亲水作用色谱HILIC实用指南.pdf

1、 指导与应用手册 1 版权所有 , 2005-2008 , Merck SeQuant AB 亲水作用色谱 HILIC实用指南 指导与应用手册 2 HILIC实用指南 http:/ 亲水作用色谱(HILIC)实用指南 原著作书名: A Practical Guide to HILIC 原著作者: Patrik Appelblad, Tobias Jonsson, Einar Pontn, Camilla Viklund and Wen Jiang 中文版编辑：Wen Jiang (江文） ISBN 978-91-631-8370-6 瑞典SeQuant AB出版, 地址: Box 7956,

2、907 19 Ume , Sweden. 版权所有 2005-2008, SeQuant AB 2008年2 月第一版，第一次印刷，瑞典于默奥(Ume ) 修订及额外资料可以在Merck SeQuant公司网页上找到，网址 。如有其它问题及信息反馈，请与联系。版权所有 , 2005-2008 , SeQuant AB HILIC实用指南 指导与应用手册 引言 本手册旨在介绍一种适用于分 析强极性和强亲水化合物的液相色谱分析方法 亲水作用液相色谱( Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography，HILIC)。主要介绍HILIC的基本理论和该分离模式下

3、的一些实际问题，同时给读者介绍瑞典SeQuant公司的ZIC-HILIC(硅胶基质)和ZIC-pHILIC(聚合物基质) 两性离子液相色谱柱(见图1 )，以及使用这两种色谱柱分析 不同类型亲水化合物的应用实例。您也会从本手册中获得该类色谱和其他方面的色谱知识。 图1 ZIC-HILIC和ZIC-pHILIC两性离子固定相的官能团 如果本手册不能解决您的HILIC问题，SeQuant愿为你提 供进一步帮助。首先，建议您登陆SeQuant公司网站主页()，从那您能找到关于我们产品的最新文献资料、应用报告和技术数据。如果您还需要其他信息，SeQ uant工作人员乐意为您提供更进一步帮助,请与我们的技

4、术支持联系()。 为什么使用HILIC? 尽管反相液相色谱（RPL C）是至今应用最广的色谱分离技术，它能与各种常规的检测方法结合，解决多种分析应用问题，但对某些分析物，特别是极性和亲水性化合物却无法或很少保留。长期 以来，人们采用正相液相色谱(NPLC)，并使用不利 环保的非水溶性流动相如己脘或环己脘来分析这些物质。 但是在这种实验条件下，很多 极性和亲水化合物往往很难溶解，从而限制了NPLC的应用范围。从现在起有了另一种新的解决办法，即选用亲水作用液相色谱-HI LIC。在HILIC色谱柱上，物质的洗 脱顺序与RPLC恰恰相反，如图2所示。换句话说，在RPLC柱上很难保留或根本不保留的物质

5、，在通常的实验条件下，它们在HILIC柱上有较强的保留。 图2 小肽在HILIC和RPLC柱上的分离 色谱柱: 1) ZIC-HILIC，150 x 4.6 mm；2) Kromasil C18, 150 x 4.6 mm；流动相：HILIC-60/40 (v/v) 乙腈/10mM乙酸铵，pH 7；RPLC-5/95 (v/v) 乙腈/10mM乙酸铵，pH 7；样品: 1) Phe-Gly-Gly-Phe；2) Leu-Gly-Gly；3) Gly-Gly-Gly HILIC技术和传统的NPLC有很多相似的之处，但又和它有很大的不同，最重要的不同点是它使用与RPLC的流动相组份相似的半水溶性流

6、动相，使待分析物和样品的基质在流动相中的溶解度大大提高。典型的HILIC流动相是由水或挥发性缓冲盐溶液以及40-97的乙腈组成的，这些决定了HILIC很适合与质谱检测器(MS)或蒸发光散射检测器(ELSD)联用。在分析亲水化合物时，如将反向色谱改换成亲水作用色谱，检测灵敏度通常会提高10-1000倍。另外，使用亲水作用液相色谱还可避免使用离子对试剂，这对于制备型色谱分离是很有益的 。 4 HILIC实用指南 http:/ HILIC的色谱系统 HILIC色谱系统在仪器结构上与RPLC相同。但由于其流动相与RPL C相似，人们可能会试图使用RPLC 常规的样品制备和净化方法用于HILIC分析，这

