1、免疫组织化学 在皮肤科中的应用,定义：又称免疫细胞化学。它是组织化学的分支，为确定某一特定物质在组织内的局部定位，使用以目的物作为抗原的特异性抗体进行检测的方法，即免疫组织化学(简称免疫组化)。,免疫组织化学概论 （Immunohistochemistry）,原理,其主要原理是用荧光素、生物素或地高辛 等标记的抗体（或抗原）对细胞或组织内 的相应抗原（或抗体）进行定性、定位或 定量检测，经过组织化学的呈色反应之 后，用显微镜、荧光显微镜或电子显微镜 观察。,免疫组化的技术分类,免疫组化的方法有直接法和间接法： 直接法直接标记特异性抗体； 间接法不直接标记特异性抗体，一般标记免疫球蛋白，将被标记
2、的免疫球蛋白再结合到特异性抗体上。 免疫组化技术常用方法按标记物种类可分为：免疫荧光法、免疫酶法、免疫金属技术、亲和免疫组化技术以及免疫电镜技术等。,常用标记物,荧光素：最常用的是异硫氰酸荧光素（FITC） 荧光显微镜下呈绿色荧光；四乙基罗达明（RB200）荧光显微镜下发橙红色荧光；使用荧光显微镜观察上述荧光标记物（荧光抗体法）。 辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、生物素等：运用普通光学显微镜观察的标记物。 铁蛋白金等：主要应用于免疫电镜。,免疫组化在皮肤病理中的应用,凡是组织细胞内具有抗原性的物质，如肽类、激素、神经递质、细胞因子、受体、表面抗原、病原体等均可用免疫组织化学方法显示。 免疫组化在皮
3、肤病理中的作用主要是鉴别组织类型或细胞来源，在淋巴细胞增生疾病中，免疫组化可在其克隆方面提供信息，有助于判断细胞的良恶性来源。,亲和免疫组织化学技术,70年代以来，免疫组织化学在技术方法上不断改进，涌现了一批新的技术方法，其特点为一些具有双价或多价结合力的物质如植物凝集素（Lectin）、生物素（Biotin）、亲和素（avidin）和葡萄球菌A蛋白（SPA）等被应用于免疫细胞化学技术，从而建立了SPAHRP法、ABC法、BRAB法和LAB法等。,其共同特点是以一种物质对某种组织成分具有高度亲合力为基础，其本质上又非抗原抗体反应。因此，Bayer（1976）首次称之为亲合组织化学。事实上，抗原
4、抗体反应从本质上也属于亲合组织化学这一范畴。 目前，亲合组织化学包括抗原与抗体、植物凝集素和糖类、生物素与抗生物素、葡萄球菌A蛋白与IgG、阳离子与阴离子、激素、维生素、糖及类脂质作用部位和受体等。,亲合细胞化学引入免疫细胞化学后使其敏感性得到进一步提高，因此更有利于微量抗原（或抗体）在细胞或亚细胞水平的定位，从而出尽了免疫组化技术的发展和亲和免疫组化的创立。,亲和素与生物素系统,1、亲和素 是一种碱性糖蛋白，分子量为68000，具有4个同维生素H亲合力极高的结合点。一般从蛋白清中提取，故又称卵白素。 2、维生素H（以下统称生物素） 是一种小分子的维生素，与卵白素之间有极强的亲合力，较之抗体对
5、抗原亲合力要高出100万倍，能彼此牢固结合而不影响彼此的生物学活性。 注：生物素与卵白素都具有与其它示踪物质如荧光素、铁蛋白和过氧化物酶等相结合的能力。利用上述特性，建立了卵白素生物素免疫染色系统，即亲和素生物素免疫染色法。,3、链霉亲和素 是一种从链霉菌培养物中提取的蛋白质，相对分子量60000，且不含糖链。同亲和素一样，具有4个生物素结合位点，亲和力高达10-15mol/L，是一种更完美的生物素结合蛋白。 优点：很少有低聚糖残余成分，可保持中性等电点，避免了组织中的非特异性染色。 借助此特点建立了亲和素链霉免疫染色法。,基本原理,近年来，亲和免疫组化技术不断创新，目前为止拥有标记亲和素-生
