1、J Diagn Concepts Pract 2010, Vol.9, No.6耶氏肺孢子菌 （Pneumocystis jeroveci, Pj）感染人 体 后 ， 可 导 致 肺 孢 子 菌 肺 炎 (Pneumocystispneumonia, PcP)。 长期以来 ，人们将肺孢子菌误认为原虫 ， 将导致人体肺孢子菌肺炎的病原体称为“卡氏肺孢子虫 （Pneumocystis carinii）”, 并由此将其引发的肺部疾患称 “ 卡 氏 肺 孢 子 虫 肺 炎 ”（Pnuemocystis carinii pneumonia，PcP） 或肺孢子虫病 （Pneumocystosis）。 然而
2、 ，自 20 世纪 80 年代起 ，越来越多的分子生物学证据表明 ，以往认为的 “肺孢子虫 ”实为真菌 ，导致人体肺部炎症的病原体也不是“卡氏肺孢子虫 “而是耶氏肺孢子菌 ，原先认为寄生于人体的 “卡氏肺孢子虫 ”仅寄生于大鼠1。致病机制及临床表现肺孢子菌是一种机会病原体 ，由其引发的肺孢子菌肺炎多见于免疫功能低下或免疫缺陷人群 。 自1984 年发现首例艾滋病以来 ， 其发病率呈急剧增加的趋势 ，另外 ，随着肿瘤化疗患者 、长期接受免疫抑制剂治疗的器官移植受者 、自身免疫性疾病患者的增加 ，Pj 感染高危人群的数量也随之增加 。 资料表明 ，PcP 已是艾滋病患者最主要的并发症和致死原因2。
3、 肺孢子菌的发育包括滋养型 （trophic form）和包囊 （cyst）2 个阶段 （见图 1），成熟的包囊内含有8 个囊内小体 。 成熟包囊为感染阶段 ，经空气或飞沫传播 ，进入肺脏后定居于肺泡并粘附于肺泡上皮细胞表面3。肺孢子菌侵入肺脏后主要定居于肺泡 ，一般在 型肺泡上皮细胞表面 （在大鼠动物模型有时可侵入上皮细胞内 ）粘附和增殖造成炎性反应 ，肺泡腔内出现大量泡沫状渗出物 ，内含组织细胞 、淋巴细胞和浆细胞以及积聚成簇的滋养型和包囊 。 大量的菌体和渗出物如果阻塞肺泡和细支气管则可造成肺换气功能障 ，严重时可导致呼吸衰竭而死亡3-4。病理检查肉眼可见肺组织变硬 ， 重量增加 ，表面
4、呈棕红色或灰褐色 ，有不规则结节 。 胸膜增厚 ，有时出现皮下或纵隔气肿 。 肺切面可见小叶间脓肿 ，肺泡结构不清和泡沫样渗出物 ；显微镜下可见间质内有浆细胞 、淋巴细胞 、巨噬细胞和嗜酸粒细胞浸润 ，肺泡上皮增生脱落 ，肺泡腔内含成堆滋养型和包囊及其崩解物 。患者的临床表现多不典型 ，以干咳 、少痰为起病的主要临床特征 ， 体温正常或低热 （少数可达 3839），之后出现胸痛 、紫绀和呼吸困难 。体格检查 ，肺部的体征往往十分轻微或呈阴性 ， 与严重的临床症状完全不相符合 , 最终患者可因呼吸衰竭而死亡 。PcP 的早期诊断十分困难 ，造成这种现象的原因是由于本病的临床症状 、 体征 、X
5、线胸片及常规实验室检查均缺乏特异性 。 此外 ，肺孢子菌肺炎与一般细菌性肺炎不同 ，患者虽然咳嗽 ，但痰量极少 ,因此即使采用诱痰法 ,痰液标本肺孢子菌的检出率仍然很低5。 以往曾有人用检测抗体的免疫学诊断方法 ，但因健康人群抗体流行率可高达 5060%，故检测抗体的诊断意义不大 。 肺组织活检因创伤较大而难以实行等 。 病原学检查和基因检测 2 类方法有助于本病的诊断6-8。病原学检查从患者痰液或支气管肺泡灌洗液中 ，检出肺孢子菌的滋养型或包囊是诊断本病的直接证据 。图 1 支气管肺泡灌洗液中的肺孢子菌包囊 （姬姆萨染色 ）3专家论坛 肺孢子菌肺炎的病原检查和基因检测卢思奇（首都医科大学 病
6、原生物学系 ，北京 100069）关键词 ：耶氏肺孢子菌 ； 肺孢子菌肺炎 ； 病原检查 ； 基因检测中图分类号 ：R519 文献标识码 ：A 文章编号 ：1671-2870（2010）06-0552-03552 诊 断学理论与实践 2010 年第 9 卷第 6 期一 、染色镜检1. 痰液检查 ： 留取患者 24 h 痰液或用喷雾吸入法刺激咳嗽 ，诱导患者咳出较多痰量 。 咳后的痰尾液内菌体数量较多 ，应注意留取 。 获取的标本可用 NaOH 处理后离心取沉渣染色镜检 。 染色方法有姬姆萨法 （见图 2）、亚甲胺蓝法和六亚甲基四胺银染色法 （GMS)9。 后者是目前公认的一种确认肺孢子菌的染色
