1、第四章 免疫球蛋白,抗体（Antibody, Ab) 是由B细胞识别抗原后增殖分化为浆细胞所产生的一类能与相应抗原特异性结合，具有免疫功能的球蛋白。免疫球蛋白（Immunoglobulin，Ig)： 具有抗体活性或化学结构与抗体相似的球蛋白。分泌型：存在于体液中，具有抗体的各种功能膜型：B细胞膜上的抗原受体Ab=Ig,IgAb；Ab是功能描述，Ig是化学结构描述；,第一节 基本概念,第二节 免疫球蛋白的结构,一 、Ig的基本结构,（一）、重链和轻链Ig的两条长链称为重链（Heavy chain, H链）,含 450-550aa，分子量为50-75kD。重链可分为、链Ig的两条短链称为轻链（Li
2、ght chain, L链）含214aa，分子量为25kD。可分为和型。,IgM IgG IgA IgD IgE,（二）可变区和恒定区 .可变区：重链和轻链靠近N端的约110个氨基酸的序列变化很大，称为可变区（variable region,V区）； VH和VL 。 2.恒定区：靠近C端的其余氨基酸序列相对稳定，称为恒定区(constant region, C区)；CH（CH1、CH2、CH3和CH4 ）和CL.,高变区（hypervariable region，HVR）：氨基酸组成和排列顺序特别易变化VH或VL各3个高变区：HVR1、HVR2和HVR3 骨架区（framework regio
3、n,FR）高变区之外的区域。VH和VL各有四个骨架区，FR1、FR2、FR3和FR4表示。,互补性决定区（complementarity-determining region，CDR）： VH和VL的3个高变区共同组成Ig的抗原结合部位，故高变区又被称为互补性决定区。,（三）免疫球蛋白的功能区 1定义：Ig的H链、L链每 隔110个氨基酸由链内二硫 键接构成一个能行使特定 功能的球形结构，称为Ig 的功能区。 L链功能区：2个，（VL，CL各一个） H链功能区：IgG，IgA，IgD，4个（V区1个，C区3个）, IgM，IgE，5个（V区1个，C区4个） 铰链区：位于CH1、CH2之间。,V
4、区,C区,VL+VH区： 抗原结合部位（2个）,CH3区：是Ig与多种细胞Fc受体结合的部位.,CL和CH 区：具有同种异型抗体的遗传标记。（2个）,CH2区：IgG的补体结合点和通过胎盘的部位,2.功能区的作用,铰链区：赋予弹性和伸展性.,二、Ig的其他结构 （一）连接链（J链）：富含半胱氨酸得多肽链由浆细胞合成的一种糖蛋白。IgA和IgM含有J链可稳定Ig多聚体的成份 （二）分泌片是分泌型IgA(sIgA）的一个辅助成分，为一种糖肽，由粘膜上皮细胞合成和分泌。介导IgA二聚体的转运保护sIgA的铰链区免受蛋白酶的水解破坏,J 链,分泌片,sIgA,三 Ig的酶解片断,1.木瓜蛋白酶2个Fa
5、b 段：结合抗原1个Fc段：结合细胞2.胃蛋白酶 F(ab)段:双价抗体活性 pFc段：无生物学活性,第三节免疫球蛋白的生物学活性,11.特异性结合抗原,清除病原微生物 ；2.激活补体（IgG、IgM）；,3与多种细胞表面Fc受体结合； （1）调理作用（opsonization)：IgG、IgM 指抗体促进吞噬细胞吞噬细菌等颗粒性抗原的作用。（2）抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity,ADCC)：IgG、IgA、IgE 指表达Fc受体的细胞（ NK细胞、吞噬细胞)通过与抗体Fc段结合直接杀伤被抗体包被的靶细胞
