1、28Suzuki t, Ikeda K, Koyama N,et al.Inhibition of human parainfluenza virus type 1 sialidase by analogs of Neu5Ac2en. Glycoconj J, 2001, 18(4):331-337.29Hayakawa T, Satta Y, Gagneux P, et alAlu-mediated inactivation of the human CMP - Nacetylneuraminic acid hydroxylase gene. Proc Natl Acad Sc, i 200
2、1, SA 98: 11399-11404.30Konoshin Onodera. Sialic acid and related substances. AgrBiolChem, 1966, 30(11):1170-1172.31HartG J, BethellR C. 2,3-Didehydro-2, 4-dideoxy-4-guanidino-N-acetyl-Dneuraminic acid (4-guanidino-Neu5Ac-2en) is a slow-binding inhibitorof sialidase from influenzaA and influenza B v
3、irus. Biochemistry and Molecular BiologyInternationa, 1995, 36:695-703.Research Progress of Biological Activity of Sialic Acid and Its Application WEI Dong-xu1,2，JIANG Lian-zhou1，WANG Chen1，WANG Zhong-jiang1(1College of Food science, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China; 2Heilongj
4、iang Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau, Harbin 150001, China)Abstract: The source of sialic acid and its purification methods, testing methods, biological activity and application in food, medicine and other aspects were reviewed and its future development was discussed.Keywords: sialic ac
5、id；biological activity；testing method；applic ation progress糖尿病性视网膜病变(diabetic retinopathy， DR)是糖尿病的主要慢性并发症之一，也是常见的视网膜血管病，其发病机制尚不十分明了。细胞凋亡 在DR发生发展中的作用已逐渐受到大家的重视。姬松茸（ Agaricus blazei Murill） ，为蘑菇科蘑菇属真菌，其蛋白质和糖类含量非常丰富，姬松茸多糖作为其主要有效成分，具有增强机体免疫力、抗肿瘤、抗病毒、降血糖等作用1-2。本实验对姬松茸多糖对糖尿病大鼠视网膜病变的保护作用及其机制进行了初步研究，为临床应用姬
6、松茸多糖治疗糖尿病视网膜病变提供理论及实验依据。基金项目：黑龙江省教育厅科学技术研究项目（编号：11511427）。作者简介：杨旭东（1974 ），男，河北省秦皇岛人，硕士，研究方向为药物的药理与毒理。姬松茸多糖对糖尿病大鼠视网膜细胞凋亡的影响杨旭东，张 杰，崔荣军（牡丹江医学院，黑龙江牡丹江 157011）摘 要： 目的：探讨姬松茸多糖对糖尿病大鼠视网膜病变的保护作用及其作用机制。方法： 将Wistar大鼠随机分为5组，A：正常对照组；B：模型组；C：8姬松茸多糖组；D：4姬松茸多糖组；E：2姬松茸多糖组。8周后，琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡， RT-PCR观察Bax 基因、Survivin
7、基因的表达。结果：与模型组比较，姬松茸多糖组视网膜细胞凋亡明显减少，Survivin表达上调，Bax表达降低。结论：姬松茸多糖对糖尿病大鼠视网膜组织保护作用的机制可能与抑制视网膜组织细胞凋亡及上调Survivin基因，降低Bax基因表达有关。 关键词： 姬松茸多糖；细胞凋亡；Bax基因；Survivin基因；糖尿病视网膜病变中国食物与营养 2011,17(7):68-70Food and Nutrition in China1 实验材料1.1 实验动物健康Wistar大鼠雌雄各半，体重200-220g。 1.2 主要试剂Trizol、 DEPC（美国Gibco公司） ， RT-PCR试剂盒（大
