H5亚型流感病毒（AIVH5）实时荧光定量检测试剂盒使用说明书.docx

1、1Focus on Animal Health!BIOCONJH5 亚型流感病毒实时荧光 RT-PCR检测试剂盒使用说明书简介：本试剂盒采用实时荧光 RT-PCR 方法检测鸡等畜禽的脾、胸腺、肺等组织病料和咽喉、泄殖腔拭子等体液病料中的 H5 亚型流感病毒的 RNA。适用于 H5 亚型流感病毒的诊断、检测和流行病学调查。试剂盒组成病毒 RNA 核酸提取试剂盒（大盒） 保存 50 次裂解液 VLB 室温 20ml裂解液 RLT 室温 50ml抑制物去除液 RW1 室温 40ml70%乙醇 室温4ml RNase-free H2O 9ml RNase-free H2O（自行配制）漂洗液 RW 室温

2、10ml第一次使用前按说明加指定量乙醇（42ml）RNase-free H2O 室温 10ml吸附柱 RA 和收集管 室温 50 套PCR 检测试剂盒（小盒） 保存 48 次H5 PCR 反应液 -20 750lOne step enzyme -20 50lH5 Smart Mix -20 130lPositive control -20 500lNegative control -20 1mlRNase free H2O -20 1ml一、核酸提取试剂盒（大盒）使用说明：适用范围：适用于快速从家禽的脾、胸腺、肺、咽喉、泄殖腔拭子等病料中提取病毒 RNA，室温储存 12 个月不影响使用效果，各

3、溶液使用后应及时盖紧盖子。2Focus on Animal Health!BIOCONJ提示：第一次使用前请先在 10ml 漂洗液 RW 中加入 42ml 无水乙醇，充分混匀，加入后请及时在方框打钩标记已加入乙醇，以免多次加入!1.动物咽喉拭子、泄殖腔拭子、尿囊液等无细胞体液样本总 RNA 提取方法操作步骤：（实验前请先阅读注意事项见附录）1. 200l 拭子等体液样本（需回复到室温，不足可用 0.9% NaCl 或者 PBS 补足）转入上述 1.5ml 离心管，加入 400l 裂解液 VLB，立刻涡旋振荡充分混匀 。2. 室温(15-25) 放置 10 分钟，每隔 5 分钟，振荡混匀一次。3

4、. 加入 450l 无水乙醇，立刻涡旋振荡充分混匀 。a) 如果周围环境高于 25,乙醇需要冰上预冷后再加入。4. 将上述混合物加入一个吸附柱 RA 中， （吸附柱放入收集管中）13,000rpm 离心 30-60 秒，倒掉收集管中的废液。a) 如果总体积超过 750l，可分两次将溶液加入同一个吸附柱 RA 中。5. 加抑制物去除液 RW1 500l，12,000rpm 离心 30 秒，弃废液。6. 加入 500l 漂洗液 RW（请先检查是否已加入无水乙醇!） ，12,000rpm 离心 30 秒，弃废液，加入500l 漂洗液 RW，重复一遍。7. 将吸附柱 RA 放回空收集管中，13,000

5、rpm 离心 2 分钟，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。8. 取出吸附柱 RA，放入一个 RNase free 的离心管中，在吸附膜的中间部位加 30-50l RNase free H2O（事先在 6570水浴中加热效果更好） ，室温放置 1 分钟，12,000rpm 离心 1 分钟。如果想得到较多量的 RNA，可将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，12,000rpm 离心 1 分钟。a) 洗脱体积越大，洗脱效率越高。如果需要 RNA 浓度较高，可以适当减少洗脱体积，但是最小体积不应少于 20l，体积过小降低洗脱效率，减少 RNA 产量。9. 所提取 RNA 建议最好立刻使用，

6、否则立刻短期放置在-70备用。2.家禽等动物的脾、肺、胸腺等组织病料和病毒的细胞培养液等含细胞样本总 RNA 的提取方法。操作步骤：（实验前请先阅读注意事项）1. 动物组织（例如鸡等畜禽的肺、脾、胸腺等）a) 电动匀浆：新鲜组织用解剖刀迅速切成小碎块，加入 350l(30g，加 30-50l RNase free water 重复步骤 8，合并两次洗脱液，或者使用第一次的洗脱液加回到吸附柱重复步骤一遍(如果需要 RNA 浓度高)。所提取 RNA 建议最好立刻使用，否则立刻短期放置在-70备用。洗脱两遍的 RNA 洗脱液浓度高，分两次洗脱合并洗脱液的 RNA 产量比前者高 1530%，但是浓度要