6、物素技术（LAB）、桥亲和素-生物素技术（BAB）、亲和素生物素过氧化物酶复合物法（ABC）以及链霉亲和素生物素过氧化物酶复合物法（SP）等。,1LAB法,以生物素标记抗体作第一抗体，过氧化物酶标记亲和素作为第二抗体（见图）：,BAB法,把两者连接起来先用生物素标记的抗体与细胞/组织内的抗原反应，洗去未结合的抗体，加入抗生物素孵育后，洗去未结合的抗生物素，再加入已标记酶的生物素孵育，洗片以细胞化学方法呈色反应（见图）。,ABC法,（1）ABC复合物的制备：,（2）ABC法反应原理,SP或SAP法,即过氧化物酶标记的链霉卵白素或过氧化物酶标记的碱性磷酸酶染色。 反应原理,链霉,SP或SAP法,该
7、法是ABC法基础上的进一步改良，使卵白素与链霉（而非生物素）结合，而后再结合过氧化物酶 。它有4个亚基可与生物素结合，灵敏特异，背景低，成本低。 优点：更简便，放大倍数，等电点中性更适合组织，分子量小，穿透力。,（三）染色步骤（SP法为例）,每份组织均切3m的薄片,于60烤箱烤片6h以上备用。具体步骤如下：,石蜡切片常规脱蜡和水化,热修复,3% H2O2，室温10,滴加非免疫性动物血清，室温10,滴加一抗，室温60min或4过夜,封片，镜下观察，保存,水冲洗，苏木素复染，PBS返蓝,镜下观察控制DAB显色,加链霉-过氧化物酶溶液室温10-30,加生物素-二抗，室温孵育1030,PBS冲洗3次3
8、min,PBS冲洗3次3min 除去PBS液,除去血清,PBS冲洗3次3min 除去PBS液,PBS冲洗3次3min，除去PBS液,PBS冲洗3次3min 除去PBS液,人体常见细胞的免疫组化特性,淋巴细胞 浆细胞 自然杀伤细胞 肥大细胞 组织细胞 皮肤、粘膜、软组织器官 间质细胞 间皮细胞 骨髓 神经来源细胞,淋巴细胞 B 细胞：CD45+;CD20+;CD45RA+ ;CD79a+ T 细胞： CD45+; CD3+; CD45RO+; CD43+; 多数TCR-, 有时TCR-; CD4+ /CD8+; T细胞亚群可表达细胞溶解因子(granzyme B, TIA1, perforin)
9、,人体常见细胞的免疫组化特性,浆细胞 CD138+; CD45-/+; CD20-; CD79a+/-; Ig+; EMA+/- NK 细胞 CD45+; 表面CD3-; 胞浆 CD3+; CD43+; CD45RO+; CD56+; CD57+/-; Granzyme B+; TIA1+; Perforin+,人体常见细胞的免疫组化特性,肥大细胞 CD117+组织细胞 CD45+; S100-; CD68+; CD1a-; lysozyme+; HLA-DR+; CD43+,人体常见细胞的免疫组化特性,皮肤、粘膜、软组织器官 1、上皮CK+ (腺上皮倾向表达低分子量CK，有些上皮可表达特殊C
10、K亚型); vimentin-/+; BerEP4+/-; EMA+/-; E-cadherin+/-,人体常见细胞的免疫组化特性,2、特殊类型上皮细胞 * 表皮：34E12+, CAM5.2-, CK5/6+ 基底层上方：CK1、CK10 基底层：CK5、CK14 * 腺上皮：CEA 可能+ (管腔面); EMA 通常+ ， CK8+,人体常见细胞的免疫组化特性,3、肌上皮CK+; CK14+; 高分子量 CK+; Actin+; calponin+; S100-/+; GFAP-/+; Vimentin+ 4、黑素细胞S100+; Vimentin+; CK-; c-kit+；HMB45-
