1、封闭抗体与免疫治疗的 临床意义及应用,深圳博爱医院 妇科钭妙莺,最新情况,2010年6月12、13日中山大学孙逸仙纪念医院举办全国女性生殖免疫最新进展学习班，共有16个省100多家医院派出医生到场学习 2012年12月1516日深圳市举办的妇科内分泌学术会，张建平及刘庆芝分别对复发性流产的淋巴免疫治疗进行了精彩的演讲。 生殖医学及免疫治疗已经成为时下国内医疗界最热门的话题。 深圳各大医院及民营医院在复发性自然流产的免疫治疗（LIT）领域目前已逐渐开展，其中包括深圳博爱医院。,概 况,RSA发病率：自然流产率5%2次自然流产率1%-5%，平均 2.3% 3次自然流产率0.34% 隐性流产30%4
2、0% 总的自然流产率为50%60%50%原因不明，其中80%与免疫有关复发率：随着流产次数的增加而上升,流产的病因,遗传因素 内分泌因素 解剖因素 感染因素 血栓前状态 精神、心理因素 免疫因素,遗传因素,流产胚胎绒毛染色体核型分析 夫妇染色体核型分析 夫妇双方珠蛋白生成障碍性贫血 G6PD缺乏的筛查及基因检测,内分泌因素,黄体功能不全 多囊卵巢缩合征 高泌乳血症 甲状腺疾病 糖尿病 检测项目有：性激素6项、甲状腺功能、胰岛素功能,解剖因素,子宫畸形：纵膈子宫、单角子宫、鞍状子宫、双角子宫 子宫动脉阻抗增高 宫腔粘连 子宫肌瘤、子宫腺肌病 宫颈机能不全 检测方法：超声波、造影、宫腔镜、腹腔镜检
3、查,感染因素,女性生殖道局部感染包括解脲支原体（UU）、衣原体（CT)、加得纳菌（BV）、梅毒螺旋体（TP）、外周血病毒感染等均可造成流产 检测项目：UU、CT、BV、TORCH 、TP等等,血栓前状态,多种因素引起的凝血、抗凝和纤溶系统功能失调或障碍的一种病理过程，有易导致血栓形成的多种血液学改变。 常用检没项目有凝血常规四项：血检前状态分子标志物，凝血酶原片断（F1+2），血栓调节蛋白（TM），凝血酶抗凝血酶复合物（TAT）、抗凝血酶（AT）、血小板颗粒糖蛋白140（GMP140）、血栓烷B2（TXB2）、D二聚体（D）、纤溶酶原激活物抑制物（PAI）,精神心理因素,焦虑、紧张、恐吓等严重
4、精神刺激均可导致流产。 常期脑力劳动孕妇较强烈的长期或反复的精神紧张、焦虑、烦躁等情绪变化，使大脑皮质兴奋抑制过程的平衡失衡，舒缩血管中枢受影响，子宫小动脉痉挛，绒毛缺血，胎儿发育障碍。,免疫因素,一、自身免疫型1、抗心磷酯抗体（APL）2、抗核抗体（ANA）3、抗精子抗体（ASA）4、抗子宫内膜抗体（AEA）5、抗卵巢抗体（AOA）6、抗滋养细胞抗体（ATA）7、 RH血型抗体,免疫因素,二、同种免疫型1、保护性抗体缺陷（封闭抗体阴性）2、淋巴细胞紊乱（NK细胞增多）,封闭抗体的概念,封闭抗体：在正常孕妇的血清中，存在一种抗配偶淋巴细胞的特异性IgG抗体，它可抑制淋巴细胞反应（MLR），封闭
5、母体淋巴细胞对培养的滋养层的细胞毒作用，防止辅助T细胞识别胎儿抗原的抑制物，并可阻止母亲免疫系统对胚胎的攻击。封闭同种抗原刺激的淋巴细胞产生巨噬细胞移动抑制因子（MIF），故称其为封闭抗体（blocking antibodies，BA），或称为（Antipaternallymphocyte anti body，APLA),淋巴细胞免疫治疗的概念,淋巴细胞免疫治疗（LIT）：Beer和Tayor于二十世纪七十年代创立，并于1978年开始应用于RSA的一种免疫疗法。对同种免疫型RSA患者彩用丈夫或他人淋巴细胞进行同种致敏治疗，抑制母胎间的细胞性免疫性排斥反应，减少流产率。 对于封闭抗体和抗独特型抗