7、低，用户根据需要选择。4Focus on Animal Health!BIOCONJ二、PCR 检测试剂盒（小盒）：本 试 剂 盒 采 用 RT-PCR 方 法 结 合 荧 光 探 针 的 扩 增 检 测 技 术 ， 通 过 荧 光 信 号 的 变 化 检 测H5 亚 型 流感病毒 RNA， 用 于 多 种 样 本 H5 亚 型 流感病毒 RNA 的 检 测 。储存条件及有效期-20 保 存 。 有 效 期 为 一 年 （ 请 于 有 效 期 内 使 用 ）。1.样本处理（样本处理区）在样本处理区制备 RNA，提取的样本 RNA 要使用 RNase free 离心管收集，冰上保存备用 （注意：

8、此时的 RNA 最易受 RNA 酶降解，请在 2 小时内进行 PCR 扩增） 。 2扩增试 剂 准 备 （ PCR 前准备区）从 试 剂 盒 中 取 出 相 应 的 PCR 反 应 液 、 Smart Mix、 onestep enzyme、 阴 性 对 照 、 阳 性 对 照 ， 在 室 温 下 融 化后 ， 2,000rpm 离 心 5sec。 设 所 需 PCR 管 数 为 n（ n = 样 本 数 + 1 管 阴 性 对 照 + 1 管 阳 性 对 照 ） ，每个测试反应体系配制如下表：试 剂 PCR 反应液 One step enzyme Smart Mix用 量 15l 0.8l

9、2.5l计算好各试剂的使用量，加入到一适当体积的离心管中，充分混合均匀，2,000rpm 离心 10sec；向每个 PCR 管 中 各 分 装 18l， 转 移 至 样 本 处 理 区 。3. 加样（样本处理区）在 各 设 定 的 PCR 管 中 分 别 加 入 制 备 的 RNA 溶 液 及 阴 性 对 照 、 阳 性 对 照 各 5-8l（ 每 管 加 入 相 同 体 积 模 板 ），盖紧管盖，于 2,000rpm 离心 5sec。将 PCR 管 排 好 放 入 PCR 荧光检测仪内，记录样本摆放顺序。4 PCR 反应（检测区）1循环条件设置Program cycles Temperatu

10、re () IncubationTime(min:sec)AcquisitonMode1 1 42 30:00 None2 1 92 3:00 None92 0:10 None45 0:30 None3 572 0:60 None92 0:15 None4 4060 0:30 收集荧光5 1 40 0:00 None反应体系为 25l。2仪器检测通道选择如有需要，荧光信号收集时设定为 FAM 荧光素。质控标准阴性对照的 Ct 值应为 none。阳性对照的 Ct 值应小于等于 30.0。5Focus on Animal Health!BIOCONJ结果判断Ct 值为 none 的样本为阴性。Ct

11、 值小于等于 30.0 的样本为阳性。Ct 值大于 30.0 的样本建议重做。重做结果 Ct 值为 none 为阴性，否则为阳性。对于某些未呈现 S 型曲线，但本底较高的样本，应为阴性。注意事项1. 所有的离心步骤均在室温完成，使用转速可以达到13,000 rpm的传统台式离心机，如Eppendorf 5415C 或者类似离心机。2. 需要自备乙醇，一次性注射器。3. 裂解液RLT，VLB 和抑制物去除液IR中含有刺激性化合物，操作时要戴乳胶手套，避免沾染皮肤，眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时，要用大量清水或者生理盐水冲洗。4. 匀浆组织加入裂解液后会变得澄清透亮，病毒RNA的提取注意样本的充分

12、裂解，以保证RNA 的提取，组织块如有裂解不充分可以放置5min再剧烈震荡，不能裂解的组织要瞬时离心取上清过柱以防堵塞柱子。5. 对于病毒RNA的提取要预防RNase污染，应注意以下几方面：1) 经常更换新手套。因为皮肤经常带有细菌，可能导致RNase污染。2) 使用无RNase的塑料制品和枪头避免交叉污染。3) RNA在裂解液RLT和VLB中时不会被RNase降解。但提取后继续处理过程中应使用不含 RNase的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150烘烤4小时，塑料器皿可在0.5M NaOH中浸泡10分钟，然后用水彻底清洗，再灭菌，即可去除RNase。4) 配制溶液应使用无 RNase 的水。（将水加入到干净的玻璃瓶中，加入 DEPC 至终浓度 0.1%( v/v)，37放置过夜，高压灭菌。）5) 将 RNA 提取物用 RNase-free 的 DNase I 处理。本试剂盒还可以用于 DNase I 处理后的 RNA 清洁(cleanup)，请联系我们索取具体操作说明书。