11、 (交界区黑色素细胞可+);,人体常见细胞的免疫组化特性,5、Merkel细胞：CK+; CK20+; NSE+; synaptophysin+; chromogranin+; neurofilament+ 6、 Langerhans细胞：CD45+; S100+; CD68-/+; CD1a+; lysozyme-/+; HLA-DR+ 7、基底膜：IV型胶原 8、皮脂腺：EMA+;CEA-;低分子量CK（CAM5.2）-；S100-。,人体常见细胞的免疫组化特性,间质细胞 1、纤维母细胞Vimentin+; Actin-; Desmin-; CK- 2、肌纤维母细胞Vimentin+; A
12、ctin+; Desmin-/+; CK-/+ 3、平滑肌Vimentin+; Actin+; Desmin+; CK-/+ 4、树枝状细胞Vimentin+; CD34+; Actin-/+; Desmin-,人体常见细胞的免疫组化特性,5、内皮细胞：第VIII 因子相关抗原+; CD31+; CD34+; Vimentin+ 6、血管周细胞：第VIII 因子相关抗原-; CD31-; CD34-; vimentin+; Actin+; Desmin- 7、脂肪细胞：Vimentin+; S-100+,人体常见细胞的免疫组化特性,8、软骨细胞Vimentin+; S100+; GFAP+/-
13、 9、骨骼肌Vimentin+; Actin+/-; Desmin+; Myoglobin+; MyoD1- (仅原始或胚胎肌细胞+); Myogenin- (仅原始或胚胎肌细胞+); S100-/+ (弱阳性); CD56-/+ (受损肌肉+),人体常见细胞的免疫组化特性,间皮细胞 CK+; CK5/6+; Vimentin+; Calretinin+; HBME1+; N-cadherin+; E-cadherin-; CEA-; BerEP4-; LeuM1-; Desmin -/+ (occasional),人体常见细胞的免疫组化特性,常见皮肤病和性病的IHC标记,肿瘤标记：上皮来源肿
14、瘤、间叶来源肿瘤、造血干细胞来源肿瘤 色素性疾病标记 其他标记：银屑病、扁平苔藓、副银屑病等,常见皮肤肿瘤,表皮肿瘤 黑素细胞痣 恶性黑素瘤 皮肤淋巴增生性疾病及相关肿瘤 皮肤附属器肿瘤 结缔组织肿瘤,表皮肿瘤 基底细胞癌,重要病理改变 a 瘤体由基底样细胞组成，核大，浆少，染色嗜碱， b 周边细胞呈栅栏状排列，肿瘤团块与周围基质间常有裂隙。,基底细胞癌组织类型很多，如结节性、浅表性、色素性、透明细胞性、印戒细胞性、侵袭性、硬化性、角化性、多形性、腺样、异型基底细胞癌、基底鳞状细胞癌、向毛囊分化基底细胞癌、纤维上皮瘤型、向肌上皮、皮脂腺、大汗腺、小汗腺分化基底细胞癌。 IHC标记：CK8、Bc
15、l-2等 鉴别诊断：鳞癌(低分化)、毛发上皮瘤、毛源性肿瘤、毛囊漏斗肿瘤、汗管样小汗腺癌、日光角化病等,右图：BCC表达CK8阳性，CK10阴性,左图：BCC,化生性BCC：梭形细胞表达结合蛋白，示其向平滑肌分化,BCC伴有导管分化：CEA表达阳性,Bowen病（原位鳞状细胞癌） 肿瘤细胞标记如下：泛角蛋白+；EMA+；CAM5.2-；CEA-；S-100-，HMB-45-。 鉴别诊断：浅表性基癌、光化性角化病、Bowen病样丘疹病、Paget病等。,鳞状细胞癌,IHC：CK10、EMA、CAM5.2等 多种亚型：透明细胞SCC、梭形细胞SCC、促结缔组织增生性SCC、棘突松解型SCC、假血管