7、样往往会给广大色谱工作者制造很多麻烦。因此，随后的几个章节将详细讨论HILIC色谱系统的关键部件以及成功操作的方法，同 时也会描述这些建议的理论根据。 HILIC色谱柱 HILIC柱的固定相是亲水的， 而且通常在一定pH 范围内是带电 荷的。待分析物与固定相相互作用在一般情况下是：亲水性越强的化合物，被保留的时间越长。和大多数其他液相色谱技术不同的是HILIC的部分流动相是作为固定相的一部分来起作用的( 具体原理在下面章节介绍) ，因此关键的是要在流动相中保持一定量的水。一般情况下，水的比例应保持在3-60%的水平。 HILIC的保留特性 在HILIC 工作条件下，固定相 表面会首先建立一个富

8、集水的液体层，待分析物在流动相和该亲水 层之间进行分配，从而实现分离(见图3)。这是一个典型的放热过程，氢键作用和偶极间的相互 作用是影响保留强弱的主要因素。当然氢键作用的大小会取决于物质的酸碱度，而偶极- 偶极相互作用会取决于物质的偶极矩与极化性。 HILIC固定相的主要作用是固 定水，但如果固定相是带电荷的，离子静电作用也会影响化合物在色谱柱上的保留。图3示意性地描述了两性离子固定相对极性和亲水化合物的保留机理。 二级交互作用 除了HILIC 中亲水分配的初级 保留作用以外，带电荷的固定相往往提供第二个十分重要的、有选择性的保留作用，也就是它的选择性大小还取于待分析物和固定相上电荷之间的静

9、电作用。降低静电作用可以通过提高流动相中 盐或缓冲盐的浓度来调节。高缓冲盐浓度破坏固定相与待分析物的相互作用，把分析物有效地洗脱出来。但是，高的的缓冲盐浓会增加质谱检测的离子抑制现象，从而对检测灵敏度产生负面影响。然而在两性离子固定相中，每个电荷的静电作用都会被邻近的反向电荷部分地平衡或抵消， 因此，总的静电作用是比较弱的，见图4。 较弱的静电作用允许流动相使 用较低的缓冲盐浓度，这对提高质谱检测器(MS)的检测灵敏度是有利的。中性的HILIC固定相一般也需要较低的缓冲液浓度，但它缺乏带电荷固定相的二级选择性。 图3 两性离子固定相上通过亲水分配和与静电作用的分离的HILIC保留机理 1) 待

10、分析物在流动相和固定相水层间的亲水分配作用；2) 待分析物与固定相季胺阳离子的静电作用；3) 待分析物与磺酸根阴离子的静电作用。 图4 血管舒缓激肽(pI 12)在不同HILIC固定相上的保留；色谱柱： 100 x 4.6 mm；1) 两性离子色谱柱；2) 纯硅胶色谱柱。流动相：40/60 (v/v)乙腈/50mM乙酸铵缓冲液，pH 6.5 指导与应用手册 5 版权所有 , 2005-2008 , SeQuant AB 弱离子交换剂( 即纯硅胶和氨基相)也可用做HILIC固定相，但它们的电荷密度与流动相pH值有关，这样，静 电作用会既取决于溶质的离子化也取决于固定相的离子化，使得开发或优化分离

11、条件变得 复杂化。然而非pH依赖性的固定相，如两性离子固定相，流动相的最佳pH值主要由待分析物来决定。 对于某些类别的化合物，如酚 类化合物，提高流动相的pH 值会有利于它们的分离，见图5。这种类型的分离需要使用聚合物基质的两性离子HILIC色谱柱，因为当pH大于7.5时，硅胶的稳定性变差。 图5 pH对龙胆酸、原儿茶酸和异酞酸分离的影响 色谱柱：ZIC-pHILIC 100 x 4.6 mm；流动相：左图-75/25 (v/v) 乙腈/17mM乙酸铵，pH 6.8；右图-75/25 (v/v) 乙腈/17mM碳酸氢铵，pH 9.6 色谱柱的选择 选择合适的色谱柱主要取决于 待分析物的性质，但

12、也需要适当考虑样品的基质。当然，柱子的选择性和保留容量是最重要的参数，另外还有柱效。 分离容量 柱容量是一个非常重要的参数 ，因为它决定着保留时间，也决定着洗脱待分析物所要求的洗脱强度。如果容量过高，需要使用过强的流动相，相反，容量过低，分析的动态范围变小，柱子容易过载。HILIC色谱柱中填料的表面积和固定相结合水的能力都会影响柱容量。对于带电荷的固定相，其电荷密度也会影响柱容量。 待分析物的保留因子k ( 也称为容量因子或表示为k)可以用它通过柱子的相对速度来表示，可用公式1来计算： kA= (tR-t0)t01 式中：tR为溶质的保留时间；t0泵出系统死(空)体积所需的时间。 分离的选择性