7、方法 ， 染色后在油镜下观察包囊呈圆形 、椭圆形或月牙形 ，囊壁染成棕色或黑褐色 。 若囊内小体逸出 ，空囊形成的括弧样结构 （见图 3），是确定肺孢子菌包囊的典型特征 ， 有重要的诊断价值 。 痰液检查的检出率为 52%55%。2. 支气管肺泡灌洗液检查 ： 如果患者情况允许 ，可采用支气管肺泡灌洗法采取样本 。 将纤维支气管镜经气管插入右肺中叶支气管内 ，反复注入生理盐水 （总量 100 mL），获得灌洗液 （约 4050 mL），用消化剂消化后离心沉淀 ， 取沉淀物用 GMS 染色后镜检 ，在阳性标本内可见被染成黑色的肺孢子菌包囊 （见图 4）。 本法检出率可达 75%左右 。二 、基因
8、诊断对于上述病原检测方法显示为阴性的可疑患者 ，可选用基因检测的方法 。 待检标本主要为痰液或支气管肺泡灌洗液 ，其次为鼻咽吸取物 。 一般采用酚 /氯仿法从上述标本内抽提模板 DNA， 检测方法以聚合酶链反应 （PCR) 最为理想 。 可供选择的靶基因有肺孢子菌的内转录间隙 rRNA 基因 、18SrRNA 基因 、5S rRNA 基因 、线粒体大亚基 rRNA 基因 （mt LSU rDNA）、二氢叶酸合成酶基因 、主要表面糖蛋白 (MSG) 基因和胸苷酸合成酶等基因 。 但较常用于临床诊断的是线粒体大亚基 rRNA 基因 ，以该基因序列设计的引物 （见表 1）特异度和灵敏度均很好11-1
9、2，其巢式 PCR 检测的阳性率可达 95%100%。 在痰液标本中至少可以检测出痰液标本中0.6 pg 的肺孢子菌 DNA，检测灵敏度显著高于 GMS染色 ，因此更适于临床筛查和疗效考核 ，对轻度感染和亚临床患者更有价值 。 待检标本主要为痰液或支气管肺泡灌洗液 ，其次为鼻咽吸取物 。 一般采用酚 /氯仿法从上述标本内抽提模板 DNA。实验室用根据肺孢子菌线粒体大亚基 rRNA基因序列设计的引物11-12对来源于小鼠和人体肺孢子菌的模板 DNA 进行检测 , 其灵敏度的检测结果见图 513。M：标准 DNA；1：未经稀释的肺孢子菌 DNA；28 依次为 ：11110-6稀释的菌体 DNA(阳
10、性片段的长度为 346 bp)图 5 单一 PCR 检测肺孢子菌线粒体大亚基 rRNA 基因注 ：其中外引物用于单一 PCR 扩增 ，内引物 1 用于小鼠源菌体的扩增 ，内引物 2 用于人源菌体的扩增引物 序列 （53）外引物 GGGAATTCGTGTACGTTGCAAAGTACTCGGGAATTCGATGGCTGTTTCCAAGCCCA内引物 1 GATGGCTGTTTCCAAGCCCAATAAGGTAGATAGTCGAAAG内引物 2 GGGAATTCGTGAAATACAAATCGGACTAGGGGGAATTCTCACTTAATATTAATTGGGGAGC表 1 用于扩增肺孢子菌线粒体大亚
11、基rRNA 基因的 PCR 引物多个呈圆形的肺孢子菌包囊 ，其中以箭头指示者最为明显 ，囊内的8 个囊内小体隐约可见图 2 痰液涂片中的肺孢子菌10包囊壁呈括弧样结构图 3 PcP 患者痰涂片中的肺孢子菌包囊 (GMS 染色 )图 4 支气管肺泡灌洗液中的肺孢子菌包囊 （GMS 染色 ）553 J Diagn Concepts Pract 2010, Vol.9, No.6可疑 PcP 患者的诊断程序可疑 PcP 患者的诊断程序 （见图 6）来自美国旧金山总医院14，供临床医师诊断时参考 。 该程序虽未涉及基因诊断方法 ，笔者建议在实际执行中 ，可取支气管肺泡灌洗液病原体检查阴性的样本 ，提取
12、 DNA进行 PCR 扩增 ，可能得到阳性结果 。PcP 严重威胁免疫功能受损人群的健康 ，是造成艾滋病患者死亡的重要原因之一 。 早期诊断 、及时治疗是防止病情发展的重要措施 。 然而 ，目前国内外均缺乏理想的诊断技术和方法 ，只有采取病原学检查和分子生物学检测相结合的综合诊断技术 ，才可能获得相对满意的结果 。 对于痰液和支气管肺泡灌洗液涂片染色检查呈现阴性的病例 ，特异性基因扩增是惟一可靠的诊断措施 。 新近报道表明 ，实时 PCR（real-time PCR）对于肺孢子菌检测的灵敏度和阳性预测值均远远高于传统的 PCR15。参考文献 1 Edman JC, Kovacs JA, Mas
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