6、体缺乏者，主要采用配偶淋巴细胞免疫疗法，等到患者体内抗体水平升高时进行受孕，妊娠的成功率可达到90%。,免疫性自然流产分类,类：同种免疫型 HLA相容性升高，封闭抗体缺乏1、正常妊娠：父源性HLA抗原刺激母体，产生封闭抗体。母胎耐受，妊娠成功2、复发性流产夫妇HLADQA（DQAI）相容性过大，封闭抗体不产生。免疫攻击，自然流产3、特性：缺少封闭抗体，多次流产后可诱发、类免疫异常的流产4、淋巴细胞免疫治疗（LIT）是最理想的治疗方法,免疫性自然流产分类,类：抗磷脂抗体APL（+） 抗磷脂自身抗体包括： 抗心磷脂抗体（ACL）、抗磷脂乙醇胺抗体（APEA）、狼疮抗凝血因子（CAC）、抗磷脂酰肌醇
7、抗体（APIL）、和抗磷酸抗体（APAA）。RSA患者APL（+）22%，每流产一次发生率增加15%。 特征：强烈的凝血活性、直接造成血管内皮细胞损伤、抑制滋养细胞的功能 治疗：阿司匹林+肝素治疗,免疫性自然流产分类,类：抗核抗体阳性ADA（+）和抗DNA抗体（+）。占RSA妇女的22%，在不孕或IVF失败的妇女中占50%。 有自身免疫性疾病的妇女关节炎和器管炎症及无自身免疫性疾病的妇女种植时胚胎周围发炎，种植后胎盘发炎。 特征：对抗胎儿和胎盘DNA 治疗：强的松治疗，继发于关节炎或SLA者与风湿免疫科一起治疗。,免疫性自然流产分类,类：抗精子抗体ASA和/或APL等组织特异性抗体阳性。不孕、
8、种植失败和RSA的病人约10%产生ASA。 特征：受孕困难 治疗：肝素+阿斯匹林+强的松治疗 下列情况需要检测ASA：1、抗丝氨酸中抗乙醇胺抗体阳性的妇女2、性交后试验不良的妇女（在宫颈粘液中精子死亡或不活动）3、配偶有ASA阳性,免疫性自然流产分类,类：NK细胞数量和功能紊乱 特征：CD56+、CD19+5+细胞数量或/和活性升高，分泌TNF和抗神经转移因子抗体 两类NK细胞可损伤妊娠CD56+产生TNF、损害蜕膜细胞和滋养细胞CD19+5+产生抗神经转移因子抗体，破坏滋养细胞产生的激素（如雌激素、黄体酮和HCG） 不良结果： 妨碍种植（多次种植失败）、损伤胎盘细胞、损害孕囊（孕囊变形）、绒
9、毛下出血（有时仅B起发现）、影响卵细胞DNA，致胚胎质量不良 治疗LIT、IVIg、代理妊娠,免疫治疗,淋巴细胞免疫治疗（LIT）适应症1、类免疫紊乱（封闭抗体缺乏）2、不明原因RSA3、夫妇DQa相容性大，或夫妇间有2个或2个以上相同的 HLA抗原4、无抗父亲淋巴细胞毒抗体5、微细胞毒交叉试验阴性6、全身免疫状态正常7、夫妻双方均愿意接受治疗,免疫治疗,淋巴细胞来源1、丈夫淋巴细胞2、 无关个体淋巴细胞3、血缘亲属淋巴细胞4、自身淋巴细胞,免疫治疗,治疗方法1、配制淋巴细胞浓缩液2、淋巴细胞计数为：3410 7/ml3、双侧前臂皮内或皮下多点注射（通常注射68针）4、每24周一次，每疗程4次
10、5、封闭抗体上升，或微细胞毒交叉试验阳性即可受孕，受孕后继续LIT治疗35周期6、妊娠成功率达75%85%。,封闭抗体检测,方法：ELISA 原理：用抗原包被微量板孔，制成固相载体，加患者血清到板空中其所含的抗体特异性地与固相载体中存在的抗原相结合，形成免疫复合物，除去多余的杂质后，加入辣根过氧化物标记的IgG抗体，使之与上述免疫复合物反应。洗板，除去多余的结合物，加入底物，与其酶结合的免疫复合物反应，产生有颜色产物，颜色强度与特异性抗体含量成正比。,封闭抗体检测,操作步骤：1、实验前准备1.1 实验记录表上填写待检病人的详细资料，包括姓名和编号。1.2 一块干板可同时人测十个样本，如不需检测
11、十个样本，可用封板膜将无需使和的实难孔及对照孔封实2、实验操作,封闭抗体检测,2.1 90ulAntibody Diluent加入10Antibody Diluent,摇匀，加入第一行CH孔，第二行以CE孔，每孔0ul.2.2 每份待检血清取20ul加入Antibody Diluent摇匀，分别加入312行AD孔（每人一人）每孔10ul.2.3 37孵育45分钟。2.4 配备1Wash buffer：取27ml蒸馏水加入3ml10Wash buffer，摇匀。,封闭抗体检测,操作步聚：2.5 孵育45分钟后将反应板扣干，用1Wash buffer洗板两次，扣干。2.6 稀释酶标抗体：取594u