13、 柱子的选择性取决于几个因素 ，如填料的基质材料和官能团的化学结构，因此，选择性是基于柱子的本身的特性以及它和待分析物的交互作用为基础的。 选择性因子(分离度)，可度量两个相邻被洗脱的溶质A和B分离的好坏，计算见公式 2。 = kBkA2 式中kA和kB分别为先后 洗脱的两个化合物的保留因子。 分离效率 一个好的色谱柱能用较少的流 动相将某类溶质全都洗脱下来。与大体积的洗脱相比，它的色谱峰会有 较小的峰宽，当然峰也会高一点，分离效果也就更好。为了能够比较不同柱子的柱效，还应考虑峰的保留时间。柱效用理论塔板数来表示，计算公式见： N = 5.54 tRw 23 式中w1/2是峰高一半处峰 的宽度

14、；柱效的决定因素是溶质通过该柱时它与分离材料相互作用的机会的多少，这种相互作用数被称作“塔板数”，它是从蒸馏理论中借用的术语。如果每次溶质只在流动相和固定相表面的滞留水层间达到新的分配平衡，那么传输的距离越短，理论塔板数就越高。 6 HILIC实用指南 http:/ 大的死体积会降低柱效 空体积亦称为死体积，是指从 进样器至检测器间液体的总体积。死体积的大小决定了一个不被填料保留的化合物从进样器到达检测器的时间(t0)。死体积（V空或V0）是柱内与柱外空体积之和： V0=V空V柱V柱外 4色谱柱的死体积（V柱）是柱子多孔填料颗粒内孔洞的总体积和颗粒间体积的总和。对于一个固定尺寸的柱子，其死体积

15、基本是恒定的，而且与填料的粒径无关。峰加宽的重要来源是柱外的死体积(V柱外)，即进样环、管路和检测器的体积。为了将峰加宽减至最小，且不致破坏高质量色谱柱所获的柱效，用减小系统中连接各部件的所有管线内径来减小死体积的效果是很有限的，这样柱反压会增大，并且会造成意外管线堵塞等。 为减小死体积, 所有的连接 管 线应尽可能的短! 还应注意高压泵至进样器间的 体积对峰扩散并不重要，但是如果太大，那么在更换流动相时会花较 长的时间。下表给出了10 cm的不同内径的管线所产生的死体积。 表1 10cm的几种最常用内径管线的体积 管线内径 体积 (mm) (inch) (L) 0.064 0.025 0.3

16、2 0.13 0.05 1.3 0.17 0.07 2.3 0.25 0.10 4.9 0.50 0.20 20 色谱柱的维护 多数的HILIC 柱都是以微粒硅胶为基质制作的，因此不能在高pH 环境下使用。以硅胶为基体的ZIC-HILIC色谱柱的pH适用范围是pH 3-8，而以聚合物为基质的ZIC-pHILIC柱的适宜范围是pH 2-10。 HILIC 柱应在HILIC条件下保存，通常建议保存在有机溶剂和水或低浓度缓冲液的混合溶液中。不同牌号的HILIC柱可能有其他的存放方法，因此在打算长时间存放柱子之前，要仔细阅读说 明书了解具体存放方法。SeQuant公司建议ZIC-HILIC和ZIC-p

17、HILIC色谱柱的贮存和它们的装运条件一样，保存在: 80/20 (v/v) 乙腈/5mM乙酸铵溶液, pH 6.8 色谱柱的再生 当发现HILIC 柱出现分离效率变差（峰加宽）、保留时 间改变和校准曲线偏离等现象时，很可能是 由于固定相上结合了强保留的“脏东西”（色谱柱保留了一些不希望保留的物质），而使 柱容量改变了。如果柱反压升高，常常是因为样品基质中的某些组分形成沉淀，堵塞了色谱柱入口的多孔滤片。 通常可用强缓冲液或盐溶液在 低流速下反向冲洗色谱柱来部分恢复柱子的性能，此时应将柱出口直 接接到废液桶。SeQuant建议用如下步骤来再生和去除沉淀，但是应注意其他厂家可能有不同的建议。 30

18、个柱体积的去离子水 30个柱体积的0.5 M的氯化钠溶液 30个柱体积的去离子水 如不想使用氯化钠也可用同样 浓度的标准缓冲盐来代替，如0.5 M的乙酸铵。 流动相 如前面所述，典型的HILIC 流动相需在水或挥发性缓冲液中含有40-97%的乙腈。为获得请好的分离重现性， 流动相应至少保持3%的水，以确保 固定相颗粒被充分地润湿。此外，记住增加流动相中的有机溶剂,会提高溶质的保留时间。 提高流动相中有机溶剂的比例， 会提高溶质的保留! 指导与应用手册 7 版权所有 , 2005-2008 , SeQuant AB 尽管乙腈是最常用的HILIC 有机溶剂，但其它几种能与水混溶的极性有机溶剂也可用