8、连宝生物有限公司） ，链脲佐菌素（美国 Sigma 公司） 。2 实验方法2.1 大鼠模型的制备、分组 随机选取大鼠50只，其中40只，给与高热量饮食8周后，尾静脉一次性注射STZ注射剂15mg/kg。剩余10只，给与基础饲料8周后，注射相同体积的柠檬酸钠-柠檬酸缓冲液。注射2d后，内眦静脉丛采血，以11.1mmol/LFBG 33.3mmol/L且伴有糖耐量减退者为大鼠模型成功标准。 将造模成功的大鼠随机分为4组：B组：模型对照组、C组：8姬松茸多糖组、D组：4姬松茸多糖组、E组：2 姬松茸多糖组。继续高脂高糖饮食12周。A组：正常对照组（喂饲基础饲料的10只） 。2.2 给药方法皮下注射姬
9、松茸多糖灭菌溶液0.15mL/只。2.3 检测方法2.3.1 DNA ladder检测视网膜组织细胞凋亡取冻存视网膜组织磨成粉末，加50L细胞裂解液， 37水浴过夜后，室温下以12 000 r/min离心5min，取上清移。用等体积的酚氯仿异戊醇混合液（体积比25241）和氯仿各抽提1次。在上清液中加入1/10体积3mol/L的醋酸钠和2倍体积的冷乙醇，-20沉淀过夜， 4 12 000r/min离心10min，弃上清。晾干，加20LTE缓冲液，1LRNA酶，37下放置1h，加4L样品缓冲液， 1.8的琼脂糖凝胶，电压2V/cm，电泳12 h。2.3.2 RT-PCR测定视网膜组织Surviv
10、in、Bax mRNA表达Survivin引物，上游：5 -TTGGCAGGTGCCTGTTGA AT-3；下游：5-AGCCAGTCCCCCACAGCAT-3 ，扩增片段 329bp。 Bax引物，上游：5 -GTTTCATCCAGGATCGAGC-3 ； 下 游：5-GGAAGTCCAATGTCCAGC-3 ，扩增片段 345bp。-actin上游引物：5-TTGCCTCTCAGACAATGCCTG-3；下游引物：5 -TCGCTCCTGG AAGATGGTGAT-3 ，扩增片段 280bp。反应条件为：95预变性2min，9445s，55退火1min，72延伸1min， 35个循环， 7
11、2 复性5min。经凝胶成像系统分析，得出Survivin、Bax mRNA的相对表达量。附图 各组DNA ladder情况2.4 统计学分析计量数据以均数标准差（Xs）表示，数据用SPSS 11.0软件包处理，多组间数据比较采用方差分析。3 结果与分析3.1 各组大鼠的一般情况及症状比较正常对照组大鼠精神状态良好，体重逐渐增加，饮食、饮水量正常。模型组大鼠一般状况较差，体毛无光泽，脱毛，反应迟钝，精神萎靡。造模3d即出现多饮、多食、多尿。姬松茸多糖各组大鼠精神状况、体重增长介于正常对照组和模型组之间，亦表现 “三多一少”症状，后期经药物治疗症状明显缓解。3.2 各组视网膜组织细胞凋亡情况细胞
12、发生凋亡后，电泳出现“梯状”图谱（ladder） ，与 Marker相比，ladder中条带的bp数为180-200bp的整倍数。正常对照组： DNA电泳后只出现一条距加样孔很近的大分子条带，电泳无 ladder出现，所以发生凋亡的细胞数非常少。糖尿病模型组：DNA电泳后 ladder颜色较深，发生凋亡细胞数明显增多。姬松茸多糖高、中剂量组：只出现一条距加样孔很近的大分子条带，电泳无ladder出现，发生凋亡的细胞数减少。姬松茸多糖低剂量组：出现较短的ladder，发生凋亡细胞数增多（附图） 。Marker A组 B组 C组 D组 E组 3.3 各组大鼠视网膜组织Bax、Survivin表达与
13、模型组比较，姬松茸多糖各组大鼠视网膜组织Bax基因mRNA 表达降低， Survivin基因mRNA表达增加（P0.01） （附表） 。附表 各组大鼠视网膜组织Bax，Survivin mRNA表达的情况（ xs）组别 n Bax /-Actin Survivin /-ActinA 10 0.120.01 0.560.05B 10 0.580.04* 0.280.02*C 10 0.240.02*# 0.420.04*#D 10 0.390.03*# 0.350.03*#E 10 0.460.03*# 0.310.02*#注：*与正常对照组比较，P0.01；#与模型组比较，P0.0169第7期
14、 杨旭东等：姬松茸多糖对糖尿病大鼠视网膜细胞凋亡的影响4 讨论糖尿病视网膜病变是糖尿病最主要的并发症之一，已有研究表明，细胞凋亡与糖尿病视网膜病变密切相关。细胞凋亡是指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序的死亡。细胞凋亡与细胞坏死不同，细胞凋亡不是一件被动的过程，而是主动过程，它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等的作用。 Bcl基因家族是重要的凋亡调控基因，包括抑凋亡基因Bcl-2、 Bcl-xl和促凋亡基因如Bax、Bak、 Bcl-xs等3。Bax在多种细胞凋亡调控中发挥重要作用。 Bax的促凋亡作用是通过与自身形 成Bax/Bax 同源二聚体的形式发挥的，Bax促进细胞凋亡的机
15、制可能是与增高 Caspase-3活性有关，Bax是Caspase-3活化的重要调节因子4。 Survivin基因作为凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis protein， IAP）家族的成员5，对细胞凋亡和细胞周期的基因调控具有重要的作用， Survivin与效应细胞死亡蛋白酶Caspase-3和Caspase-7结合，抑制它们的活性和细胞凋亡，是迄今发现最强的凋亡抑制因子6。实验结果表明：姬松茸多糖具有抑制糖尿病大鼠视网膜组织细胞凋亡的作用。姬松茸多糖能上调Survivin基因表达，并下调Bax基因表达。综上所述，姬松茸多糖延缓和阻止糖尿病视网膜组织的损害，其作Eff