12、l Antibody Diluent加入6ul Alkaline Phosphatase Conjugated (此为10人次所需试剂），摇匀。2.7 实验孔及对照孔均加入已稀释本科标抗体10ul，37孵育30分钟。,封闭抗体检测,2.8 扣干，用1Wash buffer洗板三次，扣干。2.9 各取Substrate A、B300ul，混匀，加入各孔10ul.2.10 避光孵育10分钟（37）。加入5ulStop Reagent终止反应。2.11 在已经设置好的酶标仪上进行读数，观察记录结果兰色为阳性，无色为阴性。（或都采用酶标仪读板）。,小 结,在反复性流产患者中，在排除如染色体遗传、内分泌
13、、生理解剖、感染、血栓等多种因素外，免疫因素是反复流产发病的重要病因。 免疫困素分为自身免疫型和同种免疫型，封闭抗体缺乏是导致免疫性反复流产的主要原因。 淋巴细胞免疫治疗在临床应用方面治疗反复性流产取得显著成效。,我院淋巴细胞主动免疫治疗的介绍和体会,信息资料： 取我院2010年12月-2012年12月不明原因早期自然流产（包括生化妊娠，IVF-ET种植失败）及胚胎停育2次或2次以上，且临床筛查确诊为封闭抗体缺乏所致的RSA患者共80例，愿意接受淋巴细胞免疫治疗者40例列为治疗组，采用淋巴细胞主动免疫进行治疗(LIT)。另40例作为对照组，对照组采用传统保胎治疗（黄体酮加HCG）。,我院淋巴细
14、胞主动免疫治疗的介绍和体会,本研究淋巴细胞免疫治疗应符合下列条件： （1）封闭抗体检查阴性； （2）生化妊娠及早期（12W前）自然流产史2次，或胚胎停育2次，或自然流产+胚胎停育2次； （3）夫妇双方染色体检查正常，无家族遗传病史,我院淋巴细胞主动免疫治疗的介绍和体会,（4）双方行TORCH（包括巨细胞病毒、风疹病毒、单纯疱疹病毒和弓形体）、梅毒、HIV、乙型肝炎、丙型肝炎检查均为阴性； （5）生殖道衣原体、支原体、淋球菌等检查均为阴性； （6）内分泌检查、甲状腺功能及空腹血糖正常,我院淋巴细胞主动免疫治疗的介绍和体会,（7）抗精子抗体、抗子宫内膜抗体、抗卵巢抗体、抗心磷脂抗体均为阴性； （8
15、）排除生殖道畸形和形态学异常； （9）男方精液分析正常； （10）治疗前3个月内未使用过调节免疫功能药物，未经任何免疫治疗。,我院淋巴细胞主动免疫治疗的介绍和体会,淋巴免疫的治疗方法： 无菌下抽取患者丈夫或血缘亲属或无关自愿健康个体静脉血20ml，肝素抗凝； 在无菌条件下分离淋巴细胞； 将淋巴细胞悬液装于注射器中，给予患者两前臂内侧行多点皮下或皮内注射，每侧注射3-4点，共68点。,我院淋巴细胞主动免疫治疗的介绍和体会,每2-3周治疗1次，4-6次为一疗程。 治疗一疗程后复查封闭抗体，若已转为阳性，要求3-5个月内尽快妊娠。 确诊妊娠后，再加强LIT一疗程（2-3周1次共4次）至妊娠14-16
16、周。 若转阳后半年内仍未能妊娠，应每隔8-10周巩固1次LIT，以使封闭抗体不转阴。 部分复查封闭抗体阴性者，再加强LIT治疗2次,若仍未转阴也可考虑备孕。,我院淋巴细胞主动免疫治疗的介绍和体会,注意事项： 1.严格掌握适应证，应全面细致地检查，不可滥用； 2.RSA病因复杂，往往是多因素的，在诊治方面应全面考虑综合治疗； 3.虽然LIT疗效成功率高，可达90%，治疗有效，但并非神话，治疗后仍然还有一些妊娠失败的病例，与患者知情沟通非常重要，签署知情同意书。,我院淋巴细胞主动免疫治疗的介绍和体会,4.双方上午空腹抽血，患者避开月经期，有生病情况者，过一周或数周治疗，治疗时避孕，治疗后观察半小时，严密观察有无腹痛、腰痛及阴道流血等，无不适离院； 5.1疗程结束后3周复查封闭抗体，阳性者尽快妊娠，未孕者则每3月后加强治疗1次； 6.一旦妊娠，及早安胎治疗，心理疏导，动态观察检验指标。 7.目前尚未发现不安全因素存在。,谢 谢！,