19、于HILIC分析。这些溶剂 的洗脱强度与RPLC分析中洗脱强度的顺序大体相反，其相对强度如下： 四氢呋喃 丙酮 乙腈 异丙醇 乙醇 甲醇 水 图6是不同有 机溶剂对溶质保留的影响。乙腈是一种弱的HILIC溶剂，与甲醇相比，它能大幅提高溶质保留时间。当然，甲醇也是很有用的，尤其能提高某些化合物的溶解度，只是它赋予的保留能力较差。从分离效率的角度来看，乙腈通常是最佳HILIC溶剂。 图6 流动相中乙腈(实体图标)和甲醇(框形图标)比例对保留因子k的影响 图标：三角为胞核嘧啶，方形为腺嘌呤 色谱柱：ZIC-HILIC (150 x 4.6 mm)；所有流动相均含有10 mM甲酸 在流动相配制过程中，

20、有机溶 剂和缓冲溶液混合后，常常会产生温度变化。在使用前需要让流动相回至室温，特别是在你的色谱系统无温度调节控制装置时更需如此。 缓冲溶液 适用于亲水作用色谱使用的缓 冲盐有乙酸铵或甲酸铵，但也可用甲酸和乙酸，这都是由于它们即使在含有很高有机溶剂的溶液里，也有良好的溶解度。尽管磷酸盐和其他低溶解度的缓冲盐有较高UV 检测灵敏度的特点，但应小心或避免使用，以免产成沉淀而损坏色谱仪器和色谱柱。在需要使用高p H的情况下，可使用氢氧化铵(氨水)和碳酸氢铵。5-20 mM缓冲液可以满足大部分HILIC分析，但依其在流动相中的溶解度，浓度上限可达 200-300 mM。 典型的带有正电荷或负电荷的 固定

21、相要比中性或两性离子的固定相需要更高的缓冲液浓度。要避免使 用三氟乙酸和其他的离子对试剂，因为它们不仅干扰HILIC的分离机制，而且降低质谱的检测信号。多 数硅胶基质的HILIC柱的适宜p H范围为3-8，而聚合物基质的HILIC柱为2-10。 脱气 流动相最好每天脱气，以避免 由泵产生的干扰和降低检测噪音。如果色谱系统无在线脱气装置，可将惰性气体，如氦气，直接通入装有流动相的容器进行脱气。选用氦气原因是由于它在流动相中溶解度很低。 过滤 在使用新配制的流动相前，最好用0.45 m的多孔滤膜过滤。这不仅可以延长色谱柱的寿命，还可避免泵损坏。过滤膜需选用亲水的、基于聚四氟乙烯(polytetra

22、fluoroethylene，PTFE), 聚偏二氟乙烯(polyvinylidendifluoride PVDF)或类似的化学惰性材料。 等度或梯度洗脱 在液相色谱分析中最常用的是 等度洗脱，即在整个运行 中流动相的浓度与组份保持恒定。 亲水作用色谱的梯度洗脱是通 过减小有机溶剂浓度，即增加流动相的极性来实现的，这恰好和反相色谱分离相反。 对于带电荷的HILIC固定相，也可以在梯度淋洗中增加盐或缓冲盐浓度， 从而破坏其与溶质间的静电作用。 梯度洗脱主要用于一次性分离 几个保留因子（容量因子）差异较大的溶质，使它们有较好的分离效率和合适的保留时间。在每次运行梯度洗脱后， 必须用起始流动相充分地

23、平衡HILIC柱子，然后才能进行下一个分析。 8 HILIC实用指南 http:/ 必须强调的是，和RPLC相比，HILIC柱不适合使用变化过快的梯度淋洗和太短的柱平衡时间。这是由于固定相富集水层中的水来源于流动相，这决定了它与流动相的组成有密切关系。同样道理，HILIC梯度洗脱不能从100有机相到10 0的水相。还应提及的是如在梯度洗脱中使用像乙腈那样的低粘度的溶剂，那么柱反压会因流动相粘度的变大而升高。 不要采用100的有机相到100的水相 的HILIC梯度洗脱! HILIC柱平衡不好会导致保留 时间的漂移和重现性变差。然而，在某些情况下，经过较长时间的反复运行快速梯度洗脱程序，可能会达到

24、一种动态平衡和相对稳定的保留时间，但这种情况较难实现和重复。 典型的洗脱方案 为便于大家进一步优化分析及 方法研发，我们列出了以下的初始条件 。它们适合于SeQuant的ZIC-HILIC和ZIC-pHILIC柱，但也可稍做修改后( 如带电荷的固定相需用较高的盐浓度)，用于其他HILIC柱： 等度洗脱：80/20（v/v）乙腈/乙酸铵或甲酸（20mM） 梯度洗脱：以线性梯度模式，在2 0分钟内将乙酸铵缓冲液（20mM ）中乙腈的比例从90%降到40%(斜率大约每分钟3%)，建议两次进样之间的柱平衡时间为10分钟 进样阀 进样阀通过不同体积的进样环 将样品导入分析柱，进样体积一般在1- 100