16、ect of Agaricus blazei murill Polysaccharide on Apoptosis in Retina Cell of Diabetic RatsYANG Xu-dong, ZHANG Jie, CUI Rong-jun(Mudanjiang Medical College, Mudanjiang 157011, China)Abstract: 【Objective】 To investigate the effect and mechanism of Agaricus blazei Murill（ABM） polysaccharide on retina ti
17、ssue of diabetic rats and its mechanism. 【Method】 Wistar rats were randomly divided into 5 groups including diabetic model group, diabetic model treated with 8ABM, 4ABM,2ABM and normal control group. After 8 weeks, the number of apoptotic cells was detected by electrophoresis and the expression of B
18、ax and Survivin gene was confirmed by RT-PCR. 【Result】 Compared with diabetic model group, the number of apoptotic cells in retina tissue decreased and ABM could effectively decrease the level of gene Bax expression and improve the level of gene Survivin expression. 【Conclusion】 ABM polysaccharide h
19、ad protective effect on retina tissue of diabetic rats. The mechanism of protective effect of ABM polysaccharide on retina tissue was probably related to decreasing apoptosis and regulating Bax, Survivin gene expression.Keywords： Agaricus blazei murill polysaccharide；cell apoptosis；Bax gene；Survivin
20、 gene；diabetic r etinopathy用机制可能是通过调控Survivin、 Bax基因的表达而抑制视网膜组织的细胞凋亡。参考文献 1Mizuno M et a1. Minato K, Ito H, et al. Antitumor polysaccharide from the mycelium of liquid-cultured Agaricus blazei Murill. Biochemistry and molecular Biology International, 1999, 47(4) :707-714.2李师鹏，安利国. 真菌多糖免疫活性的研究进展. 菌物系
21、统，2001, 20(4):581-587.3Nicholson DW, Thomberry NA. Apoptosis: Life and death decision. Science, 2003, 299(5604):214-215. 4Cregan SP, Maclautin J G, Craig CG, et a1Bax-depentent caspase-3 activation is a key determinant in p53-induced apoptosis in neurons. J Neurosci, 1999, 19(18):7860-7869. 5Ducken
22、CS, Li F, Wang Y, et a1. Human IAP-like protein regulates programmed cell death Downstream of Bcl-xl and cytochrome c. Mol Cell Biol, 1998, 18(1):608-615.6Carlsson G, Boxhammer S, Garwicz D, et al. Survivin expression in the bone marrow of patients with severe congenital neutropenia. Leukemia, 2009, 23(3):622-62570 中国食物与营养 第17卷