16、性SCC、腺性SCC、疣状癌、化生性皮肤癌（癌肉瘤）等。 鉴别诊断：日光性角化病以及与各亚型相似的各种疾病等。,高分化CK10阳性,低分化CK10阴性,低分化CK8阴性,黑素细胞痣,分型：皮内痣、交界痣和复合痣。 IHC标记：S-100等。 鉴别诊断：恶性黑素瘤HMB-45、Ki-67和Cyclin D1肿瘤细胞全层阳性表达，而黑素细胞痣只有表浅的痣细胞表达阳性；恶黑表达P53蛋白，而痣阴性。,左：浅层细胞表达HMB-45，深层痣细胞不表达； 中：只有一种或两种痣细胞表达Ki-67； 右：只有少量真皮浅层痣细胞表达CyclinD1 ，注意只有胞核着 色的细胞才是阳性细胞。,左图：晕痣，多数为复
17、合痣，可见色素失禁。 右图：随着痣细胞的调亡，痣细胞越来越难鉴别，而被含色素的巨噬细胞所取代，残余的痣细胞S-100染色阳性可识别。,Spitz痣,又称Spitz瘤、幼年黑素瘤和梭形上皮痣。 IHC鉴别诊断：与恶性黑素瘤鉴别如下,Spitz痣：复合痣随深度增加的成熟现象,Spitz痣：粉红或红棕色圆顶状丘疹或结节,恶性黑素瘤,主要亚型：恶性雀斑样黑素瘤、浅表扩散性恶黑、肢端恶黑和结节性恶黑等。 其它亚型：痣样恶黑、小细胞黑素瘤、Spitz痣样恶黑、印戒细胞黑素瘤、棒状黑素瘤、透明细胞黑素瘤、粘液性黑素瘤、腺样黑素瘤、恶性蓝痣、结缔组织增生性恶黑以及皮肤鳞状恶黑等。,恶性黑素瘤IHC标记,S-1
18、00：特异性较差； HMB-45：有助于与普通痣鉴别。90%-100%原发恶黑和80%-86%转移性恶黑阳性表达，但梭形细胞型恶黑对其敏感性较差，且结缔组织增生性恶黑多为阴性。 Ki-67：有助于鉴别良性痣与恶黑，前者只有不到5%的细胞核阳性，且位置表浅；后者25%的细胞阳性。 Bcl-2：在正常黑素细胞和良性痣、先天性痣、Sptiz痣、蓝痣等多种痣组织都强阳性表达；其表达的降低被认为与恶黑相关。 Cyclin D1：有助于良性痣与痣样恶黑或恶黑中的痣细胞成分鉴别，60%以上的恶黑全层表达，而痣完全没有或只有浅表部位表达。 CD68：约80%以上的恶黑表达阳性，有助于区别恶黑细胞和组织细胞。其
19、它：还有P53、CD40、CD44、角蛋白等。,b：瘤细胞HMB-45阳性，痣细胞阴性。,a：本例肿瘤源于原有的普通痣，瘤细胞呈嗜酸性、形态多样，痣细胞呈嗜碱性、胞体较小。,恶性黑素瘤：本例肿瘤（下方）起源于原有的先天性痣（上方）； a和b：恶性黑素瘤中Ki-67呈显著阳性表达，而痣组织中为阴性。,无色素性恶性黑素瘤：a 瘤细胞形态多样，核分裂像明显。b 可见弥漫的S-100蛋白阳性表达，MART-1也为阳性。,注：在某些罕见的情况下，恶性黑素瘤不表达S-100，这时需要选用至少2种其它恶性黑素瘤标记物进行IHC染色。,巨细胞性恶性黑素瘤：瘤细胞呈HMB-45阳性。,Ki-67 A 痣样恶性黑
20、素瘤全层中表达活跃，可见大量阳性着色的胞核； b 普通皮内痣中只有极少数散在的阳性细胞；,皮肤淋巴增生性疾病 及相关肿瘤,T细胞性淋巴瘤 B细胞性淋巴瘤,皮下脂膜炎样T细胞淋巴瘤（SPTL）,临床表现：典型的为皮下脂肪出现单个或多个肉色到红色或紫色无症状结节、斑块和肿块。皮损可发生在许多部位，但常见于四肢和躯干。 组织病理：典型浸润为细胞从真皮深部网状层扩展到皮下脂肪小叶或间隔，散在分布于真皮乳头层。淋巴细胞往往围绕脂肪细胞排列，形成花边样外观。 IHC特征：淋巴样细胞通常CD45+、CD2+、CD3+、CD43+和CD45RO+.其中的组织细胞表达CD68。,SPTL：皮下脂肪的致密浸润，产