25、L，具体指南见表2。进样体积过大会引起体积过载，降低柱的分离效率 。极端的体积过载会产生扁平峰，如图7所示。 在导入固定体积样品的情况下 ，用小内径的管路做进样环，可以将峰加宽减至最小。这是因为在一个层流管中，扩散的大小与管长的平方根和管径的平方呈正比。 表2 适合不同内径的分析柱的进样量与流速 柱内径 进样量 流 速 (mm) (L) (mL/min) 7.5 10-150 1.3 4.6 5-50 0.5 2.1 0.5-5 0.1 图7 使用不同进样体积(3、20和 200 L)获得的色谱重叠图 色谱柱：ZIC-HILIC（50 x 4.6 mm，5 m）；样品：用流动相稀释的甲苯、尿嘧

26、啶和胞核嘧啶 图8 进样体积对柱效影响 待分析物（k=1.6）溶于流动相；色谱柱：ZIC-HILIC， 50 x 4.6 mm 指导与应用手册 9 版权所有 , 2005-2008 , SeQuant AB 洗针溶液 色谱系统中用于自动和手动进 样器注射器针管和针头的洗涤溶液是一个常常被忽视的环节。适合HILIC的洗涤液可以是含有95%的有机相的水溶液，或与流动相组份相似，但不含缓冲盐的溶液。如果洗涤液含有过多的水，会使导入样品的极性过高，往往会产生不必要的峰加宽。纯的有机溶剂一般也不适合，因为它的极性不够，不能洗掉亲水性的待分析物。 为确保最大的分离效率，进样 体积应不超过柱总体积的1% 。

27、图8所示，如果进样量超过柱体积的10%，柱效就只剩下原来的20%。 防止污染 避免使用带橡胶盖的进样瓶和 有橡胶衬垫注射器，因为用于HILIC分析的流动相含有很高的有机相，它会从橡胶上溶出一些酸碱性物质而污染样品。为减少交叉污染，还应注意在自动进样器将样品加入进样环时，导入样品的体积通常要大大超过进样环的体积。如手动进样，进样环应用10倍体积的溶液清洗。还有，在将样品溶液 加入进样环时，一般“吸”比“推”的效果更好。 样品的预处理 样品的预处理在很大程度上取 决于样品的基质，即样品中除了待分析的溶质以外的其他物质。对于HILIC分离来说，很重要的特点是样品不是在很亲水的环境下进行的。如果所进样

28、品含有过多的水或另一种很亲水的溶剂，溶质在固定相的分配就会减弱。这样会使保留降低，柱效变差，分离不好，特别是对于不易保留的溶质在使用大进样体积时。因此，样品水溶液不能直接进样，而是用有机溶剂稀释至有机相至少占50%的比例。 不要用水稀释样品 ! 同时建议在进样前要过滤样品 ，建议使用使用的是孔径0.45 m的PTFE或PVDF亲水过滤膜。 固相萃取的互补选择性 可以利用HILIC或RPLC的特异选择性在固相萃取(SPE )柱上有效地净化样品。富集在RPLC-SPE柱上的样品通常要用 高比例的有机溶剂洗脱，因此该洗脱液无须蒸干和再溶解，便可直接注入HILIC色谱柱进行分析。在很多情况下，该溶液有

29、足够的疏水性，可在HILIC柱上产生峰“压缩”，即产生窄而高的峰型。如果在HILIC-SPE柱上净化，而后在RPLC色谱柱上分离， 也会产生同样的效果，因为在HILIC-SPE的洗脱液中含有大量的水，足以在RPLC分离过程中产生峰“压缩”作用。 ZIC-HILIC 和 ZIC -pHILIC SeQuant公司生产几种不同特色的HILIC专利产品，包括ZIC-HILIC和ZIC-pHILIC两性离子固定相，本手册的后半部分将着重给大家提供一些有关这些产品的技术资料和应用实例。 图9 ZIC-HILIC和ZIC-pHILIC两性离子固定相的官能团 以硅胶为基质的ZIC-HILIC固定相带有共价键