6、。（3）I型超敏反应：IgE 与肥大细胞、嗜碱性粒细胞Fc受体结合，促使其合成和释放生物活性物质。,四、穿过胎盘IgG所独有，是婴儿获得天然被动免疫的主要原因，主要借助胎盘滋养层细胞表面的FcR进行的。五、免疫调节,第三节 五类Ig的主要特性,一、IgG （一） 特性 1、存在形式：单体，占血清Ig总量的3/4。 2、合成时期：婴儿出生后三个月开始合成。 3、半衰期：23天，是所有抗体中半衰期最长的。 （二） 生物活性 1、是主要的抗感染抗体2、是补体经典激活途径参与者。 3、是唯一可以穿过胎盘的抗体 4、具有调理作用和介导ADCC效应的功能。,四种亚类的IgG分子在血清中的浓度不同，所发挥的
7、生物学特性亦不相同。,二、IgM （一）特性 1、存在形式：五聚体，占血清Ig总量的10%，是分子量最大抗体。 mIgM 是 BCR 2、合成时期：胎儿晚期已能合成，最早合成和初次免疫应答中最早出现的抗体。 3、半衰期：5天， （三） 生物活性 1、具有强大的调理、激活补体及杀菌作用 。 3、不能介导ADCC效应。 4、ABO血型天然抗体。,三、IgA （一） 特性： 1、存在形式：单体（血清型）和双体（分泌型）；其中分泌型主要分布于呼吸道、消化道及初乳等分泌液中。 2、合成时期：婴儿在出生46个月才能合成IgA。 （二） 生物活性 1、是机体局部粘膜防御感染的重要因素（分泌型IgA）。 2、
8、具有中和毒素作用（血清型IgA）。 3、辅助婴儿抵抗呼吸道、消化道感染（初乳中含分泌型IgA）,四、IgD （一） 特性 1、存在形式：单聚体，仅占血清Ig总量的1%。 2、合成时期：较晚。3.半衰期：3天 （二） 生物活性 1、成熟B细胞的重要表面标志。 2、血清中IgD的功能尚不清楚。,五、IgE （一） 特性 1、存在形式：单聚体，仅占血清Ig总量的0.002%。 2、合成时期：最晚合成的抗体。 （三） 生物活性 1、引发型过敏反应。 2、抗寄生虫的主要抗体。,第四节Ig的基因及抗体的多样性,一、Ig的基因结构 1.Ig轻链基因结构 （1）Ig 型轻链基因：V、J、C 小鼠：350 5
9、1人：100 5 1 （2）Ig型轻链基因：V、J、C 小鼠：2 4 4人：2 6 6,2. Ig重链的基因结构V、D、J、C 小鼠：300-1000 20 4 8 人： 75-250 30 6 11,二、Ig基因重排 由于Ig基因成簇存在，编码完整的功能性Ig多肽链必须通过基因重排。,重链胚系基因,重链基因重排,初始RNA转录,mRNA,新合成多肽,轻链基因的重排、RNA处理 和蛋白质表达的过程,(二)抗体多样性机制:1.组合多样性：Ig基因库中众多V、D、J、C基因家族成员极端多样性的排列组合； 2.连接多样性：基因重排过程中可出现不同的连接点；3.体细胞突变：已成熟的B细胞受抗原刺激后，
10、在发育过程中重排基因所发生的突变。 4. L链H链相互随机配对。,小鼠Ig多样性（举例）,第五节 抗体的应用 免疫学检测,免疫学检测是以特异性抗原-抗体反应为基础的检测方法。 具有很高的灵敏度和能快速提供检测结果等优点。,抗原抗体反应的特点 特异性 抗原抗体反应的可见性 适当的比例和浓度 可逆性,应 用,1、利用已知抗原检测未知抗体,（1）检测病原微生物的相应抗体以辅助诊断疾病： 伤寒病、流行性乙型脑炎、AIDS病等。 （2）检测自身抗体诊断自身免疫病：SLE、类风湿性关节炎等。,2、利用已知抗体检测未知抗原,（1）鉴定病原菌：诊断疾病 （2）检测肿瘤相关抗原：检测甲胎蛋白以诊断肝癌 （3）检
11、测血型抗原、HLA抗原：鉴定血型，亲子鉴定 （4）检测药物半抗原;,抗原或抗体的检测方法,凝集反应 沉淀反应 免疫标记技术,（一）凝集反应（agglutination）,颗粒性抗原（红细胞、细菌等）与抗体特异性结合，形成肉眼可见的凝集块。,1 、直接凝集(direct agglutination)玻片凝集、试管凝集,细菌的鉴定和血型的检查,一、 传统免疫分析,2、间接凝集（indirect agglutination）可溶性抗原包被在乳胶颗粒或红细胞表面，与相应 抗体混合出现的凝集现象。,检测病原体可溶性抗原，病原体感染后产生的抗体,（二）沉淀反应（precipitation）,可溶性抗原（免
