，对人类的机体活动再生能力作出贡献，它的市场开发前景光明且越来越受到重视。总结随着分子生物学、生物材料学等的发展，新型材料不断开发，如羟基磷灰石纳米微粒聚左乳酸复合 12物 、细茵纤维素、纤维蛋白聚亚胺酯 、电镀壳聚糖聚氧乙烯纤维等，实验证明这些支架材料都具有人工软骨支架的潜能。然而迄今为止还没有任何一种材料被认为最理想，寻求一种具有良好的细胞相容性，可控制的降解率并具有一定力学强度的支架材料是关节软骨组织工程的关键。目前生物支架材料研究的主要方向是： 一是通过对支架材料进行物理和化学的表面修饰以改善材料的表面活性，使之与种子细胞有更好的黏附、
15、分布和功能发挥二是采用新型构建技术(如RP技术等)等方法对材料的表面形态和空间结构进行改性，弥补支架材料的不足以构建理想的支架材料；三是利用天然和合成材料 19的各自优势联合应用，进行多材料复合，以研制出具有生物相容性好、力学适应能力强的复合材料。随着纳米材料、仿生材料及智能材料等的研制与开发以及种子细 胞分离培养技术的提高，相信在不久的将来，关节人工软骨将是治疗关节软骨损伤的一种理想的治疗方法。1 鄂征，刘流医学组织工程技术与临床运用 ：ITS：北京出版社，2003，378-3792 Aoki H， Tomita N， Morita Y， et a1 Cultu怕of ch0nd 啪s in
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