30、合的永久 性磺酸甜菜碱型两性离子官能团，见图9。ZIC-HILIC有粒径为3.5、5和10 m的填料，装 在不同尺寸的柱子中。其中毛细管柱的柱材是有玻璃内衬的不锈钢，分析柱的柱材是PEEK (polyetheretherketone)工程塑料和不锈钢，而制备柱则是不锈钢的。聚合物基质的ZIC-pHILIC固定相具有相同的磺酸甜菜碱型两性离子官能团，但只有5 m的聚合物填料。 10 HILIC实用指南 http:/ 图10 蒸发光散射检测器（ELSD）所测得的不同牌号色谱柱的相流失（摘自A lltech公司）。 纵坐标：信号最大值（mV）；横坐标：色谱柱牌号（不同厂家与牌号的柱子） 不管是ZIC

31、-HILIC还是ZIC-pHILIC固定相都是为有效地使用亲水作用色谱来分离酸、碱和中性亲水化合物而设计的。在这些HILIC固定相的设计和生产中，特别注意确保固定相的低流失（见图10）和较长的柱寿命(见图11)。 图11 ZIC-HILIC色谱柱（50 x 4.6 mm）反复注入甲苯(不保留物标志)、尿嘧啶和胞核嘧啶的色谱图 流动相：80/20 乙腈/25 mM乙酸铵, pH 6.8；流速：0.5 mL/min。上图：第1次进样；中图：第501次进样；下图：第 1001次进样。 色谱柱的选择 如图12所示，尽管ZIC-HILIC和ZIC-pHILIC色谱柱填料的基质不同，但它们具有相同的官能性

32、和相似的选择性。 图12 甲苯、尿嘧啶和胞核嘧啶在不同填料的ZIC色谱柱(50 x 2.1 mm)上的分离 上图：ZIC-HILIC，5 m，PEEK； 中图：ZIC-HILIC，3.5 m，不锈钢； 下图：ZIC-pHILIC，5 m，PEEK。 流速 ZIC-HILIC和ZIC-pHILIC色谱柱和RPLC色谱柱的流速特征有些不同。如图13所示，对于4.6 mm内径的柱子来说，最佳流速约0.5 mL/min。 图13 柱效和柱压与流动相流速的相互关系图。样品：用流动相稀释的胞核嘧啶溶液，色谱柱：ZIC-HILIC，5 m填料。 横坐标：流速（mL/min），纵坐标：左-塔板高度（mm），右

33、-柱反压（MPa）。 指导与应用手册 11 版权所有 , 2005-2008 , SeQuant AB 图14 甲苯、尿嘧啶和胞核嘧啶在不同流速下的色谱叠放图 色谱柱：50 x 4.6 mm，5 m填料， ZIC-HILIC柱上分离；流动相：80/20 乙腈/25 mM乙酸铵, pH 6.8；样品：所有溶质均用流动相稀释。 上图：5.0 mL/min; 中图：2.0 mL/min; 下图：0.5 mL/min. 分离规模的可缩放性 分析型分离常常是按比例扩大 到半制备、制备和工业型分离的基础，近年来按比例向下缩小到微升或纳升型的分离也越来越流行。如图15所示，使用ZIC-HILIC的固定相可以

34、很容易从分析型分离线性地扩大到半制备和制备型分离。当然，相应的向下扩展到微型柱和毛细管柱，同样也没有问题。 在制备型工作中，柱子的溶质 负载量是很重要的参数。如图16所示，尽管此例中被选溶质的保留因子很低，但ZIC-HILIC柱仍提供了相当好的负载量。 图15 在50 mm柱长、不同内径柱上的分离 色谱柱：除20mm内径柱用的是10 m填料以外，其它ZIC-HILIC柱用的是5 m填料自上而下：柱内径为20 mm、7.5 mm、4.6 mm和2.1 mm。 图16 烟碱在ZIC-HILIC色谱柱上的负载量 保留因子：k=0.65; 色谱柱： 150 x 20 mm，5 m填料；流动相：90/1

35、0 乙腈/5 mM乙酸铵；流速：18.6 mL/min；进样量：0.5mL(1- 100 mg/mL，溶于流动相的烟碱溶液)。 应用 本手册的最后部分列举了一些ZIC-HILIC和ZIC-pHILIC产品的应用 实例。这些实例的目录见下表。12 HILIC实用指南 http:/ 表3 本手册列举的ZIC-HILIC和ZIC-pHILIC应用实例 应 用 页 码 SPE 血浆中阿莫西林 13 SPE 消解蛋白 14 LC 嘌呤与嘧啶 15 LC 核苷 16 LC 肽 17 LC 胰蛋白酶消解产物 18 LC 脂肪族氨基酸 19 LC 丙烯酰胺 20 LC 胺类化合物 21 LC 脱氢抗坏血酸和抗