12、疫球蛋白、细胞裂解物、组织浸液等）与相应抗体结合， 形成不溶性免疫复合物，出现不透明的沉淀物。多在半固体琼脂凝胶上进行，形成白色的沉淀。,免疫比浊法,1、单向免疫扩散（single immunodiffusion）：可溶性抗原在含相应抗体的琼脂凝胶中进行的扩散，为一种半定量试验。,环的直径与抗原含量成正相关,2、双向免疫扩散（doule immunodiffusion）： 抗原与抗体在琼脂板中相互扩散而形成一定类型的沉淀线的方法。常用于抗原或抗体的定性检测、组成和两种抗原相关性分析。,一致,部分一致,不一致，有多种成分,3、免疫电泳（immunoelectrophoresis）,常用于血清蛋白
13、种类分析，以观察Ig的异常增多或缺失。,1）简易免疫电泳 先将抗原样品在琼脂中进行电泳分离，可将蛋白质抗原分子分成不同的区带，然后将抗血清加入琼脂板横槽中，使二者进行双向扩散，当比例合适时即形成特异性的沉淀线，,2）对流免疫电泳(counter immunoelectrophoresis, CIEP) 是将双向免疫扩散与电泳相结合的一种技术,3）火箭免疫电泳(rocket immunoelectrophoresis)，抗原在电场下通过含有一定量抗体的琼脂凝胶，并于抗体发生反应，形成沉淀带。可定量分析。,用标记物标记抗体或抗原进行抗原抗体反应借以提高免疫学诊断的敏感性,荧光素 ：异硫氰酸荧光素（
14、黄绿色荧光）、藻红蛋白、 罗丹明（红色荧光）,放射性同位素： 125I、131I,酶：辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶,免疫荧光检测法（IFA）,放射免疫检测法（RIA）,酶免疫检测法（EIA）,二、现代免疫分析-免疫标记技术,1抗体制备。 多克隆抗体 单克隆抗体，2标记物与标记方法。放射性同位素、酶、荧光分子、化学和生物发光系统。,免疫分析基本环节,3分析方式设计： 非竞争方式、竞争方式； 直接法、间接法； 标记抗原、标记抗体； 均相、非均相 4.信号检测。 与相应的标记物对应。主要为分光光度法、 荧光光度法、化学发光检测法。,（一）、放射免疫分析 (Radioimmunoassay RIA)利用
15、放射性同位素的测量方法与免疫反应基本原理相结合的一种同位素分析技术。 特点：灵敏度高、特异性强、样品用量少、标记物容易制备以及放射性强度容易检测,1.放射免疫分析必需的基本试剂：抗体：作为标记药物和非标记药物竞争结合的蛋白。 标记药物：提供可检测的信号(响应值)（放射性）。 非标记药物：在标准曲线制备时是药物标准品，在样品中则为被测药物 分离剂分离结合与游离部分,结合相,游离相,2.基本原理：RIA是标记抗原和未标记抗原对有限量抗体的竞争性结合。,标记药物(S*)+抗体(Ab) 标记药物-抗体复合物(S*-Ab)F* P-B* B*F*、B*分别是游离的和与抗体结合的标记药物浓度，它们可通过产
16、生的信号(如放射性、光吸收、荧光发射)强度反映出来(用仪器检测)。,非标记药物（S）F+ 标记药物(S*)+抗体(Ab) 标记药物-抗体复合物(S*-Ab)F* P-B-B* B*非标记药物-抗体复合物(S-Ab)B 随着S的加入，它对S*同Ab的结合则起竞争抑制作用，表现为使B*减少、使F*增加，并且只要S加入一定量，便有对应的F*和B*信号强度值，因此可建立S量(浓度)与响应值(F*和B*的信号强度)之间的函数关系，作成剂量反应曲线。,免疫分析中各种竞争结合抑制曲线示意图,3.标准曲线的绘制与样品测定步骤,取标准抗原，用无放射活性的空白血清或血浆稀释成58个系列浓度。 加入定量标记抗原，其