21、生特征性的花边样外观。,SPTL：该患者腿部出现多个溃疡性结节。,SPTL：组织细胞清晰表达CD68。,SPTL：淋巴细胞表达CD3。,皮肤淋巴细胞浸润症,临床表现：皮损可单发，但多发皮疹更多见。病变最常位于面颈、背和上胸部，表现为盘状、红色或淡褐色丘疹或斑块。中央常消退形成环状。 组织病理：真皮浅层和中层血管周围有成熟的淋巴细胞浸润。 IHC特征：主要为T细胞，多为CD4+T淋巴细胞。细胞常表达Leu-8。,中央消退形成环状皮疹。,面额可见多个红色斑块。,左：真皮浅层和中层血管周围有致密慢性炎细胞浸润，形成袖口状外观。浸润的炎细胞几乎全是小淋巴细胞。 右：大多数细胞表达CD4+,弥漫性大B细
22、胞淋巴瘤,临床表现：多见于老年患者的头颈、躯干和四肢，蓝红色或紫红结节。 组织病理：肿瘤从真皮乳头至网状层呈弥漫性浸润，皮下脂肪也常受累。常无向表皮现象，大多境界带清晰。 IHC特征：CD19+、CD20+、CD22+、CD79a+ 和单一形sIg/cIg。50%的表达bcl-2和bcl-6，通常CD5-和CD10-。Ki-67明显表达（50%细胞）。,CD20+,肿瘤紧靠表皮，但无浸润。,Bcl-6+,Bcl-2+,皮肤B细胞假性淋巴瘤,临床表现：与原发性皮肤B细胞淋巴瘤相似。 组织病理：常为浅表性、结节性或局限性，但偶尔可弥漫并累及整个真皮层。 IHC特征：B细胞和T细胞混合组成，有时后者
23、占多数，生发中心在CD21染色下更明显。轻链呈多克隆性。,滤泡结构外围为滤泡树突状细胞群表达CD21。,真皮内致密的淋巴样浸润伴明显的生发中心。,左图：CD20示B细胞； 右图：T细胞层（CD3）包绕B细胞结节。,乳房和乳房外Paget病,组织病理：表皮表现均为角化过度或角化不全，常有棘层肥厚。浸润细胞数量不等，胞体较大，胞质丰富，淡染或嗜酸性，胞核大呈空泡状。细胞单个或成簇分布，偶见腺样分化。 IHC特征：c-erB-2、CK7、CAM5.2、EMA和GCDFP-15为+标记，但阳性程度不一。最近研究，CK7对其诊断特异较差。然而，继发性乳外Paget病肿瘤细胞通常CK7和CK20均+，这一
24、检测是有价值的，因为原发性的肿瘤细胞CK7常为+但CK20-。,左图：乳房外Paget：肿瘤细胞富含嗜酸性胞质，空泡状大胞核，核仁明显。 中图：乳房外Paget：可见腺样分化。 右图：肿瘤细胞表达CAM5.2。,皮肤纤维瘤,又称纤维组织细胞瘤、硬化性血管瘤、皮肤组织细胞瘤、结节性表皮下纤维化等。 临床表现：好发于中年，多发于四肢，表现为小的隆起于皮面的角化过度的皮肤结节。 组织病理：皮损边界不清，位于真皮内或延伸至脂肪浅层。在疏松的胶原样基质内可见成束的细长梭形细胞，呈交织状或席纹状排列。梭形细胞间混有泡沫状组织细胞、多核巨细胞和薄壁血管。典型者病变周围可见由肿瘤细胞所包绕的透明样胶原束。,细
25、胞性纤维组织细胞瘤,IHC特征： Vimentin+; SMA和钙结合蛋白可呈灶状+表达，CD34-/肿瘤的外周灶状+。 鉴别诊断：平滑肌肉瘤，SMA和肌丝蛋白弥漫+表达；隆突性皮肤纤维肉瘤CD34弥漫+表达。,右：可见大量的肿瘤细胞。,左图：细胞性纤维组织细胞瘤：肿瘤较大，有时发生于少见部位。,Vimentin+,SMA+,Kaposi肉瘤,KS：大多HHV-8阳性表达。,KS：梭形细胞弥漫CD34阳性表达，局部CD31 和Actin阳性。,其他疾病,银屑病、扁平苔藓等：真皮浅层浸润的细胞以T淋巴细胞为主，偶见散在B淋巴细胞存在，此类疾病T细胞标记通常阳性，而B细胞阴性。 疱类疾病：如表皮下疱等疾病的鉴别，要依赖于胶原来确定基底膜的位置。,石蜡包埋标本的免疫过氧化物抗原定位鉴别诊断 左图：大疱性类天疱疮IV型胶原定位在疱的底部； 右图：在获得性大疱性表皮松解症，IV型胶原定位在疱的顶部。,谢谢！,