36、坏血酸 22 LC 富马酸、草酸和柠檬酸 23 LC 高半胱氨酸、甲基丙二酸和琥珀酸 24 LC 吗啡及其葡糖醛酸代谢物 25 LC 类黄酮 26 指导与应用手册 13 版权所有 , 2005-2008 , SeQuant AB SPE 血浆中的阿莫西林 简单除去干扰待分析物和不易洗脱的物质的方法 图17 经过不同样品处理的空白血浆样品和空白加标样品的反相色谱分离 A: 经乙腈沉淀后的空白血浆；B: 经乙腈沉淀后又经ZIC -HILIC SPE处理的加标血浆；C: 经乙腈沉淀后又经ZIC -HILIC SPE处理的空白血浆 萃取方法 用乙腈沉淀血浆（1.5 mL加到0.1 mL血浆里） 离心，

37、取1mL上清液加载到 100 mg、经乙腈（2mL）预处理的ZIC-HILIC SPE柱上 用乙腈洗涤并稍稍抽干 用400 L水洗脱 摘自: Niklas Lindeg rdh et al. Therapeutic Drug Monitor., 27(2005) 503-508. 实验条件 色谱柱 : Aquasil 反相柱 流动相 : 7/93 (v/v)乙腈/0.1M磷酸盐缓冲液, pH 2.5 流速 : 1.0 mL/min 进样量 : 85 L 检测 : UV，230 nm 14 HILIC实用指南 http:/ SPE 消解蛋白 固相微萃取识别N-糖基化蛋白 图18 胎蛋白经胰蛋白酶

38、消解后所产生的肽在MALDI-TOF(基质辅助激光解析电离-飞行质谱)上得到的质谱图 图标：a)和b)在反相微型柱上保留的肽的质谱图；c)在ZIC -HILIC 微型柱上保留的肽的质谱图；d) 经PNG酶F消解后的脱糖基化肽质谱图 萃取方法 ZIC-HILIC 微型SPE柱(10 m填料) 平衡和样品溶剂：含有0.5%甲酸（FA）的80乙腈水溶液 洗脱液含有0.5%FA的99.5水溶液 反相萃取：平衡和样品溶剂是5%的甲酸，洗脱液为含有5甲酸的70%乙腈水溶液 摘自: Per Hgglund et al. J. Proteome Res., 3 (2004) 556-566. 指导与应用手册

39、15 版权所有 , 2005-2008 , SeQuant AB LC 嘌呤和嘧啶的分离 HNNHOOHNNHOONNNNHNH2NNNNHOH2NHNNHNH2O图19 胸腺嘧啶（1）、尿嘧啶（2）、腺嘌呤（3）、鸟嘌呤（4）和胞核嘧啶（5）的分离 色谱数据 待分析物 保留时间 (min) 保留因子(k) 分离度( ) 死体积 (t0) 3.2 - - 胸腺嘧啶 4.7 0.5 - 尿嘧啶 5.3 0.7 3.9 腺嘌呤 6.5 1.0 6.0 鸟嘌呤 8.4 1.6 5.2 胞核嘧啶 12.9 3.0 5.6 实验条件 色谱柱: ZIC-HILIC 150 x 2.1 mm, 5 m 流动

40、相: 80/20 (v/v) 乙腈/25mM乙酸+2.5mM乙酸铵 流速 : 0.1 mL/min 检测 : UV，254 nm 进样量 : 2 L (样品溶在流动相中) 16 HILIC实用指南 http:/ LC 核苷酸的分离 图20 六种磷酸腺苷的分离 色谱数据 待分析物 保留时间 (min) 保留因子(k) 分离度( ) 死体积 (t0) 2.5 - cAMP 4.3 0.7 - dAMP 6.2 1.5 2.1 AMP 7.2 1.9 1.3 ADP 9.5 2.8 1.5 dATP 10.9 3.4 1.2 ATP 13.3 4.3 1.3 实验条件 色谱柱: ZIC-pHILIC

41、 150 x 4.6 mm, 5 m 流动相: 70/30（v/v）乙腈/ 100mM乙酸铵, pH 8.8 流速 : 0.5 mL/min 检测 : UV，254 nm 进样量 : 5 L (样品溶在流动相中) 样品 : 45 g/mL AMP, cAMP and dAMP 90 g/mL ADP, dATP and ATP 指导与应用手册 17 版权所有 , 2005-2008 , SeQuant AB LC 肽的分离 图21 血管紧缩素、神经降压素、缓激肽和Gly-His-Lys的分离 色谱数据 待分析物 保留时间 (min) 保留因子(k) 分离度( ) 死体积 (t0) 2.0 -