17、总放射性(T)应能满足准确测量的需要。 加入定量的已稀释好的特异抗体，其抗体的量应满足灵敏度的要求。 将标准抗原、标记抗原、特异抗体与缓冲液混匀后，在适当条件下温育，待反应平衡后测定总计数率(T)。,加入分离剂，使结合部分(B)与游离部分(F)分离。 测定各管结合部分或游离部分的计数率。 标准曲线通常以标准抗原(待测药物标准品)的浓度为横坐标，以结合率(B)为纵坐标作图。纵坐标B的计算：将与抗体结合的标记药物的放射性强度(B)与加入的标记药物总放射性强度(T)比较，即B=(BT)100；,例：125IRIA(DCC沉淀法)测定血清中地高辛浓度,待测血清样品50l样品管中;含不同浓度地高辛标准品
18、的血清50l标准曲线各管中;50l 空白人血清零标准管.各管中依次加入保温液100l抗体溶液100l125I标记的地高辛(溶液)100l摇匀在室温(1525)放置30min-计数器测定各管的总计数T(即加人的协I总放射性剂量)在电磁搅拌(或手摇)下，迅速向各管内加人1ml工作液(全部加完控制在5min内)，摇匀离心10min(3000r/min)倾去上清液-计数器测定各管中沉淀的计数F(游离协I地高辛放射性强度)计算出标准曲线各管和样品各管的结合率。,（二）酶免疫分析（enzyme immunoassay）标记物为酶，酶本身并不能直接产生信号，必须要有其他试剂如底物、辅酶等的参与才能完成酶反应
19、，从而引起吸收光谱等的变化供测定。常用的酶为： 辣根过氧化物酶、碱性磷酸酯酶、6-磷酸葡萄糖脱氢酶、-半乳糖苷酶。,1. 均相酶免疫分析，EMIT法（enzyme multipled immunoassay technique）基本原理：酶标药物与未标记药物互相竞争有限量的抗体(Ab)，测定小分子抗原。酶标抗原(AgE)同抗体(Ab)结合后，所形成的酶标抗原一抗体结合物(AgEAb)可使酶的活性发生改变(增强或减弱)；可直接通过测定酶活性的变化，求出样品含量的方法。,2.酶联吸附免疫分析（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA） 属于非均相免疫分析的代表
20、，普遍应用于各领域。 基本原理：是将过量抗体（抗原）包被于载体上，通过抗原抗体反应使酶标记抗体（抗原）也结合在载体上，经洗涤去除游离的酶标记抗体（抗原）后，加入底物显色，定性或定量分析有色产物确定待测物的存在与含量的检测技术。,1）双抗体夹心法方法：用已知抗体包被，加入待检样品，再加酶标抗体，加底物显色应用：二价或二价以上的较大分子抗原测定如乙型肝炎表面抗原、甲胎蛋白、HCG等,获得待分析物的未标定抗体,将特异性抗体与固相 载体连接形成固相抗体,洗涤除去未结合的 抗体及杂质,加入封闭蛋白溶液以封闭载体 表面残留的蛋白结合位点,洗涤并除去未结合的封闭蛋白,加受检标本（抗原）形成 固相抗体抗原复合
21、物,洗涤除去其他 未结合的物质,加酶标抗体生成 抗体待测抗原酶标记抗体 的复合物,彻底洗涤 未结合的酶标抗体,加底物进行 酶催化反应,根据颜色反应的 程度进行该抗原 的定性或定量测定,2）间接法 方法：利用酶标记的抗抗体以检测已与固相上抗原结合的受检抗体 应用：常用于HCV抗体、HIV抗体和梅毒螺旋体抗体等的测定,包被,反应 加入待测抗体或 抗原和酶标抗原 或抗体,1,2,3）竞争法 方法：用已知抗体包被，加入待测血清，再加酶标抗原，酶标抗原与待检物竞争与包被物结合。加底物显色。 应用：用于只有一个抗原决定簇的小分子半抗原（药物、激素等）,ELISA试剂盒,（三）胶体金免疫快速检测法,1.双抗体夹心法-大分子抗原,