42、- 血管紧缩素 2.7 0.4 - 神经降压素 3.6 0.8 2.2 缓激肽 6.7 2.4 2.9 Gly-His-Lys 13.3 5.7 2.4 实验条件 色谱柱: ZIC-HILIC 100 x 4.6 mm, 5 m 流动相: 50/50（v/v）乙腈/50mM乙酸铵, pH 6.8 流速 : 0.5 mL/min 检测 : UV，254 nm 进样量 : 2 L (样品溶在流动相中) 18 HILIC实用指南 http:/ LC 胰蛋白酶消解产物的分离 4GVGPVKQPVKOG OKP 图22 细胞色素 丙胰蛋白酶消解物的分离 实验条件 色谱柱: ZIC-HILIC 150 x

43、 3.0 mm, 5 m 梯度洗脱：40min 内流动相B液由0线性提高至50流动相 流动相A: 81/19 (v/v) 乙腈/15mM KH2PO4缓冲液, pH 4.5；B: 30/70 (v/v) 乙腈/20mM KH2PO4缓冲液，pH 4.5 流速 : 0.8 mL/min 检测 : UV，214 nm 进样量 : 20 L 样品：溶解在2.5 mL 0.1M碳酸铵缓冲液中的25 mg 细胞色素 丙 胰蛋白酶 消解物用乙腈按1:1比例稀释 指导与应用手册 19 版权所有 , 2005-2008 , SeQuant AB LC 脂肪族氨基酸的分离 0246810Retention Ti

44、me (min)123System peakH2NOHOOHONH2OHONH2图23 亮氨酸（1）、丙氨酸（2）和甘氨酸（3）的分离（系统负峰是由于进样液的缓冲液浓度和其在流动相中的差异造成的） 色谱数据 待分析物 保留时间 (min) 保留因子(k) 分离度( ) 死体积 (t0) 2.7 - - 亮氨酸 4.9 0.8 - 丙氨酸 7.5 1.8 2.2 甘氨酸 8.5 2.1 1.2 实验条件 色谱柱: ZIC-pHILIC 150 x 4.6 mm, 5 m 流动相: 70/30 (v/v) 乙腈/20mM甲酸铵，pH 6.2 流速 : 0.5 mL/min 检测 : UV，206

45、nm 进样量 : 5 L (样品溶在流动相中) 20 HILIC实用指南 http:/ LC 丙稀酰胺的分离 NH2ONH2OOOH图24 甲基丙烯酰胺（1）、丙烯酰胺（2）和甲基丙烯酸（3）的分离 色谱数据 待分析物 保留时间 (min) 保留因子(k) 分离度( ) 死体积 (t0) 1.5 - - 甲基丙烯酰胺 2.2 0.5 - 丙烯酰胺 2.4 0.6 1.3 甲基丙烯酸 2.6 0.8 1.2 实验条件 色谱柱: ZIC-HILIC 150 x 4.6 mm, 5 m 流动相: 95/5 (v/v) 乙腈/50 mM 乙酸 流速 : 1.0 mL/min 检测 : UV，210 n

46、m 进样量 : 5 L (样品溶在流动相中) 指导与应用手册 21 版权所有 , 2005-2008 , SeQuant AB LC 胺类化合物的分离 N+ClN+m/z 122m/z 114图25 矮壮素（1）和缩节胺（2）的分离 色谱数据 待分析物 保留时间 (min) 保留因子(k) 分离度( ) 死体积 (t0) 1.6 - - 矮壮素 3.1 0.9 - 缩节胺 43 1.7 1.8 实验条件 色谱柱: ZIC-HILIC 100 x 2.1 mm, 3.5 m 流动相: 80/20 (v/v) 乙腈/25mM甲酸铵 流速 : 0.2 mL/min 检测 : 正离子电喷雾MS; SI

47、M监测: m/z 114 and 122 进样量 : 20 L (样品溶在流动相中) 数据来源: Dr.-Ing. Ludmila Havlik, Chemisches Labor Dr. Wirts + Partner, Hannover, Germany, www.wirts.de 22 HILIC实用指南 http:/ LC 脱氢抗坏血酸和抗坏血酸的分离 0246810Retention Time (min)HO OHOHOHOOOOHOOHO O图26 脱氢抗坏血酸（1）和抗坏血酸（2）的分离 色谱数据 待分析物 保留时间 (min) 保留因子(k) 分离度( ) 死体积 (t0) 3.0 - - 脱氢抗坏血酸 5.4 0.8 - 抗坏血酸 8.2 1.7 2.2 实验条件 色谱柱: ZIC-HILIC 150 x 4.6 mm, 5 m 流动相: 70/30 (v/v) 乙腈/100 mM 乙酸铵, pH 6.8 流速 : 0.5 mL/min 检测 : UV at 240 nm 进样量 : 5 L (样品溶在流动相中) 指导与应用手册 23 版权所有 , 2005-2008 , SeQuant AB LC 富马酸、草酸和柠檬酸的分离 0246810Retention Time (mi